單寧的血糖調(diào)節(jié)活性功能研究進(jìn)展

耿雪營,郭藏,米生權(quán),張艷貞,郭俊霞,陳文

(北京聯(lián)合大學(xué) 健康與環(huán)境學(xué)院,北京,100023)

單寧,又稱植物鞣質(zhì),是一種有鞣革性能的復(fù)雜混合物。單寧在植物界中廣泛存在,具有抗氧化、收斂、螯合等多種功能,在多領(lǐng)域均有應(yīng)用,特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域,抗腫瘤、降脂、降血糖等特性逐漸被發(fā)現(xiàn),開發(fā)前景廣闊[1]。糖尿病作為慢性病之一,越來越多的人飽受其害,國際糖尿病聯(lián)盟(The International Diabetes Federation, IDF)公布的最新數(shù)據(jù)顯示：2019年大約有4.63億成年人(20～79歲)患有糖尿病,該病的醫(yī)療支出每年大于7 600億美元,其治療費(fèi)用占成人平均每年總支出的10%[2]。對(duì)糖尿病患者的治療手段是控制血糖,減緩并發(fā)癥的發(fā)生；對(duì)非糖尿病人群分為兩種,一是預(yù)防糖尿病前期人群發(fā)展成糖尿病病人,二是避免血糖正常人群發(fā)展成糖尿病前期人群。這樣不僅可以減少醫(yī)療資源的占用率,還能降低疾病負(fù)擔(dān),促進(jìn)公眾健康,提高生活質(zhì)量。非糖尿病病人調(diào)節(jié)血糖的方法主要是通過飲食、身體活動(dòng)、服用具有血糖調(diào)節(jié)功能的生物活性物質(zhì)等。

近些年單寧在工業(yè)領(lǐng)域的研究廣泛,比如利用其吸附性能凈化水質(zhì)[3],利用其抗菌性延長食品保存[4]等。在醫(yī)藥領(lǐng)域,單寧抗癌抗腫瘤的研究比較多,且不斷有新的進(jìn)展[5],但關(guān)于其降血糖作用的綜述較匱乏,因此本文綜述了國內(nèi)外單寧調(diào)節(jié)血糖的相關(guān)實(shí)驗(yàn)及進(jìn)展。

1 單寧簡介

單寧存在于某些植物的干、皮、根、莖、葉、果實(shí)及果殼中,味澀略酸,可溶于水、乙醇、丙酮等,分子質(zhì)量約為500～3 000 Da,分子結(jié)構(gòu)見圖1[6]。單寧中存在大量酚羥基,化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有數(shù)個(gè)酚羥基的苯核,因此活性較強(qiáng),按照結(jié)構(gòu)不同可以分為水解單寧、縮合單寧和復(fù)合單寧三大類,水解單寧又包括棓單寧和鞣花單寧,含有酯鍵,在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或某些酶的作用下可水解生成酸類和醇類；縮合單寧又稱原花青素,核心結(jié)構(gòu)是黃烷醇,不易水解；因復(fù)合單寧的結(jié)構(gòu)中含有酯鍵和黃烷醇,被認(rèn)為是前兩類的復(fù)合物[7-8]。根據(jù)單寧加熱到180～200 ℃時(shí)所得的產(chǎn)物可分為(1)沒食類單寧,加熱所得產(chǎn)物中含焦棓酸(焦性沒食子酸),大部分水解類單寧具有焦棓酸類的特性,如橡椀、栗木等所含的單寧；(2)兒茶類單寧,加熱所得產(chǎn)物中含焦兒茶酚,大部分縮合類單寧具有焦兒茶酚的特性,如堅(jiān)木、栲樹皮等所含的單寧。

a-水解單寧;b-縮合單寧圖1 水解單寧和縮合單寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of hydrolysable tannin and condensed tannin

