靜電場調(diào)控p53合成對成纖維細(xì)胞增殖周期的影響*

梁媛媛 涂 曄 安曉強(qiáng) 江 鍵△ 崔黎麗#

（1 海軍軍醫(yī)大學(xué)衛(wèi)勤系數(shù)理教研室，上海 200433；2 上海市東方醫(yī)院，上海 200120；3 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院無機(jī)化學(xué)教研室，上海 200433）

細(xì)胞的遷移、生長和增殖是重要的生命運(yùn)動(dòng)，它在哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育、創(chuàng)面修復(fù)、炎癥反應(yīng)等各種生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用[1-5]。

細(xì)胞是一類電偶極子，在外電場作用下細(xì)胞膜表面會(huì)產(chǎn)生極化現(xiàn)象，駐極體產(chǎn)生的穩(wěn)定外靜電場對調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、增殖和趨電遷移具有重要影響[6-11]。研究駐極體對細(xì)胞遷移和增殖的影響具有重要的基礎(chǔ)研究意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。前期的大量研究結(jié)果雖然已經(jīng)基本明確駐極體產(chǎn)生的外電場可以調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、遷移和凋亡等，但對駐極體調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制及其調(diào)控路徑的研究較少，尤其是與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的細(xì)胞周期及其周期調(diào)控機(jī)制的研究更是鮮見報(bào)道。p53基因介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生命活動(dòng)中其重要作用[12-14]。本文研究駐極體靜電場調(diào)控p53 合成對成纖維細(xì)胞生長和增殖的影響，為駐極體生物效應(yīng)研究提供新途徑和新思路。

1 材料和方法

1.1 駐極體的制備和分組

膜厚為13 μm的聚丙烯（polypropylene，PP）商品膜（東麗株式會(huì)社，日本），經(jīng)低溫等離子體放電系統(tǒng)（電暈充電系統(tǒng)）制備成不同表面電位的正極性和負(fù)極性駐極體（雙裸面，無金屬電極）。針尖電壓為：-15 kV；柵壓分別為5 000V 和-5 000V；充電時(shí)間為5 min。駐極體的等效表面電位通過振動(dòng)電容靜電計(jì)（北京華晶科技有限公司）測量。將表面電位為0的PP膜設(shè)為對照組，將表面電位為5 000V 和-5 000V的駐極體分別設(shè)為5 000V 駐極體組和-5 000V 駐極體組，簡稱5 000V組和-5 000V組。

1.2 動(dòng)物和主要試劑

清潔級SD雄性大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，購自海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。胰蛋白酶、胎牛血清、1640培養(yǎng)基和雙抗等購于Gibco公司；PBS緩沖液購于Servicebio公司；CCK-8 試劑盒購于東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；RNA 提取液購于武漢賽維爾生物科技有限公司；Hoechst 33342 購于上海如吉生物科技有限發(fā)展公司；定量PCR引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司提供；水合氯醛等常用試劑均購于中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

將大鼠麻醉后剔除背部毛發(fā)，潔凈背部皮膚，取下皮膚組織，用含有青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）的PBS 緩沖液沖洗，洗凈后將皮膚組織剪成小塊（1～2 mm3）置于含有20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，待成纖維細(xì)胞從組織塊周圍爬出，待爬出的細(xì)胞有較多數(shù)量時(shí)，吸取培養(yǎng)液并用0.25%胰蛋白酶37℃消化細(xì)胞1～2 min，轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞傳代，待細(xì)胞傳至3～8 代后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 成纖維細(xì)胞增殖活性檢測

取對數(shù)生長期第3代的成纖維細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中（細(xì)胞密度104個(gè)/孔），將表面電位為0、-1 000、-2 000、-5 000、1 000、2 000V和5 000V駐極體分別作用于成纖維細(xì)胞24、48 h和72 h。隨后向各孔的細(xì)胞液中加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h后，振蕩搖勻后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（北京諾亞威儀器儀表有限公司）在450 nm波長處測定各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的吸光度值（OD值），吸光度值越高，表示細(xì)胞的增殖活性越強(qiáng)。相對增殖能力強(qiáng)弱用細(xì)胞增殖率表示：增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD平均值）/（對照組OD平均值-空白組OD平均值）。式中空白組為無細(xì)胞的培養(yǎng)組。

