DCC、FAT3、DLG2、KTN1基因多態(tài)性與海洛因依賴的相關(guān)性研究*

賈 維，欒鵬飛，馬占兵，彭 亮，鐘慧軍，朱永生，黨 潔△

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川 750004；2.寧夏回族自治區(qū)生育力保持教育部重點實驗室，寧夏銀川 750004；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證系，陜西西安 710061

海洛因依賴是一種在吸食海洛因后所引發(fā)的復(fù)雜的慢性復(fù)發(fā)性腦病，以強(qiáng)迫性覓藥、藥物濫用、機(jī)體對藥物產(chǎn)生強(qiáng)烈精神和身體依賴性為主要特征[1-2]。研究顯示，遺傳因素在海洛因依賴的發(fā)生中作用較大[3-4]。與其他成癮藥物的特征一致，服用海洛因后會引起大腦伏隔核區(qū)域多巴胺神經(jīng)元末梢大量釋放多巴胺，從而引起藥物的獎賞效應(yīng)，這是造成藥物成癮、復(fù)發(fā)及強(qiáng)迫性覓藥等依賴行為的基礎(chǔ)[3，5]。2015年的一項全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究顯示，結(jié)腸癌缺失基因(DCC)、非典型鈣黏蛋白3基因(FAT3)、成蟲大盤基因同源物2(DLG2)和驅(qū)動結(jié)合蛋白1基因(KTN1)多態(tài)性與人類大腦皮層下結(jié)構(gòu)及中腦邊緣腹側(cè)區(qū)的活動相關(guān)，可能參與了中腦邊緣獎賞效應(yīng)的調(diào)節(jié)[3]。為進(jìn)一步明確以上4個基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與海洛因依賴的關(guān)聯(lián)性，本研究通過SNaPshot SNP分型技術(shù)比較分析DCC(rs2270954)、FAT3(rs1318862)、DLG2(rs683250)和KTN1(rs945270)位點基因型及等位基因型在海洛因依賴患者與健康者間的分布差異及其基因間交互作用，以期為海洛因依賴人群易感基因的篩選和靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年3月至2017年7月在西安市精神衛(wèi)生中心接受美沙酮維持治療的396例漢族男性海洛因依賴患者為海洛因依賴組，平均年齡(47.03±5.95)歲，均無親緣關(guān)系，患者均符合《美國精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊(第4版)》阿片類藥物依賴性表現(xiàn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均無肢體殘疾，且無其他精神疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：有酒精、煙草、安非他命、巴比妥酸鹽、苯二氮卓類藥物或大麻依賴史的患者；同時服用其他可能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的處方藥的患者；有癲癇發(fā)作史、血液系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重的肝腎損害史等情況的患者。選擇西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心接受健康檢查的401例健康漢族男性作為健康對照組，平均年齡(46.41±9.59)歲，均無阿片類等非法成癮藥物服用史，無精神、神經(jīng)類疾病及其他內(nèi)科疾病史。本研究通過西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集及DNA提取 利用全血細(xì)胞DNA提取試劑盒EZNATMBlood DNA Midi(Omega Bio-Tek，Norcross，GA，USA)提取標(biāo)本中DNA。收集各研究對象全血2 mL加入150 μL OB蛋白酶，2.1 mL BL Buffer和20 μL RNase A，高速渦旋混勻1 min，65 ℃水浴15 min后加入2.2 mL無水乙醇。將DNA Midi結(jié)合柱套在15 mL收集管中，將上述混合液轉(zhuǎn)移至DNA Midi結(jié)合柱中以4 000×g離心5 min后加入3 mL HB Buffer再次離心。隨后DNA Wash Buffer清洗DNA后，利用預(yù)熱的1.5 mL Elution Buffer洗脫DNA至新的1.5 mL無酶EP管中，-20 ℃保存。

1.2.2SNP篩選 通過Haploview 4.2軟件對4個基因的標(biāo)簽SNPs進(jìn)行篩選，r2≥0.8；最小等位基因頻率(MAF)>0.05，見表1。

