圓鈴1號棗多酚的提取及抗氧化活性分析

張硯壘，高琳，付亞玲，楊燕敏，張仁堂

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東 泰安 271018）

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的具有多元酚結(jié)構(gòu)的次生代謝物[1]。谷類、豆類、水果、茶、蔬菜、巧克力是人們獲取多酚的主要膳食來源[2]。由于多酚化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在芳香族環(huán)和羥基，是一種天然的抗氧化劑，能夠保護植物免受氧化脅迫傷害[3]。許多研究已表明植物多酚擁有多種有益生物活性，例如抗炎、保護心臟、平喘、抗癌、抗菌、調(diào)節(jié)腸道菌群等[4-7]。由于天然抗氧化劑能改善自由基引起的氧化損傷，且比合成抗氧化劑更安全，因此植物多酚受到了人們廣泛的關(guān)注[8]。

棗（Zizyphus jujuba）原產(chǎn)于中國，距今已有4 000多年的歷史，廣泛分布于亞洲、歐洲和美洲，是一種極佳的健康食品[9]。中醫(yī)認(rèn)為棗具有緩解心悸、失眠、貧血、脾虛腹瀉、食欲不振、肝毒性、發(fā)熱等功效[10]。CHENG等[11]研究發(fā)現(xiàn)棗皮多酚可以預(yù)防異氧所致大鼠心肌缺血和鋁致氧化損傷。張兆英等[12]比較了不同方法提取金絲小棗多酚，發(fā)現(xiàn)快速溶劑萃取法提取率高于有機溶劑浸提法且用時更少。FU等[13]對62種水果抗氧化活性的研究表明，紅棗富含酚類物質(zhì)，可改善自由基引起的疾病，是一種極佳的天然抗氧化食品。圓鈴1號是山東省果樹研究所20世紀(jì)90年代從圓鈴大棗中選出的優(yōu)良品系，有產(chǎn)量高、不裂果、耐儲藏的特點[14]。但目前加工利用率較低，以制干為主。為充分利用紅棗資源，進一步提高其經(jīng)濟價值。本試驗以圓鈴1號棗為試驗材料，優(yōu)化其多酚的提取工藝，并測定酚酸組成、評價其體外抗氧化能力。旨在提高圓鈴1號棗的經(jīng)濟價值，并為開發(fā)安全、高效的多酚抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

棗：圓鈴1號，采摘于山東德州樂陵百棗園，選取新鮮無損傷的圓鈴1號除去果核，切片凍干，粉碎，過40目篩，收集樣品置于-18℃冰柜密封備用。

1.1.2 試劑

DPPH：上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；水溶性維生素 E（Trolox）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）：上海麥克林生化科技有限公司；ABTS：合肥博美生物科技有限公司；（+）-兒茶素、綠原酸、咖啡酸、香豆素、蘆丁、肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；福林酚：Solarbio公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：天津市百世化工有限公司，以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司；LC-20A液相色譜儀、InertSustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：日本島津公司；754N紫外可見分光光度計：上海奧普勒儀器有限公司；KQ2200DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TG16臺式高速離心機：英泰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多酚含量測定

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用福林-酚比色法[15]測定多酚含量。精確稱取10 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇溶解定容至50 mL容量瓶中，制得200 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 10 mL 具塞比色管中，加入0.5 mL福林-酚試劑（1∶2體積比稀釋），振蕩均勻，在 3 min～6 min內(nèi)，加入 2.5 mL 10%的Na2CO3，用雙蒸水定容，在黑暗處反應(yīng)60 min后，檢測波長765 nm。求得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=9.552 9X+0.023 9，相關(guān)系數(shù) r=0.998 1。

1.3.1.2 多酚含量測定

精密稱取1.000 g凍干的圓鈴1號棗粉末在50 mL具塞離心管中，在不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度和料液比下進行超聲輔助提取，離心，殘渣重提一次，合并2次提取液，用雙蒸水定容至100 mL容量瓶中。吸取0.5 mL多酚樣液于10 mL具塞比色管中，加入 0.5 mL福林-酚試劑（1∶2體積比稀釋），振蕩均勻，在 3 min～6 min內(nèi)，加入 2.5 mL 10%的 Na2CO3，用雙蒸水定容，在黑暗處反應(yīng)60 min后，以空白對照作為參比液。并由公式（1）計算多酚提取量。

式中：m1為多酚含量，mg；V1為定容體積，mL；V2為吸取樣液體積，mL；m0為棗粉質(zhì)量，g。

1.3.2 多酚的提取工藝優(yōu)化

固定其它條件，分別考察單因素：乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比[1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24（g/mL）]、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、提取時間（10、20、30、40、50 min）對圓鈴 1 號棗多酚提取量的影響。并根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，設(shè)計四因素三水平正交試驗對提取條件進一步優(yōu)化，如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and their coded levels used for orthogonal array design