2 植物單寧的提取與制備

植物單寧的提取方法有很多,常見的有浸提法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界CO2萃取法和酶轉(zhuǎn)化提取法,對(duì)于不同的植物,其最佳提取率參數(shù)條件也不同。浸提法利用有機(jī)溶劑溶解單寧,成本低,適合工業(yè)生產(chǎn),是最常使用的提取技術(shù)；微波輔助提取法的原理是使細(xì)胞熱膨脹破裂,主要用于實(shí)驗(yàn)室樣品預(yù)處理；超聲波輔助提取法通過破壞細(xì)胞壁提高單寧提取率,和超臨界CO2萃取法一并得到醫(yī)藥、食品領(lǐng)域的青睞；從目前研究看,酶轉(zhuǎn)化法耗時(shí)長,產(chǎn)率低,實(shí)際應(yīng)用還需研究[9]。另外還有超高壓提取法、膜技術(shù)提取法、半仿生提取法、發(fā)酵法等提取方法,均可以大大提高單寧提取率,但同時(shí)存在不足之處,如發(fā)酵法耗時(shí)長等[10]。通常提取到的單寧是粗單寧,可以通過活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法、膜分離法等進(jìn)行純化,活性炭吸附法成本低,但純化能力有限；大孔樹脂吸附及膜分離法使用較多,但大孔樹脂吸附仍需再生處理；而采用膜分離法得到的單寧純化效率及品質(zhì)較高[11]。

單寧具有抗氧化、收斂、螯合、抑菌、除垢等多種作用,可用作鞣革、墨水制造、紙張、絲綢、鍋爐除垢、媒染劑、啤酒和葡萄酒的澄明劑、橡膠的凝結(jié)劑等,在食品、日化、水、農(nóng)業(yè)、傳統(tǒng)工業(yè)等領(lǐng)域得到了有效且廣泛的應(yīng)用[12]。同時(shí),單寧也擁有多種生物學(xué)活性,對(duì)于葡萄糖代謝及血糖調(diào)節(jié)具有重要作用。

3 單寧的調(diào)節(jié)血糖作用

單寧對(duì)血糖的調(diào)節(jié)作用在細(xì)胞水平、動(dòng)物水平都有研究,以脂肪細(xì)胞、小鼠、大鼠、幼豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,結(jié)果表明單寧可以降低血糖含量。

有研究者用3T3-L1細(xì)胞證明單寧可以促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[13],其葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,添加去除單寧的大花紫薇提取物的3T3-L1細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收量與對(duì)照組細(xì)胞無顯著差異,但與添加大花紫薇提取物組的吸收量相比顯著下降,另外添加20 mg/L單寧酸的3T3-L1細(xì)胞的葡萄糖攝取量顯著高于對(duì)照組,并且與添加大花紫薇提取物組的吸收量無顯著差異,同等作用時(shí)間下,多項(xiàng)對(duì)比說明單寧的存在加速了3T3-L1細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。此外,隨著胰島素作用濃度的增大,細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量呈先增加后減少的趨勢,而單寧對(duì)葡萄糖攝取量的影響和胰島素相似,在單寧質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí),葡萄糖攝取量達(dá)到頂峰,說明高濃度的單寧不一定促進(jìn)葡萄糖的吸收,單寧劑量需適當(dāng)。這與另一學(xué)者的研究結(jié)果有對(duì)應(yīng)之處,幼豬在食用含單寧的高粱經(jīng)一段時(shí)間后,高單寧含量組動(dòng)物血液中的葡萄糖含量低于低含量單寧組,表示與單寧含量高的高粱品種相比,幼豬對(duì)單寧含量低的高粱品種的利用率更高[14]。TEIXEIRA等[15]也發(fā)現(xiàn)含單寧的高粱可以降低成年犬?dāng)z入食物的能量利用率。

魏海峰等[16]、曲萌等[17]采用鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,探究單寧的作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,單寧顯著降低糖尿病大鼠的血糖水平,改善其腎臟功能和形態(tài)學(xué)異常,這可能與抑制腎臟多(二磷酸腺苷-核糖)多聚酶的表達(dá)有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)一種摩洛哥菊科植物的鞣質(zhì)、聚果榕單寧均可以降低糖尿病大鼠的高血糖水平,改善肝臟、胰腺病變,提高心臟和腎臟的SOD水平,提高心臟、腎臟、肝臟的過氧化氫酶水平[18-19]。