表1 DCC、FAT3、DLG2、KTN1基因SNP位點相關(guān)信息

1.2.3基因分型 使用SNaPshot SNP分型技術(shù)對DCC、FAT3、DLG2和KNT1基因的4個SNP進(jìn)行基因分型。(1)雙蒸水稀釋標(biāo)本DNA至5 ng/μL，加入1 U HotStarTaq聚合酶(Qiagen Inc.，USA)擴(kuò)增目標(biāo)SNP所在片段，總體積5 μL，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共45個循環(huán)；最終72 ℃ 30 s。(2)堿性磷酸酶去除剩余dNTP。(3)針對SNP的單堿基延伸反應(yīng)：反應(yīng)體系為0.755 μL無酶水、0.2 μL 10×iPLEX緩沖液、0.2 μL終止混合物、0.041 μL iPLEX酶(Sequenom)，0.804 μL 10 μmol的延伸引物；反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，共40個循環(huán)；最后72 ℃ 3 min。(4)終止反應(yīng)物中加入6 mg陽離子交換樹脂(Sequenom)脫鹽，使用MassARRAY Nanodispenser(Sequenom)將最終的分型產(chǎn)物點樣到一塊384孔的spectroCHIP(Sequenom)上，并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)進(jìn)行分析。(5)最終結(jié)果由MassARRAY RT軟件系統(tǒng)(版本號3.0.0.4)實時讀取，并由MassARRAY Typer軟件系統(tǒng)(版本號3.4)完成基因分型分析。(6)隨機(jī)抽取5%的標(biāo)本(55例受試者)進(jìn)行二次基因分型，重復(fù)率100%，提示分型結(jié)果可信。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0建立本地數(shù)據(jù)庫，采用在線SNP分析軟件包SNPStats(https://www.snpstats.net/)統(tǒng)計分析。基因型、等位基因頻率與Hardy-Weinberg平衡的符合程度采用Pearsonχ2檢驗，相對危險度采用比值比(OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)確定?；蚪换シ治霾捎枚嗑S因子降維法(MDR，http://sourceforge.net/projects/mdr/)及二元Logistic回歸法，選取雙側(cè)檢驗進(jìn)行計算，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Hardy-Weinberg平衡分析 海洛因依賴組和健康對照組間4個SNP位點基因型與等位基因型頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡定律，說明研究對象來自同一群體，具有良好的代表性。

2.2基因分型 海洛因依賴組和健康對照組經(jīng)過年齡校正后，DCC(rs2270954)、FAT3(rs1318862)、DLG2(rs683250)和KNT1(rs945270)位點基因型及等位基因頻率結(jié)果見表2。 結(jié)果顯示，DCC(rs2270954)及KNT1(rs945270)位點的等位基因和基因型頻率在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。海洛因依賴組DCC(rs2270954)的C等位基因頻率(P=0.005，OR=0.723，95%CI：0.576～0.908)和KNT1(rs945270)的G等位基因頻率(P=0.004，OR=0.698，95%CI：0.547～0.891)相較于健康對照組顯著降低，提示其可能是海洛因依賴的保護(hù)性因素，而攜帶DCC(rs2270954)的A等位基因及KNT1(rs945270)的C等位基因的個體發(fā)生海洛因依賴的可能性更高。此外，在本研究中FAT3(rs1318862)和DLG2(rs683250)位點的等位基因和基因型頻率在海洛因依賴組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示其與海洛因依賴發(fā)病風(fēng)險增高并無關(guān)聯(lián)。

表2 4個SNP基因型和等位基因頻率在兩組間的比較[n(%)]

2.3基因交互分析 利用二元Logistic回歸及MDR，本研究分析了4個SNP的基因交互作用。通過MDR分析4個SNP間潛在的高維交互作用，通過交叉驗證一致性及檢驗精確度進(jìn)行確認(rèn)。以是否有海洛因依賴(對照=0，病例=1)為因變量，以4個SNP作為自變量進(jìn)行賦值(0=0個風(fēng)險等位基因，1=1個風(fēng)險等位基因，2=2個風(fēng)險等位基因)。DCC(rs2270954)位點為一階最優(yōu)模型(P<0.05)；DCC(rs2270954)與KTN1(rs945270)為二階最優(yōu)模型(P<0.000 1)；DCC(rs2270954)、DLG2(rs683250)和KTN1(rs945270)的組合為三階最優(yōu)模型(P<0.000 1)，此外本研究發(fā)現(xiàn)4個SNP間在四階水平的交互同樣有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)。所有模型均經(jīng)過1 000次置換檢驗，見表3。

表3 MDR檢測4個SNP位點基因間交互作用

同時，利用二元Logistic回歸分析4個SNP位點間在二階、三階和四階水平的相乘交互作用，見表4。在構(gòu)成的11種交互作用模型中，DCC(rs2270954)×KTN1(rs945270)(P<0.01)為僅有的在二階模型中存在顯著相乘交互作用的組合。此外，在4種三階交互模型中，有3種組合在健康對照組和海洛因依賴組間存在顯著交互作用，其中DCC(rs2270954)×DLG2(rs683250)× KTN1(rs945270)組合的顯著交互作用在MDR結(jié)果中得到驗證。本研究并未發(fā)現(xiàn)四階交互作用。

表4 二元Logistic回歸法檢測4個SNP位點基因間交互作用

3 討 論

藥物依賴被認(rèn)為是成癮藥物通過影響中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)，也就是大腦中樞獎賞活動區(qū)域過度釋放多巴胺，刺激大腦中樞系統(tǒng)產(chǎn)生愉悅感而引發(fā)的，因此能夠參與中腦邊緣獎賞效應(yīng)調(diào)節(jié)的基因都是潛在的藥物成癮易感基因[5]。