1.3.3 粗多酚的制備

稱取35 g凍干棗粉，按正交分析法優(yōu)化的最佳提取工藝條件進行超聲輔助提取，離心，提取兩次，合并2次提取液，55℃濃縮提取液，凍干（-70℃，36 h）得到粗多酚樣品，粉碎，-18℃冰柜密封保存。

1.3.4 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定單體酚酸

色譜條件：InerSustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相組成：5%甲醇（0.1%三氟乙酸）（A）和甲醇（B）；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長280 nm；洗脫方式：梯度洗脫，詳見表2。

表2 梯度洗脫Table 2 Gradient elution

1.3.5 體外抗氧化試驗

1.3.5.1 DPPH·清除能力測定

在比色管中分別加入0.2 mL多酚樣品溶液、5.0 mL DPPH乙醇（0.1 mmol/L）溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），振蕩均勻，室溫（25℃）條件下暗反應(yīng)30 min。用雙蒸水作參比，檢測波長517 nm，測定吸光度值[16]，由公式（2）計算DPPH·的清除率。并以水溶性維生素E含量為橫坐標(biāo)，DPPH·的清除率為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=3.315 1X-0.015 7，R2=0.998 1。

式中：A0為空白吸光度；A1為樣品與DPPH溶液的吸光度；A2為樣品吸光度。

1.3.5.2 ABTS+·清除能力測定

將7 mmol/L ABTS溶液、2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液按一定比例混合，于25℃下暗處反應(yīng)13 h～18 h形成ABTS+·儲備液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。測定前，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇稀釋ABTS溶液，檢測波長734 nm，當(dāng)吸光度為0.700±0.020，即為ABTS測定液。在具塞比色管中依次加入多酚樣品溶液0.2 mL、ABTS測定液5.0 mL，振蕩均勻。暗反應(yīng)8 min，用雙蒸水作對照，檢測波長734 nm，測定吸光度值[17]。由公式（3）計算 ABTS+·的清除率，并以水溶性維生素E含量為橫坐標(biāo)，ABTS+·的清除率為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=7.770 1X-0.006 4，R2=0.999 3。

式中：A0為空白吸光度；A1為樣品和ABTS溶液的吸光度。

1.3.5.3 亞鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定

在具塞比色管中依次加入多酚樣品溶液0.6 mL、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，振蕩均勻后，在45℃水浴18 min。冷卻后加入2.5 mL的10%三氯乙酸，搖勻離心，吸取2.5 mL上清液于另一具塞比色管中，依次加入2.5mL雙蒸水、0.5 mL 0.1%三氯化鐵，振蕩均勻，反應(yīng)8min，檢測波長700nm，測定吸光度值[18]。并以水溶性維生素E含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=1.2591X+0.017，R2=0.996 6。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

單因素試驗結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間和提取溫度對多酚提取量的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction，solid to liquid ratio，extraction time and extraction temperature on extration rate of ployphenols

由圖1A可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，多酚提取量也隨之增大。當(dāng)用60%的乙醇提取時，多酚提取量最高，為10.47 mg/g。隨后繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，多酚提取量逐漸降低。這是因為水相比例較高時，水溶性的多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)增多，不利于多酚類物質(zhì)的溶出。乙醇比例較高時，會使色素等脂溶性成分大量溶出，阻礙了多酚的溶出，且高濃度的乙醇更容易揮發(fā)[19-20]。因此乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為最佳水平。

由圖 1B 可知，料液比為 1∶8（g/mL）～1∶16（g/mL）時，隨著溶劑體積的增大，多酚提取量呈上升趨勢，這是因為隨著溶劑的增多提高了傳質(zhì)推動力，使得多酚較多地溶出[21]。但在 1∶16（g/mL）之后，多酚提取量基本保持不變，表明此時多酚物質(zhì)已不再浸出。因而，本著節(jié)約成本的原則，選擇料液比為1∶16（g/mL）作為最佳水平。

由圖1C可知，提取時間為10 min～30 min時，隨著提取時間的增加，多酚提取量也隨之增大，且30 min時，多酚提取量達到最大值。提取時間超過30 min，多酚提取量反而略微降低。這可能是由于提取時間過長，導(dǎo)致部分多酚被分解或過程中發(fā)生了氧化分解。選擇提取30 min作為最佳提取時間。

由圖1D可知，提取溫度為40℃～60℃時，隨著提取溫度的上升，多酚的提取量快速增大。這是由于升高溫度，增加了溶質(zhì)中各組分的擴散速率，使得多酚類物質(zhì)更容易從溶質(zhì)中浸出。當(dāng)溫度升高到60℃時達到最大值。繼續(xù)升高溫度多酚提取量有明顯下降，這可能是一部分多酚在較高溫度下被分解[20]，因次，選擇60℃作為最佳提取溫度。