虎杖是一種具有活血止痛功效的中藥,臨床應(yīng)用廣泛。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)虎杖鞣質(zhì)經(jīng)浸提純化后,灌胃給四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠,其空腹血糖含量降至6.85 mmol/L,表明虎杖鞣質(zhì)具有降血糖作用[20]。采用溶液浸提和超聲波輔助提取油茶果殼中的鞣質(zhì),以400 mg/kg的劑量連續(xù)灌胃糖尿病小鼠8 d后,該組小鼠的空腹血糖水平顯著低于模型組小鼠[21]。

基于上述研究可以看到,單寧具有降低血糖的作用,并且還會(huì)影響食物利用率[22-23]、緩解器官組織病變[24]、提高機(jī)體抗氧化水平等[25]。

4 單寧的血糖調(diào)節(jié)機(jī)制

根據(jù)糖的來源和去路,單寧對(duì)血糖的調(diào)節(jié)可分為兩個(gè)部分。一部分調(diào)節(jié)是在食物被分解成葡萄糖前,抑制食物分解成葡萄糖的速度,比如抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性；另一部分調(diào)節(jié)是在食物被分解成葡萄糖后,加速葡萄糖的攝取、儲(chǔ)存,抑制葡萄糖的生成。后者又可以分為胰島素作用和糖代謝兩個(gè)部分,比如促進(jìn)胰島素信號(hào)分子的表達(dá),調(diào)節(jié)糖代謝過程中酶的表達(dá)等。

4.1 單寧抑制食物分解及吸收率

4.1.1 抑制α-葡萄糖苷酶的活性

α-葡萄糖苷酶是分解碳水化合物最后一步的關(guān)鍵酶,抑制α-葡萄糖苷酶的活性就可以延緩碳水化合物的釋放,降低機(jī)體血糖值[26],因此,α-葡萄糖苷酶被認(rèn)為是糖尿病候選藥物的重要靶標(biāo)[27]。實(shí)驗(yàn)顯示單寧是良好的α-葡萄糖苷酶抑制劑[18]。

體外實(shí)驗(yàn)顯示,葡萄籽提取物(主要成分是縮合單寧)可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性。CHEN等[29]用4-硝基苯基-a-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG)作為底物,與α-葡萄糖苷酶、葡萄籽提取物作用15 min后,于405 nm波長處測量吸光值,結(jié)果顯示普通提取法和微波萃取法得到的提取物都可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性,并且與阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制性無顯著差異。疏花衛(wèi)矛中分離的縮合單寧抑制α-葡萄糖苷酶的活性水平(IC50值約為0.083 μg/mL)遠(yuǎn)高于阿卡波糖(IC50值約為1 345 μg/mL),并且老鼠經(jīng)口服可以顯著降低體內(nèi)血糖含量,提示縮合單寧有良好的降血糖作用[30]。生物活性分析顯示,香榧仁提取物的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力(IC50=0.14 mg/mL)高于陽性對(duì)照品阿卡波糖(IC50=1.29 mg/mL),發(fā)揮抑制性的物質(zhì)主要是黃酮和縮合單寧[31]。蓮蓬殼提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力(IC50=15.18 μg/mL)遠(yuǎn)高于阿卡波糖(IC50=1 290 μg/mL),而縮合單寧也是蓮蓬殼提取物中發(fā)揮抑制作用的成分之一[32]。

夏櫟[33]、歐洲栗[34]、堅(jiān)木[35]中的單寧粗提物都表現(xiàn)出良好地抑制α-葡萄糖苷酶的活性,堅(jiān)木單寧洗脫分離出的2種組分的抑制力是阿卡波糖的10倍以上,經(jīng)鑒定包括水解單寧、縮合單寧、沒食子酸及其他物質(zhì),在夏櫟中分析得到發(fā)揮作用的主要成分是栗木鞣花素。單寧對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理還未明確,像水蒿根中的提取物[36]、齊墩果酸和熊果酸[37]、2,4-二羥基-5-甲基苯乙酮3[38]的衍生物等是通過與α-葡萄糖苷酶結(jié)合,改變了α-葡萄糖苷酶的二級(jí)結(jié)構(gòu),進(jìn)而抑制α-葡萄糖苷酶活性,而柿單寧[39]能改變?chǔ)?葡萄糖苷酶的α-螺旋、β-折疊、β-反折疊含量,因此,單寧是通過與α-葡萄糖苷酶結(jié)合影響酶結(jié)構(gòu)從而達(dá)到抑制性。

