海金沙中非法添加檸檬黃的快速鑒別研究

王 康，郭 舟，張 勤，陳建玲，吳 競

（湖北省襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北 襄陽 441004）

海金沙為海金沙科植物海金沙Lygodium japonicum（Thunb.）Sw. 的干燥成熟孢子，有清利濕熱、通淋止痛功效，主要用于熱淋、膏淋、血淋、石淋、尿道澀痛等的治療［1］。海金沙由于藥用部位的特殊性，采收難，產(chǎn)量低，市場需求較大，導致其價格不斷上漲，由于利潤的驅(qū)使和市場監(jiān)管不到位等原因，市場上部分海金沙藥材長期存在雜質(zhì)過多、摻泥沙或其他物質(zhì)增重等質(zhì)量問題［2-3］。近年來，全國中藥材及飲片質(zhì)量分析報告和湖北省藥品質(zhì)量公告中，不合格批次較多的中藥材、飲片中屢屢出現(xiàn)海金沙，不合格項目主要為性狀、顯微鑒別和總灰分［4-6］。2019 年5 月至2020 年6 月，湖北省襄陽市藥品監(jiān)督抽檢過程中對部分海金沙藥材樣品進行薄層色譜鑒別時，發(fā)現(xiàn)其甲醇溶液呈顯著黃色，疑似非法添加了水溶性色素檸檬黃。由于2015 年版《中國藥典（一部）》海金沙項下無色素檢查項，相關(guān)的補充檢驗方法也處于空白狀態(tài)；同時，海金沙中非法添加檸檬黃色素也未見類似報道。本研究中采用水試法進行初篩、薄層色譜鑒別檢查是否非法添加檸檬黃，并采用高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法進行驗證?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀，包括SPD-M20A 型二極管陣列檢測器（日本Shimadzu 公司）；ZY-600U 型薄層色譜自動成像分析系統(tǒng)（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司）；XS205 型電子天平（精度為0.01 mg）、AL204 型電子天平（精度為0.1 mg），均購自瑞士梅特勒-托利多公司；HU-6150B 型超聲波清洗器（天津恒高電氣科技有限公司）。

1.2 試藥

檸檬黃對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為510004-202003，含量為93.4%）；硅膠G 板（青島海洋化工有限公司）；海金沙藥材9 批（來源見表1）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

表1 海金沙藥材來源Tab.1 Source of Lygodii Spora

2 方法與結(jié)果

2.1 水試法初篩

取藥材樣品1 ～9 號各5 g，分別置50 mL 燒杯中，加水40 mL，攪拌5 min，靜置10 min，濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。另取檸檬黃對照品適量，同法制備對照品溶液。上述溶液各取20 mL，置25 mL 納氏比色管中，同置白色背景前，在自然光下平視觀察，結(jié)果藥材樣品5、樣品6 供試品溶液呈現(xiàn)與對照品溶液類似且顯著的黃色，初步判斷可能非法添加了色素檸檬黃。詳見圖1。

1-9. 供試品溶液 S. 對照品溶液圖1 水試法比色圖1 -9. Test solution S.Reference solutionFig.1 Colorimetric picture of aqueous solution test

2.2 薄層色譜法檢查

取藥材樣品1 ～9 號各5 g，分別加70%乙醇40 mL，超聲（150 W，40 kHz，下同）處理20 min，離心，取上清液，得供試品溶液。另取檸檬黃對照品適量，加70%乙醇，制成質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL 的對照品溶液。照2015 年版《中國藥典（四部）》通則0502“薄層色譜法”試驗，吸取各供試品溶液和對照品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水-水（1 ∶3 ∶3 ∶1 ∶1，V／ V／ V／ V／ V）為展開劑，二次展開，取出，晾干，在可見光下檢視。結(jié)果見圖2。藥材樣品5、樣品6 供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同的黃色斑點，故判斷藥材中非法添加了色素檸檬黃。

1-9. 供試品溶液 S. 對照品溶液圖2 薄層色譜圖1 -9. Test solution S.Reference solutionFig.2 TLC chromatograms