2.2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design with experimental results

表4 正交試驗方差分析Table 4 Analysis of variance of the extraction efficiency of polyphenols with various extraction conditions

由表3可以看出，各因素對多酚提取量的影響順序為：B＞C＞D＞A，且最佳工藝條件為 A2B2C1D2，即料液比為 1∶16（g/mL），提取溫度為 60 ℃，提取時間 20 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，方差分析表明，B（料液比）、C（提取時間）兩個因素對多酚提取量有極顯著影響，D（提取溫度）對多酚提取量有顯著影響，A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）對多酚提取量的影響不顯著。

2.3 最佳提取工藝驗證試驗

精確稱取3份1.000 g棗粉，按照優(yōu)化的最佳提取工藝條件，即提取溫度60℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比 1∶16（g/mL）、提取時間 20 min，平行測定 3 次。結(jié)果表明，在此提取工藝下多酚提取量高于正交試驗的9個組合，平均提取量為（10.69±0.078）mg/g。表明此工藝條件下圓鈴1號棗多酚提取量高、重復(fù)性好。

2.4 酚酸測定結(jié)果

為進一步探究圓鈴1號棗中多酚的組分，本研究通過高效液相色譜法對樣品中的6種單體酚酸進行定性和定量分析，結(jié)果如圖2和表5所示。

圖2 多酚樣品中6種酚酸和標(biāo)準(zhǔn)品混合液的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of the 6 phenolic acid from polyphenols and the reference substance

表5 6種單體酚的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 5 Retention time and standard curve of six monomer phenols

通過圖2A與圖2B中各標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時間對比，共分析鑒定出6種酚酸：（+）-兒茶素、綠原酸、咖啡酸、香豆素、蘆丁、肉桂酸，其含量分別為（13.66 ± 0.62）、（2.11 ± 0.13）、（4.05 ± 0.16）、（0.3 ± 0.03）、（17.09±0.48）、（0.1±0.01）mg/100 g DW。目前，很多研究表明這些單體酚能夠預(yù)防和治療很多由氧化應(yīng)激引起的相關(guān)疾病，例如（+）-兒茶素、咖啡酸有較為廣泛的抗菌[22-23]、抗病毒活性[24-25]等。蘆丁能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)化生成槲皮素，從而抑制脂肪細(xì)胞分化，起到緩解肥胖的作用[26]。因此，棗多酚作為一種天然優(yōu)質(zhì)抗氧化劑，具有重要的研究開發(fā)價值。

2.5 體外抗氧化活性測定結(jié)果

為進一步探討圓鈴1號棗多酚物質(zhì)與抗氧化活性的關(guān)系，研究了其多酚提取物對DPPH·和ABTS+·的清除能力，結(jié)果見圖3。每克多酚提取物的抗氧化活性相當(dāng)于多少毫克Trolox，結(jié)果見表6。

圖3 不同濃度棗多酚提取物和Trolox對DPPH·和ABTS+·清除率測定結(jié)果Fig.3 The DPPH·and ABTS+·scavenging activities of polyphenols extracts of different concentration from jujube and Trolox

表6 圓鈴1號棗多酚提取物體外抗氧化活性測定Table 6 Antioxidant activities in vitro of polyphenols extracts from Yuanling 1

如圖3A所示，棗多酚提取物對DPPH·和ABTS+·均有較強的清除效果，且在相同濃度下對ABTS+·的清除能力要明顯高于DPPH·。結(jié)果表明棗多酚提取物質(zhì)量濃度為16.0 mg/mL時對DPPH·已有較高的清除能力，此時清除率達到（85.4±0.8）%，繼續(xù)提高多酚質(zhì)量濃度，清除率基本保持不變；棗多酚提取物質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL時，已有較高的ABTS+·清除率，為（97.3±2.33）%。

由表6可以看出，棗多酚提取物的亞鐵離子還原能力為（32.89 ± 2.17）mg Trolox/g，且對 ABTS+·的清除活性要高于DPPH·。

3 結(jié)論

圓鈴1號棗多酚最佳提取條件：料液比1∶16（g/mL），提取溫度60℃，提取時間20 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，此時多酚提取量最高，為（10.69±0.078）mg/g。通過高效液相色譜共鑒定出6種酚酸：蘆丁、香豆素、咖啡酸、肉桂酸、（+）-兒茶素、綠原酸，其中蘆丁含量最高為（17.09±0.48）mg/100 g DW。多酚提取物的 DPPH·和ABTS+·清除能力、FRAP 還原力分別為（17.96±0.95）、（27.79± 3.06）、（32.89± 2.17）mg Trolox/g，可以作為優(yōu)良的天然抗氧化物質(zhì)。研究結(jié)果為圓鈴1號棗多酚在食品及營養(yǎng)保健領(lǐng)域的應(yīng)用提供了良好的理論依據(jù)。