硫酸-苯酚法測定六種牡丹葉中總多糖的含量

牛曉方 ，高一軍 ，懷寶剛 ，尹二彥 ，馬騰洲 ，李克明 ，黃利敏，王 培，侯明超，姜偉洲

（1.菏澤市立醫(yī)院，山東 菏澤 274031；2.平邑縣中醫(yī)醫(yī)院，山東 平邑 273300；3.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；4.濰坊市中醫(yī)醫(yī)院，山東 濰坊 261041）

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.），芍藥科芍藥屬植物[1]，落葉灌木，在我國已有1500多年的栽培歷史，原種只產(chǎn)于我國，目前全國各省份均有栽培，并已引種國外。牡丹主要以其根皮入藥，中藥稱之為牡丹皮，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]就有記載；牡丹花也可入藥，在《中藥大辭典》[3]中有所記載，然而對于牡丹葉的臨床應(yīng)用研究較少，造成了資源的浪費(fèi)。近年來研究發(fā)現(xiàn)牡丹葉中含有多種活性成分，如黃酮類、多糖類、多酚類、芍藥苷等[4]，其中有研究發(fā)現(xiàn)牡丹葉中的多糖類成分對羥基自由基具有清除作用[5]，本研究采用無水乙醇回流提法提取了六種不同產(chǎn)地的牡丹葉中的總多糖，用硫酸-苯酚法分別測定了總多糖含量，以期為牡丹葉中總多糖的研究及牡丹葉的綜合合理開發(fā)總提供依據(jù)。

1 儀器

TU-1810紫外分光光度計(jì) （北京普析通用儀器有限公司）；KQE-400B型超聲清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司）；Metter Toledo EL2401電子天平。

2 藥材與試劑

牡丹葉(產(chǎn)地分別為山東菏澤、安徽亳州、安徽銅陵、甘肅武威、四川墊江、山西運(yùn)城);葡萄糖對照品 （SUPELCO，批號4-7829，純度98%以上）；其余試劑均為分析純。

3 試驗(yàn)方法

3.1 總多糖測定方法：

糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合形成一種橙紅色的化合物，在490 nm左右有最大吸收。根據(jù)朗伯比爾定律，當(dāng)波長和強(qiáng)度一定的入射光通過光程長度固定的有色溶液時，吸光度A和物質(zhì)濃度C呈正比，計(jì)算濃度。

3.2 對照品溶液的制備：

精密稱取葡萄糖對照品16.3 mg，置100 ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml含有葡萄糖16.3 μg的對照品溶液。再將對照品溶液稀釋一倍，得到濃度為8.15 μg/ml的對照品溶液。

3.3 樣品溶液制備：

取牡丹葉干燥樣品，粉碎后，取約1 g，精密稱定后，加無水乙醇回流提取2 h，濾渣揮盡乙醇后，再加60 ml水加熱回流提取2次，每次1 h，抽濾，合并為提取液濃縮至10 ml，加無水乙醇使含醇量達(dá)到80%，于4oC冰箱過夜醇沉。醇沉液濾過，將沉淀用無水乙醇洗滌后，干燥得到粗多糖。將粗多糖溶于熱水中，定容至25 ml，作為樣品溶液。

3.4 樣品測定方法：

精密吸取樣品溶液0.5 ml，置于10 ml比色管中，加入6%苯酚溶液0.3 ml，再加入濃硫酸1.5 ml，混勻后，沸水浴10 min，冷至室溫，以相應(yīng)的空白溶液作為空白參比，490 nm測定吸光度(A)。

4 結(jié)果與討論

4.1 線性關(guān)系考察

分別吸取的葡萄糖對照品溶液(8.15 μg/ml)，50，100，150，200，250 μl，再分別加水補(bǔ)齊至 500 μl，按照3.4項(xiàng)下的方法測定吸光度。以對照品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖的回歸方程 y=0.1648x+0.1173，R2=0.9902，結(jié)果表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在濃度0.815至4.075 μg/ml的范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖 1）。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

按照3.3和3.4項(xiàng)下的方法，取1份樣品，連續(xù)測定6次吸光度，由表1可知，RSD為0.79%，表明儀器精密度良好。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)

4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取牡丹葉適量，按照3.3項(xiàng)下的方法，分別于 0，1，2，3，4，6 h，測定吸光度，結(jié)果見表 2。由表2可知，供試品溶液在室溫下6 h穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取6份樣品，按照3.3和3.4項(xiàng)下的方法，測定吸光度，結(jié)果見表3。由表3可知，吸光度的RSD為1.25%，表明本方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱定已知含量的樣品粉末1.0 g，共六份，分別加入適量葡萄糖對照品，按照既定方法制備供試品溶液，測定吸光度，計(jì)算回收率。由表4可知，回收率RSD為2.68%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表4 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(以粗多糖計(jì))

4.6 6個不同樣品的總多糖的含量測定

按照確定方法，對6個不同產(chǎn)地的牡丹葉進(jìn)行了總多糖的含量測定，結(jié)果見表5。

表5 6種不同產(chǎn)地牡丹葉中總多糖的含量(以葡萄糖計(jì)算，μg/g)

5 討論

多糖是一種維持人體生命活動的重要的大分子物質(zhì)[6]，植物多糖具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等多種生物活性[7]，因而多糖的提取對于牡丹葉的綜合利用具有十分重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)采用無水乙醇回流法提取牡丹葉中的總多糖成分，向所得樣品溶液中加入苯酚、濃硫酸后采用紫外分光光度法分別測定六種不同產(chǎn)地的牡丹葉中總多糖的含量，以葡萄糖為對照品，測定波長為490nm，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在濃度0.815至4.075 μg/ml的范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)所建立的方法能準(zhǔn)確快速地對樣品中的總多糖進(jìn)行測定，產(chǎn)地不同，牡丹葉中總多糖含量存在差異，其中以3號樣地的牡丹葉總多糖含量最高，并且優(yōu)勢明顯，后面依次排列為為5號樣地，1號樣地，2號樣地，3號樣地，以4號樣地含量最低，提示在牡丹葉總黃酮的開發(fā)利用過程中可著重考慮3號樣地。