α-葡萄糖苷酶抑制劑在治療糖尿病領(lǐng)域已經(jīng)得到臨床應(yīng)用,如伏格列波糖、阿卡波糖,但由于其伴有胃腸道副作用,因而具有局限性。開發(fā)天然來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑是今后的研究熱點(diǎn)[40],而具有抑制活性的單寧在該領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景。

4.1.2 抑制α-淀粉酶的活性

在早年的研究中,皮馬印第安人傳統(tǒng)主食包括玉米、青豆、黃白皮、牧豆樹和橡子,外國學(xué)者發(fā)現(xiàn)食用這些食物后的志愿者體內(nèi)血糖指數(shù)(glycemic index,GI)均較低,這些食物的淀粉消化率比面包低得多,其中橡子的淀粉消化率最低[41],推測是橡子中的單寧減緩淀粉的消化率,使得GI較低,這對(duì)后來單寧降低血糖機(jī)制的研究提供了參考。近年來有實(shí)驗(yàn)表明柿單寧可以降低淀粉的酶解率,其抑制作用隨著直鏈淀粉含量的增加而增強(qiáng),并且等量的柿單寧對(duì)低、中、高含量直鏈淀粉引起血糖升高的抑制作用越來越強(qiáng),說明柿單寧還通過抑制直鏈淀粉分解來降低淀粉消化率,從而延緩血糖值的升高[39]。

α-淀粉酶是機(jī)體吸收碳水化合物的關(guān)鍵酶,研究發(fā)現(xiàn)單寧可以抑制其活性,達(dá)到降低血糖的目的。甲醇溶液提取柿單寧后烘干制成粉末加入反應(yīng)體系,通過測量可溶性淀粉中低聚糖的釋放率,分析柿單寧是否能抑制α-淀粉酶的活性,結(jié)果顯示,柿單寧能抑制α-淀粉酶的活性且呈劑量依賴性,適宜pH為5～8.5,另外在同等用量下,柿單寧抑制α-淀粉酶的活性(IC50=1.70 g/mL)遠(yuǎn)高于五倍子酸、兒茶素[42]。堅(jiān)木單寧也可以抑制α-淀粉酶的活性[28],但有實(shí)驗(yàn)表示相同濃度的虎杖單寧可以抑制α-D-葡萄糖苷酶、蔗糖酶等的活性,并不會(huì)抑制α-淀粉酶的活性,極高濃度的虎杖單寧對(duì)α-淀粉酶的影響也微乎其微[43]。兩者實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不同的,推測不同原材料的單寧提取物中的單寧含量差異大,或者單寧種類不同,對(duì)α-淀粉酶的影響不同。

單寧抑制α-淀粉酶活性的作用機(jī)制可能是與α-淀粉酶發(fā)生相互作用,改變?chǔ)?淀粉酶的結(jié)構(gòu)。紅外光譜分析,柿單寧的存在可以增加α-淀粉酶中的α-螺旋含量,降低β-轉(zhuǎn)角含量[39],這與單寧對(duì)α-葡萄糖苷酶的作用相似。因此,單寧作為良好的α-淀粉酶抑制劑,可以有效控制血糖,通過延緩碳水化合物的吸收調(diào)節(jié)血糖水平。

4.2 單寧對(duì)胰島素信號(hào)分子的調(diào)節(jié)

4.2.1 促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)

胰島素分泌不足或胰島素抵抗是引起糖尿病的主要病因,激素是血糖調(diào)節(jié)的重要途徑,胰島素是降低血糖的唯一激素。LIU等[13]研究顯示,單寧對(duì)胰島素受體缺陷細(xì)胞的葡萄糖攝入量沒有影響,會(huì)通過胰島素的介導(dǎo)刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。葡萄糖轉(zhuǎn)化成糖原儲(chǔ)存是血糖水平降低的途徑之一,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)是胰島素介導(dǎo)的肌糖原轉(zhuǎn)化過程中的重要蛋白,也是維持機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)的重要因子[44]。在乙醇造成的大鼠骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗中,GLUT4受到下調(diào)[45]。在脂肪細(xì)胞中添加GLUT4的阻斷劑細(xì)胞松弛素,發(fā)現(xiàn)單寧+阻斷劑組的葡萄糖攝取量比單寧組的葡萄糖攝取量顯著下降,經(jīng)免疫染色觀察,發(fā)現(xiàn)未添加阻斷劑組細(xì)胞周圍的GLUT4含量明顯高于含阻斷劑組[13]。由此可見,單寧可以通過提高GLUT4的水平增加脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取量,進(jìn)而調(diào)節(jié)血糖水平。