1.5 細(xì)胞周期檢測

取對數(shù)生長期第3 代的成纖維細(xì)胞，在培養(yǎng)皿（已去除培養(yǎng)液）中加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶消化2 min后，制成2×107/L的單細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，在1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，將0、-5 000V 和5 000V 駐極體作用成纖維細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期。

1.6 成纖維細(xì)胞p53 mRNA表達(dá)檢測

取對數(shù)生長的成纖維細(xì)胞，將0V、-5 000V和5 000V駐極體作用成纖維細(xì)胞48 h后，加入TRIzol 裂解液提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，定量檢測擴(kuò)增p53的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。p53上游引物序列為5'-GAAGCCCTCCAAGTGTCAGC-3'，下游引物序列為5'-GGCAGAACAGCTTATTGAGGGA-3'。PCR反擴(kuò)增條件為95℃ 5 s、58℃ 20 s、72℃ 31 s，39個(gè)循環(huán)。采用公式2-ΔΔCT計(jì)算mRNA表達(dá)量，每個(gè)樣品取3個(gè)復(fù)管，取均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS Statistics 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 駐極體電荷儲(chǔ)存穩(wěn)定性

結(jié)果（圖1）顯示經(jīng)常溫等離子體制備的不同表面電位正、負(fù)極性聚丙烯駐極體的等溫表面電位衰減曲線，常溫充電的正極性和負(fù)極性聚丙烯駐極體具有優(yōu)異的電荷儲(chǔ)存穩(wěn)定性。在常溫下存放24 h，-1 000、-2 000V 和-5 000V 駐極體的等效表面電位分別是初始電位的80%、76%和65%；在常溫下存放72h，-1 000、-2 000V 和-5 000V 駐極體的等效表面電位分別是初始電位的77%、73%和63%。說明不同表面電位的負(fù)極性駐極體可以提供穩(wěn)定的外靜電場用于后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)（圖1A）。且相同表面電位正、負(fù)極性駐極體的電荷儲(chǔ)存具有相似的規(guī)律（圖1B）：常溫下存放72 h，5 000V 駐極體的等效表面電位為初始值的62%，與-5 000V 駐極體在常溫下存放72 h的等效表面電位（初始值的63%）基本一致，這表明相同表面電位的正、負(fù)極性駐極體能夠提供大小相同的外靜電場。

圖1 不同表面電位駐極體等效表面電位隨時(shí)間的變化規(guī)律

2.2 駐極體對成纖維細(xì)胞增殖能力的影響

與對照組相比，不同表面電位負(fù)極性駐極體作用成纖維細(xì)胞72 h，細(xì)胞的增殖能力逐漸增強(qiáng)，駐極體的等效表面電位越高（提供的靜電場強(qiáng)度越大），成纖維細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)（圖2）。-5 000V 駐極體組細(xì)胞的增殖能力較對照組提高（1.080±0.051）倍。不同表面電位正極性駐極體作用成纖維細(xì)胞72 h，細(xì)胞的增殖能力逐漸減弱，駐極體的等效表面電位越高（提供的靜電場強(qiáng)度越大），成纖維細(xì)胞的增殖能力越弱。5 000V 駐極體組細(xì)胞的增殖能力是對照組的（0.900±0.059）倍（圖3）。負(fù)極性駐極體促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖作用和正極性駐極體抑制成纖維細(xì)胞的增殖作用與駐極體（或靜電場）的作用時(shí)間呈正相關(guān)。

圖2 不同表面電位正極性和負(fù)極性駐極體作用成纖維細(xì)胞72 h 對細(xì)胞增殖能力的影響

圖3 正極性和負(fù)極性駐極體作用成纖維細(xì)胞不同時(shí)間對細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 駐極體對成纖維細(xì)胞生長周期的影響

