黔產(chǎn)五種卷柏黃酮含量測定及其對α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

晏英 王丹 陳潔 唐攀 陳文章 廖偉科 楊小生

摘 要：建立中藥卷柏特征成分總黃酮及穗花杉雙黃酮的快速含量分析方法，比較不同卷柏藥材中的含量及活性差異。采用紫外分光光度法和高效液相色譜法分別測定卷柏總黃酮和穗花杉雙黃酮含量;通過建立體外α-葡萄糖苷酶抑制模型，對卷柏活性部位進行活性測試。不同卷柏中總黃酮含量在1.48%～2.67%之間，穗花杉雙黃酮含量在0.49%～0.93%之間，活性部位的總黃酮含量在9.14%～16.46%之間，穗花杉雙黃酮含量在2.26%～4.74%之間。卷柏活性部位的α-葡萄糖苷酶活性為：墊狀卷柏IC50 6.56 μg/mL;疏葉卷柏IC50 4.47 μg/mL;兗州卷柏IC50 4.41 μg /mL;劍葉卷柏IC50 4.23 μg /mL;塊莖卷柏IC50 3.12 μg/mL，均明顯強于陽性對照阿卡波糖（IC50 76.82 μg/mL）?？傸S酮和穗花杉雙黃酮含量在不同品種間存在差異，其中對α-葡萄糖苷酶抑制作用和黃酮含量呈量效關(guān)系，且具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

關(guān)鍵詞：卷柏;總黃酮;穗花杉雙黃酮;α-葡萄糖苷酶;抑制作用

Abstract：A rapid quantitative determination method of total flavonoids and amentoflavone，a characteristic component of the traditional Chinese medicine，was establisheto compare the content and activity differences in different Selaginella medicinal materials.The content of total flavonoidsand amentoflavone were determined by ultraviolet spectrophotometry and high performance liquid chromatography（HPLC），respectively.The activity test of the active part ofSelaginella was carried out through the establishment of α-glucosidase inhibition model in vitro. The results showed thatthe content of total flavonoids ranged from 1.48% to 2.67%，and the content of amentoflavone ranged from 0.49% to 0.93% in different plants. Meantime，the content of total flavonoidswas between 9.14% and 16.46%，and the content of amentoflavone ranged from 2.26% to 4.74% in the activity of five active parts. The α-glucosidaseactivity of five active partsofSelaginella，IC50 of S.pulvinate，S.remotifolia，S.involvens，S.xipholepis，S.chrysocauloswas6.56 μg/mL，4.47 μg/mL，4.41 μg/mL，4.23 μg/mL，3.12 μg/mL，respectively，which was significantly stronger than the positive control acarbose（IC50 76.82 μg/mL）.The contents of total flavonoids and amentoflavone weredifferentamongdifferent varieties.and the inhibitory effect on α-glucosidase was in a dose-effect relationship with the content of flavonoids，and has significant α-glucosidase inhibitory activity.

Keywords：Herba Selaginella;total flavonoids; amentoflavone; α-glucosidase; inhibitory activity

卷柏為蕨類植物門卷柏科（Selaginellaceae）卷柏屬植物，約有700種。我國約有50種，分布全國各地，主產(chǎn)于湖南、福建、四川、陜西、江西、浙江等地[1]。卷柏為中國藥典收載品種，卷柏屬植物卷柏Selaginella tamariscina（Beauv.）Spring和墊狀卷柏Selaginella pulvinate（Hook.et Grev.）Maxim.均作為卷柏入藥[2]?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明，卷柏具有抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、降血壓、降血糖、抗痛風和增強人體免疫功能等作用[3-8]。在化學成分研究中，卷柏中含有豐富的黃酮類成分，以雙黃酮為主，其中雙黃酮化學成分是以穗花杉雙黃酮為代表的雙黃酮類化合物[9-11]。研究表明，穗花杉雙黃酮具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、抗老化、抗癡呆、降血糖、降血脂、抗抑郁、抗?jié)兊壬锘钚訹11-16]。在降血糖方面，穗花杉雙黃酮可改善糖尿病小鼠血糖紊亂，調(diào)節(jié)胰島素分泌，修復胰島組織。

當前對降血糖活性物質(zhì)的體外評價主要通過其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用實現(xiàn)。從天然產(chǎn)物制備α-葡萄糖苷酶抑制劑比合成制品價格低廉且毒副作用小，越來越多的學者開始青睞于從藥用植物中篩選天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑，以期尋找到新的安全、有效的藥物[17-20]。近年來在國內(nèi)主要以α-糖苷酶為作用靶點，建立體外微量篩選模型，從各種中藥中篩選治療糖尿病的有效成分并對其α-糖苷酶抑制活性進行評價已成為糖尿病治療藥物研究的熱點之一。

