血小板源性 miR-126 的功能基因多態(tài)性與急性冠狀動脈綜合征患者氯吡格雷抗血小板反應性及療效的相關性

鄒宇婷,王觀筠，劉軍，，3，王子乾，吳陽勛，孫志軍，秦留安，尹彤*

(1解放軍醫(yī)學院,北京 100853；2解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心心血管內科,北京 100853；3解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學中心老年醫(yī)學研究所, 北京 100853)

急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)是嚴重危害人類健康的常見心血管疾病之一，盡管過去10年ACS的死亡率已大大降低，且冠心病的年死亡率下降了34.4%，但經歷復發(fā)事件的患者死亡風險仍較高[1]。血小板P2Y12受體拮抗劑聯(lián)合阿司匹林雙聯(lián)抗血小板治療(dual antiplatelet therapy,DAPT)仍是目前公認的ACS標準治療和預防經皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention,PCI)術后支架內血栓形成的金標準[2]。氯吡格雷作為一種P2Y12受體拮抗劑，可以單獨使用或與阿司匹林聯(lián)合使用以預防缺血性事件并改善ACS患者預后，并已在全球范圍內廣泛使用了10多年[3]。盡管氯吡格雷抗血小板治療在許多患者中是安全有效的，但個體間的治療反應存在很大差異[4]。研究證實，造成P2Y12受體拮抗劑抗血小板反應性的個體差異因素包括疾病狀態(tài)，合并用藥和藥物劑量[5,6]，以及藥物基因組學因素(CYP2C19基因多態(tài)性)[7]。然而，已知的這些因素尚不足以解釋血小板反應性的個體差異。

研究顯示，血小板的活性受到許多微小核糖核酸(microribonucleic acid,miRNA)的影響，這些miRNA調控血小板內信使RNA(messenger ribonucleic acid， mRNA)的表達[8]。Kaudewitz等[9]研究發(fā)現(xiàn)，血漿中微小核糖核酸-126(microribonucleic acid-126，miR-126)與ACS患者的血小板功能及正常人群中血小板活化標記物具有相關性。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，血小板源性miR-126能夠預測氯吡格雷的抗血小板反應性[10]。功能分析證實，miR-126的功能單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP；dbSNP：rs4636297)，能夠阻斷miR-126的加工成熟，從而抑制miR-126的表達[11]。因此，我們推測miR-126的功能SNPrs4636297可能影響氯吡格雷抗血小板反應性和療效。鑒于此，本研究旨在分析miR-126的功能基因多態(tài)性rs4636297與ACS患者中氯吡格雷抗血小板反應性及療效的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

連續(xù)募集2015年11月至2017年2月在解放軍總醫(yī)院心血管內科住院期間接受DAPT，同時在氯吡格雷治療第3天進行血小板功能檢測的ACS患者，對所有患者均進行血小板功能檢測。入選標準：(1)年齡≥18歲；(2)按照美國心臟聯(lián)合會/美國心臟病學會診斷標準[12]診斷為ACS的患者；(3)服用氯吡格雷及阿司匹林治療；(4)自愿參加本次臨床試驗并簽署知情同意書。排除標準：(1)應用影響血小板活性或功能的藥物(如非甾體類抗炎藥、阿片類藥物等)的患者；(2)患有影響血小板功能或活性的疾病(如急、慢性炎癥,肝、腎功能障礙,近期有出血傾向,潛在出血危險或血液系統(tǒng)疾病)的患者；(3)禁用抗血小板藥物的患者。

ACS患者中氯吡格雷的治療原則為：對于PCI或者急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的患者，接受氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林雙聯(lián)抗血小板負荷劑量治療(氯吡格雷600 mg/d和阿司匹林300 mg/d)后，進行穩(wěn)定治療劑量(氯吡格雷75 mg/d和阿司匹林100 mg/d)的治療；對于非PCI或非AMI的患者，接受氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林的穩(wěn)定劑量雙聯(lián)抗血小板治療。本研究符合赫爾辛基宣言，并通過了解放軍總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的論證和批準。

1.2 血小板功能檢測及分組方法

采集ACS患者3 ml外周全血, 通過血栓彈力圖(thromboelastography，TEG)檢測血小板反應性。TEG檢測采用樂普科技有限公司的西芬斯TEG分析儀及配套試劑。根據二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)誘導的血小板纖維蛋白凝塊強度指標(ADP-induced platelet-fibrin clot strength，MAADP)和ADP誘導的血小板抑制率(ADP抑制率)，進行抗血小板反應性呈極端值的病例篩選。

極端值的病例篩查分組標準：TEG MAADP>47 mm, ADP 抑制率<30%的患者入血小板反應性呈極端高反應性(high on-treatment platelet reactivity,HTPR)為HTPR組；TEG MAADP<31 mm, ADP 抑制率>90%的患者入血小板反應性呈極端低反應性(low on-treatment platelet reactivity，LTPR)為LTPR組。

1.3 全血DNA的SNP分型

采用全血基因組 DNA 提取系統(tǒng)(Solarbio, D1850)提取DNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用SnapShot法[13]檢測候選SNP位點，通過多重聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增，檢測miR-126(rs4636297)、CYP2C19*2 (rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)3個SNPs位點。檢測位點的引物序列分別為：rs4636297上游5’ACACTTCAAACTCGTACCGTGAG3’，下游 5’CACGCTGAGGGAGGTCAA3’；rs4244285上游5’ GAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTT3’，下游5’ CGATTCTTGGTGTTCTTTTACTTTCTC 3’； rs4986893上游5’ TCAGCAATTTCTTAACTTGATGGA 3’，下游5’ TTC-AGGGCTTGGTCAATATAGA 3’。測序采用美國ABI公司的3730XL基因測序儀、SnapShot試劑盒及配套試劑，PCR采用北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司的東勝龍黑金剛EDC-810 PCR儀及配套試劑。