有研究發(fā)現(xiàn)，DCC、FAT3、DLG2及KTN1基因多態(tài)性與人類大腦皮層下結(jié)構(gòu)及中腦邊緣腹側(cè)區(qū)的活動相關(guān)，可能參與了中腦邊緣獎賞效應(yīng)的調(diào)節(jié)，且DCC基因rs16956878、rs12607853和rs2292043與海洛因依賴的發(fā)生密切相關(guān)，可能是調(diào)控海洛因依賴發(fā)生的關(guān)鍵效應(yīng)分子[6]，而其他幾個基因與海洛因依賴的關(guān)聯(lián)性目前尚未見報道。本研究結(jié)果顯示，DCC(rs2270954)位點的等位基因和基因型頻率在健康對照組和海洛因依賴組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，攜帶DCC(rs2270954)A等位基因的個體可能對海洛因依賴更為易感，進(jìn)一步說明DCC可能是引起海洛因依賴風(fēng)險增高的潛在易感基因。

DCC基因定位于18q21.3，是中腦邊緣皮質(zhì)多巴胺系統(tǒng)的重要組成部分與功能決定因素[7]。作為神經(jīng)生長因子Netrin-1的受體，DCC參與了Netrin-1依賴性聯(lián)合神經(jīng)元軸突的生長[8-10]，在突觸可塑性、軸突引導(dǎo)、晝夜節(jié)律維持等方面發(fā)揮作用[11-12]。DCC(rs2270954)位點位于DCC基因3′非編碼區(qū)，有研究顯示，該位點與精神分裂癥的發(fā)生密切相關(guān)，推測其可能通過影響DCC mRNA與特定microRNA的靶向結(jié)合，改變DCC蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或mRNA的翻譯，從而調(diào)控DCC基因的表達(dá)水平[13]。本研究結(jié)果顯示，攜帶DCC(rs2270954)A等位基因的個體更易于對海洛因等成癮藥物產(chǎn)生依賴，這可能是由于該位點的變異影響DCC的表達(dá)，從而影響大腦中樞活動區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元突觸的可塑性所致。

KTN1基因定位于14q22.1，其編碼的KTN1作為驅(qū)動結(jié)合蛋白，能夠通過與驅(qū)動蛋白相結(jié)合參與細(xì)胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)及膜形態(tài)與結(jié)構(gòu)的維持[14]。本研究發(fā)現(xiàn)KTN1(rs945270)位點的C等位基因頻率與海洛因依賴的發(fā)病風(fēng)險具有一定關(guān)系。rs945270位點屬于基因間SNP，有研究顯示，該位點C等位基因能夠顯著促進(jìn)KTN1的表達(dá)，從而通過增加大腦殼核灰質(zhì)體積促進(jìn)中腦多巴胺能神經(jīng)元釋放多巴胺[15]。

DCC(rs2270954)和KNT1(rs945270)位點除了基因型與等位基因頻率在海洛因依賴組和對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)外，通過基因交互分析發(fā)現(xiàn)，二者對海洛因依賴的發(fā)病風(fēng)險還存在統(tǒng)計學(xué)意義的交互作用，提示二者可能通過相互作用影響DCC和KTN1的表達(dá)，繼而異常調(diào)節(jié)中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)，增加海洛因依賴的發(fā)病風(fēng)險。

FAT3屬于非典型鈣黏蛋白家族，是一種鈣離子依賴性黏附蛋白[16]。研究顯示，F(xiàn)AT3的異常表達(dá)能影響大腦尾殼核體積的大小，從而在個體行為動作、習(xí)慣養(yǎng)成和藥物依賴等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[6]。DLG2是突觸后致密結(jié)構(gòu)的支架蛋白，而突觸后致密結(jié)構(gòu)已被證實與海洛因依賴相關(guān)[12]。然而，本研究并未發(fā)現(xiàn)FAT3(rs1318862)和DLG2(rs683250)位點與海洛因依賴之間存在相關(guān)性。雖然FAT3(rs1318862)、DLG2(rs683250)并不是海洛因依賴的獨(dú)立危險因子，但是其可能通過與DCC(rs2270954)和KNT1(rs945270)的交互作用，參與海洛因依賴的發(fā)生。

本研究尚存在很多不足。作為一類受環(huán)境、人種等差異影響的高度異質(zhì)性多基因遺傳病，僅在單一人群建立個別位點與海洛因依賴間的關(guān)聯(lián)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，因此有必要在將來進(jìn)一步擴(kuò)大研究群體，加大SNP位點數(shù)量后全面研究基因多態(tài)性與海洛因依賴的關(guān)聯(lián)性，同時進(jìn)一步通過交互分析研究海洛因依賴與家庭環(huán)境、親人態(tài)度、個體人格特征等環(huán)境風(fēng)險因子間的交互作用。

綜上所述，本文研究了DCC(rs2270954)、FAT3(rs1318862)、DLG2(rs683250)和KNT1(rs945270)位點SNP與海洛因依賴的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示DCC(rs2270954)及KTN1(rs945270)位點SNP可能與海洛因成癮有關(guān)，且二者可能通過交互作用影響大腦獎賞效應(yīng)的調(diào)節(jié)。本研究將為海洛因依賴人群易感基因的篩選和靶向治療提供一定理論依據(jù)。