本文建立了合理的卷柏黃酮提取工藝，針對總黃酮提取過程中的各項參數(shù)，通過正交設計試驗進行了優(yōu)選，獲得最佳工藝。卷柏總黃酮中主要成分為穗花杉雙黃酮，以該成分為對照品，分別對總黃酮和穗花杉雙黃酮建立快速的含量測定方法，可以作為該組分的質(zhì)量控制方法。本研究對五種卷柏及其活性部位的總黃酮、穗花杉雙黃酮進行了含量測定研究，在含量測定基礎(chǔ)上進行了α-葡萄糖苷酶體外活性篩選，為建立卷柏屬藥材的質(zhì)量控制標準提供新的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（配備低壓四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、ChemStations色譜工作站，美國安捷倫科技有限公司），HP8345紫外分光光度儀（美國惠普公司），MR-96A 多功能酶標儀（瑞士TECAN 有限公司），BS224S型電子天平、SQP型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司），101型電熱鼓風干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市天瑞儀器有限公司）。

1.2 材料

α-葡萄糖苷酶對照品（美國Sigma公司，批號：SLBX6245）;阿卡波糖對照品（批號：J1824027）、對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷（PNPG）對照品（批號：E1828029）均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司;穗花杉雙黃酮（批號111902-201603）購于中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純;水為娃哈哈純凈水;其余試劑均為分析純。試驗用五種卷柏均采自貴州省水城市玉舍公園，經(jīng)貴州師范大學王培善教授鑒定為墊狀卷柏（Selaginella pulvinata），疏葉卷柏（Selaginella remotifolia），兗州卷柏（Selaginella involvens），劍葉卷柏（Selaginella xipholepis），塊莖卷柏（Selaginella chrysocaulos）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

采用加熱回流提取，提取溫度為60℃，分別以乙醇濃度、提取時間、料液比及提取次數(shù)對總黃酮提取率影響設置單因素試驗，各因素設置4個不同的水平，對墊狀卷柏藥材進行提取工藝考察，找出不同因素的最佳處理。

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響

為了研究乙醇濃度對墊狀卷柏總黃酮提取效果的影響，本試驗設置了4個不同的乙醇體積分數(shù)，分別為65%、75% 、85%、95%乙醇。料液比為1∶15，每個樣品提取3次，每次2 h，測定并計算總黃酮的提取率分別為1.01%、1.47%、1.20%、1.05%，結(jié)果表明75%乙醇的提取率為最佳。

2.1.2 料液比對總黃酮提取率的影響

為了研究料液比對墊狀卷柏總黃酮提取效果的影響，本試驗設置了4個不同的料液比，分別為1∶8、1∶10、1∶15、1∶20，乙醇體積分數(shù)為75%，每個樣品提取3次，每次2 h，測定并計算總黃酮的提取率分別為1.18%、1.26%、1.48%、1.41%，結(jié)果表明料液比1∶15的提取率為最佳。

2.1.3 提取時間對總黃酮提取率的影響

為了研究提取時間對墊狀卷柏總黃酮提取效果的影響，本試驗設置了4個不同的提取時間，分別為每次提取1 h、2 h、3 h、4 h。乙醇體積分數(shù)為75% ，料液比為1∶15，每個樣品提取3次，測定并計算總黃酮的提取率分別為0.95%、1.48%、1.43%、1.31%，結(jié)果表明提取時間以每次提取2 h為宜。

2.1.4 提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響

為了研究提取次數(shù)對墊狀卷柏總黃酮提取效果的影響，本試驗設置了4個不同的提取次數(shù)分別為提取1、2、3、4次。乙醇體積分數(shù)為75% ，料液比為1∶15，每次提取2 h，測定并計算總黃酮的提取率分別為1.02%、1.42%、1.48%、1.47%，綜合考慮成本、時間因素，簡化操作流程，一般選擇提取3次。

2.2 墊狀卷柏總黃酮的提取工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗 以單因素試驗結(jié)果為參考，對乙醇濃度、料液比、提取時間及提取次數(shù)進行4因素3水平正交試驗（表1）。以總黃酮提取率為指標，通過L9（34）正交試驗確定最佳提取條件。結(jié)果及極差分析見表2，方差分析見表3。