在胰島素向GLUT4傳遞信號(hào)的過程中,涉及到胰島素受體底物蛋白-1(insulin receptor substrate,IRS-1)、磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)、Akt、aPKC(atypical PKC,非典型蛋白激酶C)等蛋白[44]。Western-blot也顯示單寧處理3T3-L1細(xì)胞后,胰島素受體和Akt磷酸化增加[13]。另外在沒食子酸緩解高果糖飲食誘發(fā)的大鼠胰島素抵抗中,大鼠肝臟內(nèi)的胰島素受體(insulin receptor,IR)、IRS-1、PI3K、Akt/PKB、GLUT2含量均增加[46]。這為單寧調(diào)節(jié)血糖的分子水平研究提供了方向。

4.2.2 促進(jìn)酪氨酸蛋白磷酸化水平

酪氨酸激酶既可以作為胰島素受體,又可以作為酶發(fā)揮作用。在探究單寧對(duì)葡萄糖攝取量影響的實(shí)驗(yàn)中,加入酪氨酸激酶抑制劑后,葡萄糖攝入量減少,說明酪氨酸激酶抑制劑影響了單寧的活性,提示酪氨酸激酶參與了單寧對(duì)血糖的調(diào)節(jié)。酪氨酸磷酸酶與酪氨酸激酶共同調(diào)節(jié)酪氨酸蛋白磷酸化水平,蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase-1B,PTP1B)是酪氨酸磷酸酶家族成員之一,對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié),是近年來抗糖尿病藥物研發(fā)的重要機(jī)制之一[47]。MUTHUSAMY等[48]證實(shí)了菊苣中的單寧是通過抑制PTP1B的活性促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,另外土肉桂的嫩枝粗提物具有抗高血糖的活性,用不同溶劑從其中分別萃取出4種物質(zhì),正己烷萃取得到的原花青素含量最高為561.1 mg/g,對(duì)PTP1B的抑制力最強(qiáng),高于對(duì)照組烏索酸[49],說明單寧可能抑制PTP1B活性來降低血糖水平。

5 展望

從已有研究看,單寧在細(xì)胞、動(dòng)物水平具有明確的降低血糖的作用,但在分子水平上研究不足,尤其是胰島素信號(hào)分子、糖代謝方向及其分子機(jī)制還有很大的探究空間。目前報(bào)道的單寧調(diào)節(jié)血糖的途徑并不是單一的,主要有3個(gè)調(diào)節(jié)機(jī)制：抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性,影響食物中碳水化合物分解,延緩碳水化合物的吸收率；促進(jìn)GLUT4的表達(dá),提高體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力,改善胰島素抵抗；激活酪氨酸激酶活性,影響酪氨酸蛋白磷酸化水平,促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取能力。除此以外,葡萄糖在機(jī)體內(nèi)的代謝也會(huì)影響血糖水平,如糖酵解、糖異生、糖原的合成與分解,干預(yù)糖異生和糖原分解的過程均可以延緩機(jī)體血糖水平的升高,但單寧對(duì)糖酵解、糖異生途徑的影響研究較為有限。HUANG等[46]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沒食子酸可以促進(jìn)胰島素抵抗小鼠肝臟中糖酵解限速酶己糖激酶和磷酸果糖激酶、糖原合成酶的表達(dá),抑制肝臟糖異生過程中1,6-二磷酸果糖激酶的表達(dá),單寧同樣具有降低血糖的作用,對(duì)糖異生、糖酵解可能也有影響,這也是接下來研究的方向之一。此外,單寧是抗?fàn)I養(yǎng)因子[50],具有較強(qiáng)的胃腸副作用,在調(diào)節(jié)血糖同時(shí)還具有抑制酶活性等功能,導(dǎo)致機(jī)體不適,因此需明確合適的劑量范圍,使單寧在調(diào)節(jié)血糖的同時(shí)不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。