1.4 缺血終點事件及隨訪

缺血終點事件包括心源性死亡、非致死性心肌梗死、非致死性腦卒中、緊急血運重建及支架內血栓形成。隨訪時間1年，由專人負責，詳細記錄患者主要缺血事件發(fā)生的癥狀,統(tǒng)一填寫隨訪表格。上述隨訪均由專門經過培訓的醫(yī)師在門診或經電話隨訪完成，缺血終點事件的判斷由臨床藥物試驗中心終點事件判斷專家組確定。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 患者臨床基線資料及SNP分布

連續(xù)募集了1 134例符合入選標準的ACS患者。根據TEG檢測篩查獲得的HTPR組患者193例和LTPR組患者171例。入選患者中，男女比例為2.5∶1(男性 260例，女性104例)，平均年齡(64.87±10.73)歲。2組患者總膽固醇和ACS分型的水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2組患者年齡、性別、體質量指數(shù)、血壓、病史、合并用藥及實驗室檢驗等基線資料均無明顯差異(表1)。

表1 2組患者的基線資料比較

本研究共選擇3個基因位點進行SNP檢測，分別為miR-126 rs4636297,CYP2C19*2(rs4244285), CYP2C19*3(rs4986893)。在364例患者中，miR-126 rs4636297 AG等位基因攜帶者104例(28.57%)，AA等位基因攜帶者8例(2.20%)，miR-126 rs4636297最小A等位基因頻率為16.48%；CYP2C19*2(rs4244285) AG等位基因攜帶者139例(38.19%)，AA等位基因攜帶者45例(12.36%)，CYP2C19*2(rs4244285)最小A等位基因頻率為31.46%；CYP2C19*3(rs4986893) AG等位基因攜帶者36例(9.89%)，未發(fā)現(xiàn)AA等位基因攜帶者，CYP2C19*3(rs4986893)最小A等位基因頻率為4.95%。

2.2 與氯吡格雷抗血小板反應性的相關性分析

通過校正性別、年齡、高脂血癥、高血壓、糖尿病多種因素后證實，CYP2C19功能缺失性等位基因是氯吡格雷抗血小板反應性的獨立影響因素(P<0.05)；miR-126 rs4636297 A等位基因也是氯吡格雷抗血小板反應性降低的獨立影響因素(P<0.05；表2)。

2.3 與臨床終點事件的相關性分析

通過校正年齡、性別、CYP2C19功能缺失性等位基因、高血壓、糖尿病及高脂血癥等因素后，CYP2C19功能缺失性等位基因主要缺血事件的發(fā)生風險2組患者無明顯差異；而rs4636297 A等位基因是1年內口服氯吡格雷患者發(fā)生主要缺血終點事件的獨立危險因素 (P<0.05；表3)。

表3 logistic 回歸分析各基因分型與缺血終點事件關系

3 討 論

血小板表面的P2Y12受體在血小板活化以及血栓的生長和穩(wěn)定中起著核心作用[14]，P2Y12受體拮抗劑是ACS抗栓治療的一線用藥。P2Y12受體拮抗劑氯吡格雷抗血小板反應性具有個體差異，已知的臨床環(huán)境和藥物基因組學因素并不足以解釋P2Y12受體拮抗劑抗血小板反應性差異。已有研究證實，多種miRNA的表達可能與血小板反應性相關[15, 16]，其中miR-126-3p在巨核細胞中的過表達被證實與血小板活化水平升高有關[17]，且被證實能夠通過抑制P2Y12受體的表達參與血小板功能的調節(jié)[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-126的功能單核苷酸多態(tài)性rs4636297能夠通過阻斷miR-126的加工成熟，抑制miR-126的表達，進而可能影響血小板反應性[11]。本研究在此基礎上進一步證實，rs4636297 A等位基因能夠獨立于已知的藥物基因因素(CYP2C19功能缺失性等位基因)和臨床環(huán)境因素，與高血小板反應性密切相關，并且還是經氯吡格雷抗血小板治療的ACS患者1年內主要缺血終點事件發(fā)生的獨立危險因素。鑒于此，我們認為rs4636297可能成為評估ACS患者抗血小板治療反應性和預后的生物標志物。

既往有研究顯示，血小板miR-126能夠作為生物標志物預測PCI術后患者心血管不良事件的發(fā)生[18]，miR-126也有可能參與預測患者發(fā)生心肌梗死[19]。本研究進一步證實了miR-126的表達水平還可能通過影響抗血小板藥物的反應性影響ACS患者的臨床轉歸。后續(xù)通過對miR-126 rs4636297深入的生物功能機制分析可能進一步證實，干預血小板源性 miR-126的表達是否能夠影響P2Y12受體拮抗劑的抗血小板反應性,進而成為抗血小板治療的新靶點。

本研究有一定的局限性。本研究為單中心觀察性研究，納入病例數(shù)較少，且難以排除其他與ACS患者臨床轉歸相關的影響因素。此外，本研究僅僅入選了接受氯吡格雷抗血小板治療的ACS患者，因此尚難以明確miR-126 rs4636297對其他P2Y12受體拮抗劑(如替格瑞洛等)抗血小板反應性的影響。未來可通過開展多中心大樣本真實世界的臨床研究，以及深入的功能機制分析，進一步證實miR-126 rs4636297對抗血小板藥物個體化選擇和應用的價值。