由表2的極差可知，各因素對卷柏總黃酮提取率影響大小順序為A（乙醇濃度）>D（提取次數(shù)）>C（料液比）>B（提取時間）。表3的方差分析表明，乙醇濃度、提取次數(shù)及料液比均對卷柏總黃酮提取率具有極顯著影響，提取時間對卷柏總黃酮的轉(zhuǎn)移率存在明顯影響。從試驗結(jié)果來看，卷柏總黃酮提取的最佳工藝條件為A2B1C2D3，即乙醇體積分數(shù)為75% ，提取時間每次2 h，料液比1∶15，提取3次。

2.2.2 最佳提取工藝的驗證 精密稱取干燥的墊狀卷柏藥材三份，每份各1.0 g，加15倍的75%乙醇回流提取3次，每次2 h，冷卻后過濾，合并濾液定容至100 mL，重復測定三次取平均值，得總黃酮提取率，結(jié)果見表4。表明本提取工藝較為穩(wěn)定可靠，且提取率較高。

2.3 五種卷柏樣品中總黃酮的測定

2.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取干燥恒重的穗花杉雙黃酮對照品5.45 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

精密稱取五種卷柏粉末，在相同的條件下用75%乙醇進行回流提取三次，每次2 h，料液比在1∶15倍，提取液濾過合并，定容至100 mL，搖勻，即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.3.1”項下的對照品溶液1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL、3.5 mL、4 mL置25 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻。在335 nm處測定吸光度。以吸光度對質(zhì)量濃度進行線形回歸，得回歸方程Y=0.053X-0.010（r=0.9999），總黃酮在4.36～17.44 μg/mL內(nèi)線性范圍內(nèi)良好。

2.3.4 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液，重復測定6次吸光度，計算總黃酮的含量，總黃酮含量的RSD為0.66%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗

精密稱取同一份提取物，配制供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、48 h測定吸光度，計算總黃酮的含量，結(jié)果總黃酮含量的RSD為1.46%，說明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗

稱取五種卷柏樣品約0.5 g，共6份，加入穗花衫雙黃酮對照品適量，按“2.3.2”項下供試品溶液制備方法處理，按上述吸收波長測定并計算回收率。墊狀卷柏回收率為99.15%，RAD值為2.14%，疏葉卷柏回收率為100.36%，RAD值為1.35%，兗州卷柏回收率為99.47%，RAD值為1.11%，劍葉卷柏回收率為99.93%，RAD值為1.92%，塊莖卷柏回收率為101.86%，RAD值為1.77%。

2.3.7 樣品測定

取五種卷柏樣品適量，精密稱定，按“2.3.2”項下方法制備樣品溶液，按上述吸收波長測定，計算五種卷柏樣品的總黃酮含量，結(jié)果分別為：墊狀卷柏為1.48%，疏葉卷柏為1.72%，兗州卷柏為1.84%，劍葉卷柏為2.55%，塊莖卷柏回收率為2.67%。

2.4 五種卷柏樣品中穗花衫雙黃酮的測定

2.4.1 色譜條件

色譜柱為SunFire TM-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）;動相：乙腈-0.2%磷酸水溶液（35∶65），體積流量：0.8 mL/min，檢測波長：335 nm;柱溫：30℃;進樣量：10 μL。按上述色譜條件獲得對照品和五種卷柏樣品的色譜圖見圖1。

2.4.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥恒重的穗花杉雙黃酮對照品4.50 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，搖勻，得對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備

按“2.3.2項”制備供試品溶液，取2 mL定容50 mL為相應供試品溶液。加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.4.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述對照品儲備液適量，制成7種不同濃度的混合對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，以對照品溶液的濃度（μg/mL）為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，得回歸方程Y=247.40X-1.48（r=0.9999），穗花杉雙黃酮在4.5～54.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，重復測定6次，記錄穗花杉雙黃酮峰面積，計算得RSD值為0.20%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、48 h進樣10 μL，記錄峰面積，結(jié)果穗花杉雙黃酮的峰面積，RSD為1.67%。結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 加樣回收率試驗

分別精密稱取五種卷柏樣品6份，每份約0.5 g，分別加入穗花杉雙黃酮對照品，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜進樣測定，記錄峰面積，計算樣品中的平均加樣回收率及RSD值，結(jié)果分別為：墊狀卷柏回收率為100.98%，RAD值為1.40%，疏葉卷柏回收率為100.76%，RAD值為1.01%，兗州卷柏回收率為100.85%，RAD值為1.34%，劍葉卷柏回收率為100.06%，RAD值為0.78%，塊莖卷柏回收率為100.29%，RAD值為1.02%。

2.4.8 樣品的測定

分別精密稱定五種卷柏樣品1.0 g，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，計算五種卷柏樣品中的穗花杉雙黃酮的含量。結(jié)果分別為：墊狀卷柏為0.49%，疏葉卷柏為0.52%，兗州卷柏為0.68%，劍葉卷柏為0.53%，塊莖卷柏回收率為0.93%。。