2.3 驗證試驗

2.3.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent Eclipse XDB -C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A） -0.05 mol／L 乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0 ～30 min 時5%A→45%A，30 ～40 min 時45%A→5%A，40 ～45 min 時5%A）；流速：1.0mL／min；檢測波長：432nm；柱溫：35℃；進樣量：10μL。

2.3.2 溶液制備

取檸檬黃對照品適量，加70%乙醇制成每1 mL 約含10 μg 的對照品溶液。取高度懷疑非法添加了檸檬黃的藥材樣品5，6 各5 g，分別加70%乙醇40 mL，超聲處理20 min，離心，取上清液，得供試品溶液。取確定未添加檸檬黃的樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.3.3 測定法

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，應不得出現(xiàn)與對照品溶液色譜相同保留時間處的色譜峰；若出現(xiàn)，則采用紫外-可見分光光度法比較色譜峰在190 ～760 nm 波長范圍內(nèi)光譜的吸光度，吸光度應不相同。

2.3.4 結(jié)果判定

依法測定，結(jié)果見圖3 和圖4。樣品5、樣品6 供試品溶液色譜中，均與對照品溶液相應色譜保留時間完全相同，相應的光譜圖也完全相同，而陰性對照品溶液則無相應色譜峰。結(jié)果確證樣品5、樣品6 均添加了色素檸檬黃。

3 討論

2018 年8 月，全國范圍內(nèi)開展中藥飲片質(zhì)量集中整治后，中藥飲片的質(zhì)量有很大改善，但仍存在極少部分中藥材染色現(xiàn)象［5-6］。文獻報道發(fā)現(xiàn)有染色問題的中藥品種涉及延胡索［7］、蒲黃［8-9］、黃連［8，10］、西紅花［11］、紅花［12］、丹參［13］、黃芩［14］等，主要采用薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對藥材中的人工合成色素進行定性及定量檢測［15-16］。

1. 檸檬黃A. 對照品溶液 B. 藥材樣品5 供試品溶液 C. 藥材樣品6 供試品溶液 D. 陰性對照品溶液圖3 高效液相色譜圖1.lemon yellowA.Reference solution B.Test solution of sample Ⅴ C.Test solution of sample Ⅵ D.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

A. 對照品溶液 B. 藥材樣品5 供試品溶液 C. 藥材樣品6 供試品溶液圖4 紫外-可見吸收光譜圖A. Reference solution B.Test solution of sample Ⅴ C. Test solution of sample ⅥFig.4 UV-Vis absorption spectrograms

本研究中對海金沙采用水試法進行色素檢查初篩，該經(jīng)驗鑒別法具有操作簡單、快速、結(jié)果易判斷的特點，對于判斷海金沙是否非法添加水溶性色素檸檬黃有很好的參考價值，可在藥品監(jiān)督檢驗中更高效地發(fā)揮快速初篩作用。初篩陽性樣品需通過薄層色譜法進行進一步檢查，其操作簡單，試驗成本低，但同時檢測多種色素時分離度較差，易出現(xiàn)假陽性干擾，且靈敏度較低，不能作為確證方法。高效液相色譜法可利用色譜峰的保留時間和紫外-可見吸收光譜圖進行定性判斷，具有專屬性強、靈敏度高、分離度好的特點，可用于檸檬黃的定性確證和定量分析。

經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局批準的補充檢驗方法是非法添加色素監(jiān)督檢驗的重要依據(jù)，是中藥材染色問題監(jiān)管的重要科學手段。各級食品藥品檢驗機構(gòu)在最近10 年的監(jiān)督抽驗中，通過應用經(jīng)批準的補充檢驗方法，檢出大批量的摻假染色中藥材，有力打擊了中藥材非法添加的違法行為。鑒于海金沙尚無相關(guān)色素非法添加的檢驗方法，本研究中建立的海金沙中檸檬黃的快速檢測方法，操作簡單、快速、準確，可用于申報海金沙中檸檬黃檢查的補充檢驗方法。