與對照組相比，經(jīng)-5 000V駐極體作用48 h的細(xì)胞群中處于G1期的細(xì)胞數(shù)明顯下降，從77.79%±0.52%下降至72.63%±0.07%；而G2期的細(xì)胞數(shù)顯著上升，從13.07%±0.99%增加至23.85%±0.76%（圖4B），這說明負(fù)極性駐極體作用成纖維細(xì)胞，縮短了細(xì)胞在G1期所滯留的時(shí)間，使細(xì)胞快速通過S期到達(dá)G2期，負(fù)極性駐極體具有促進(jìn)細(xì)胞生長的機(jī)制之一是縮短細(xì)胞的生長周期。5 000V駐極體作用成纖維細(xì)胞48 h，處于G1期細(xì)胞的比例較對照組顯著上升從77.79%±0.52%上升至81.43%±0.17%，而G2期的細(xì)胞明顯下降從13.07%±0.99%減少至11.85%±0.52%（圖4C），這說明正極性駐極體產(chǎn)生的外靜電場通過使細(xì)胞阻滯于G1期而抑制細(xì)胞的生長。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)組作用成纖維細(xì)胞48 h后的細(xì)胞周期圖

2.4 駐極體對成纖維細(xì)胞p53 mRNA表達(dá)的影響

5 000 V 駐極體和-5 000V 駐極體分別作用成纖維細(xì)胞48 h后，與對照組相比，經(jīng)5 000V 駐極體作用48 h后成纖維細(xì)胞中p53 mRNA的表達(dá)量為1.30±0.10，是對照組的1.3倍（P＜0.05）。而經(jīng)-5 000V 駐極體作用48 h后成纖維細(xì)胞中p53 mRNA的表達(dá)量卻下降至0.71±0.07，是對照組的0.7倍（P＜0.05）。提示負(fù)極性駐極體通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53基因的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞快速通過G1期，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

3 討論

低頻電場的生物效應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的問題。已有很多報(bào)道表明電刺激可以影響生物大分子的合成與分解，離子通道的變化，以及細(xì)胞增殖等[15-18]。轉(zhuǎn)化生長因子β（TFG-β）和p53基因是細(xì)胞周期的重要調(diào)控因子。p53基因可通過抑制有絲分裂的過程，阻止細(xì)胞進(jìn)入DNA 合成期，其表達(dá)增加能夠促使細(xì)胞凋亡[19]。我們在前期系統(tǒng)研究駐極體對成纖維細(xì)胞TFG-β 調(diào)控規(guī)律的基礎(chǔ)上[20]，研究駐極體靜電場對成纖維細(xì)胞p53基因的影響。通過研究成纖維細(xì)胞在不同極性和表面電位的駐極體靜電場過作用下，細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡基因表達(dá)的變化，闡述駐極體靜電場調(diào)控p53 合成對成纖維細(xì)胞生長和增殖的影響。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示：經(jīng)低溫等離子體放電系統(tǒng)制備的不同極性聚丙烯駐極體具有優(yōu)異的電荷儲(chǔ)存能力，且負(fù)極性駐極體具有促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖的作用，而正極性駐極體具有抑制細(xì)胞生長和增殖的作用。此外，負(fù)（或正）極性駐極體促進(jìn)（或抑制）細(xì)胞生長和增殖的作用與駐極體產(chǎn)生的外靜電場強(qiáng)度以及電場作用細(xì)胞的時(shí)間長短呈正相關(guān)。正極性駐極體通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖。而負(fù)極性駐極體則通過加快細(xì)胞通過G1期限制點(diǎn)的時(shí)限，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。因此進(jìn)一步證明，駐極體產(chǎn)生的靜電場通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)p53 mRNA的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞增殖能力的調(diào)控。我們推測這是因?yàn)椋厚v極體產(chǎn)生的靜電場作用于成纖維細(xì)胞的主要作用靶點(diǎn)是細(xì)胞的細(xì)胞膜，靜電場作用于成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞的膜電位（或膜電容）發(fā)生改變，從而導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的極化，以及細(xì)胞膜上各類膜蛋白、糖蛋白、氨基酸、生長因子和細(xì)胞因子等極化和再分布，由此影響成纖維細(xì)胞的生長周期，調(diào)控細(xì)胞的分化與增殖。

綜上所述，當(dāng)細(xì)胞處于外靜電場環(huán)境下，電場作為外源刺激因子將引起成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生變化，可能是通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)p53 mRNA的表達(dá)水平從而調(diào)控細(xì)胞的分化與增殖。