2.5 五種卷柏活性部位的確定及含量測定

2.5.1 五種卷柏活性部位的確定

采用正交設計對卷柏的提取工藝進行優(yōu)化，精密稱取五種卷柏樣品，在相同的條件下用75%乙醇進行回流提取三次，每次2 h，料液比1∶15倍，提取液濾過合并，濃縮至無醇味，用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚層、乙酸乙酯層、水層，分別進行體外α-葡萄糖苷酶活性篩選，卷柏各提取物部分中乙酸乙酯萃取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性最強，其余部分不具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，確定乙酸乙酯萃取物為卷柏的活性部位。經(jīng)薄層色譜TLC檢驗，黃酮部分基本完全集中在乙酸乙酯層，濃縮乙酸乙酯層成稠膏狀，置真空干燥箱中干燥至恒重，得相應卷柏活性部位。

2.5.2 五種卷柏活性部位的含量測定

取五種卷柏活性部位，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。按紫外分光光度法和高效液相色譜條件進樣測定，計算五種卷柏活性部位中總黃酮和穗花杉雙黃酮的含量。結(jié)果見表5。

2.6 五種卷柏活性部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性

2.6.1 阿卡波糖對照品溶液的制備

精密稱取阿卡波糖對照品適量，加水溶解并稀釋，配制成四個濃度梯度0.1 μg/mL，1 μg/mL，10 μg/mL，100 μg/mL的對照品系列溶液。

2.6.2 五種卷柏活性部位供試品溶液的制備

將卷柏各活性部位用DMSO溶解，配制成濃度為10 g/L的溶液，再用0.1 mol /L PB緩沖液依次稀釋10倍，配制成四個濃度梯度0.1 μg/mL，1 μg/mL，10 μg/mL，100 μg/mL的溶液。

2.6.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定方法

精密吸取“2.6.1”和“2.6.2”項下的阿卡波糖對照品系列溶液和卷柏活性部位供試品溶液各10 μL，置于96孔板中，加入PBS 60 μL，再加入2 U/mL α-葡萄糖苷酶水溶液10 μL，混勻，于37℃孵育15 min;隨后加入5 mmol/L PNPG水溶液20 μL，于37℃孵育20 min，加入0.1 mol/L碳酸鈉溶液50 μL終止反應。以水為空白對照，以阿卡波糖為陽性對照，于405 nm波長下測定吸光度值（OD）值，計算抑制率和半數(shù)抑制濃度（IC50），抑制率（%）=（OD空白-OD樣品）/OD空白×100%。各樣品均重復測定3次，結(jié)果見表6。由表6可知，阿卡波糖和五種卷柏活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均呈現(xiàn)隨著劑量升高而增強的趨勢;五種卷柏活性部位對α-葡萄糖苷酶抑制活性明顯強于陽性對照阿卡波糖，說明五種卷柏活性部位具有顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同種間的含量差異

分別測定了貴州產(chǎn)五種卷柏植物及其活性部位中的總黃酮和穗花衫雙黃酮的含量，由測定結(jié)果可以看出，總黃酮、穗花杉雙黃酮在不同卷柏植物中及不同卷柏活性部位中的含量存在差異，在不同卷柏及其活性部位中，以塊莖卷柏含量最高，墊狀卷柏含量最低。說明總黃酮、穗花杉雙黃酮在藥材中的含量分布可能與種屬密切相關(guān)，本分析方法為優(yōu)良卷柏藥材的篩選提供依據(jù)。

3.2 含量與活性之間的關(guān)系

卷柏不同提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行了初步篩選，結(jié)果表明乙醇提取物中乙酸乙酯萃取部分有較強的活性，為卷柏的活性部位，單體化合物穗花衫雙黃酮為主要活性成分。從五種卷柏活性部位的總黃酮、穗花杉雙黃酮含量來看，塊莖卷柏黃酮含量最高，提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用也最強，其余提取物在量效上均有一定對應關(guān)系。

該研究建立了一種快速定量分析卷柏屬總黃酮的紫外測定方法，典型雙黃酮類化合物穗花杉雙黃酮的HPLC方法，以及體外α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選的方法，并對同一產(chǎn)地不用品種的卷柏植物進行了含量和活性測定。結(jié)果表明，該方法操作簡單、快速、準確，靈敏度高，重現(xiàn)性好。將含量測定與活性測試相結(jié)合，更加科學和有效地對卷柏藥材及其活性部位進行質(zhì)量控制。

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