基于核酸適配體識(shí)別-時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)牛奶中培氟沙星獸藥殘留

宋亞寧,胡超瓊,霍秋宇,王力均,2,陳祥貴,2,黃玉坤,2*

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,四川 成都,610039) 2(宜賓西華大學(xué)研究院,食品非熱加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品非熱加工工程技術(shù)研究中心,四川 宜賓,644004)

培氟沙星(pefloxacin,PEF)是一類人工合成的氟喹諾酮類抗生素,對(duì)陰性菌和陽(yáng)性菌表現(xiàn)出抗菌活性[1],常應(yīng)用于漁業(yè)、畜牧業(yè)等[2],當(dāng)其含量超過(guò)閾值時(shí),會(huì)對(duì)人體健康造成危害[1-3]。2015年9月,我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布公告停止食品動(dòng)物中使用PEF、洛美沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥[4]。目前,針對(duì)PEF等氟喹諾酮類獸藥殘留的檢測(cè)方法主要有微生物法[5]、免疫分析法[6-8]、色譜法[9-10]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-13]以及其他新型檢測(cè)方法等[14-17]。但這些方法存在靈敏度低、特異性差、設(shè)備昂貴、樣品預(yù)處理復(fù)雜且檢測(cè)費(fèi)時(shí)、成本高等缺陷,不能較好地滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)樣品的要求[18-19]。因此,建立高效、快速及可靠的檢測(cè)方法,不僅有利于減少檢測(cè)成本,也可滿足動(dòng)物食品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。

核酸適配體(aptamer,Apt)是通過(guò)指數(shù)富集篩選配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)從人工構(gòu)建的寡核苷酸文庫(kù)中篩選出來(lái)的一段對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)有高親和力并能夠特異性識(shí)別的單鏈寡核苷酸序列[20-22],因其與抗體有相似之處,又稱“化學(xué)抗體”[23]。適配體可以特定的三維構(gòu)象結(jié)合靶標(biāo)而檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)[24],具有親和力高、特異性強(qiáng)、靶分子范圍廣、易于制備和修飾、穩(wěn)定性好等顯著優(yōu)點(diǎn)[25]。近年來(lái),基于抗體抗原的酶聯(lián)免疫法檢測(cè)氟喹諾酮類獸藥殘留的方法多有報(bào)道,樊曉博等[26]制備了恩諾沙星抗體,建立了檢測(cè)多種畜禽產(chǎn)品中12種氟喹諾酮藥物的方法。CHEN等[27]建立了間接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫分析法,可同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物可食組織中的24種喹諾酮類藥物。雖然,基于抗體的檢測(cè)具有特異性高、操作簡(jiǎn)單、可同時(shí)處理多批樣品及實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)等多項(xiàng)優(yōu)勢(shì),但依然存在靶標(biāo)的抗體難以制備、無(wú)法多次重復(fù)測(cè)定、對(duì)檢測(cè)操作環(huán)境要求高等問(wèn)題[18]。Apt具有可體外合成、特異性高、專一性強(qiáng)等良好特性,可彌補(bǔ)基于抗原抗體的酶聯(lián)免疫法檢測(cè)靶標(biāo)的缺陷。目前基于Apt檢測(cè)恩諾沙星[28-29]、氧氟沙星[30]報(bào)道較多,其他氟喹諾酮類獸藥的檢測(cè)報(bào)道較少[31]。此外，核酸適配體技術(shù)結(jié)合時(shí)間分辨熒光(time-resolved fluorescence,TRF)分析技術(shù)構(gòu)建檢測(cè)體系，有利于消除樣品及環(huán)境中熒光物質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏性[9,24]。

因此,基于Apt和TRF的優(yōu)勢(shì),即核酸適配體可特異性識(shí)別靶標(biāo)PEF以及可體外合成、長(zhǎng)期保存,TRF材料可消除樣品及環(huán)境中熒光物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響。本文擬利用適配體生物識(shí)別PEF的特性,合成TRF納米材料NaYF4:Ce/Tb并構(gòu)建時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(time-resolved fluorescence resonance energy transfer,TR-FRET)模式,建立一種可應(yīng)用于牛奶樣品中準(zhǔn)確、高效并可完成1～2 h的PEF獸藥殘留檢測(cè)的新型熒光分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Y(NO3)3·6H2O、Ce(NO3)3·6H2O、Tb(NO3)3·5H2O、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、親和素、氨芐青霉素鈉鹽,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；O-磷酸乙醇胺(O-phosphorylethanolamine,AEP),梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；氯金酸、PEF、恩諾沙星,上海市阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二醇、戊二醛水溶液(體積分?jǐn)?shù)25%)、NaCl等,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(中國(guó)上海)；磺胺甲惡唑,華夏化學(xué)試劑有限公司；農(nóng)業(yè)硫酸鏈霉素,石家莊通泰生化總廠；純牛奶,本地超市。

PEF適配體序列參考REINEMANN等[31]的報(bào)道,為5′-biotin-ATACCAGCTTATTCAATTAGTTGTGTATTGAGGTTTGATCTAGGCATAGTCAACAGAGCAC-GATCGATCTGGCTTGTTCTACAATCGTAATCAGTTAG-3′；PEF適配體及互補(bǔ)鏈(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA)序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

激光粒度儀(ZSN3600),英國(guó)馬爾文儀器有限公司；熒光光譜儀(FLUOROMAX-4CP),美國(guó)HORIBA公司；雙束紫外分光光度計(jì)(SDPTOP UV2800PC),上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；小型高速離心機(jī)(5424),德國(guó)Eppendorf股份公司；真空干燥箱(BZF-50),上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；純水/超純水一體機(jī)(Direct-Q),美國(guó)Millipore公司；水熱合成反應(yīng)釜(YH-50),上海越眾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 適配體與靶標(biāo)PEF分子對(duì)接分析

根據(jù)ZYKER[32]的方法,使用基于web服務(wù)器Mfold工具、3 dRNA工具、AutoDock軟件和Discovery Studio軟件進(jìn)行分子對(duì)接分析,從而確定適配體互補(bǔ)鏈cDNA的序列。

1.3.2 制備NaYF4:Ce/Tb納米顆粒

參考TU等[33]方法合成NaYF4:Ce/Tb的納米材料。在圓底燒瓶中加入1.0 mmol AEP及一定化學(xué)計(jì)量比的NaCl、Y(NO3)3·6H2O、Ce(NO3)3·6H2O和Tb(NO3)3·5H2O,并與含有適量NH4F的乙二醇溶液溶解后老化30 min,轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜于180 ℃反應(yīng)4 h,取出自然冷卻至室溫。洗滌后于60 ℃真空干燥箱干燥10 h,固體顆粒室溫避光封閉保存。

1.3.3 親和素修飾NaYF4:Ce/Tb納米顆粒的制備

利用經(jīng)典戊二醛法偶聯(lián)親和素與NaYF4:Ce/Tb表面的氨基[34]。稱取一定量納米顆粒分散于磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)中與適量戊二醛水溶液反應(yīng),洗滌后加入一定量親和素于37 ℃連續(xù)過(guò)夜,反應(yīng)后用PBS洗滌3次。最后重懸于PBS中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 組裝Apt-NaYF4:Ce/Tb納米顆粒

將定量的適配體加入親和素化納米顆粒懸浮液中,于37 ℃緩慢振蕩孵育3 h,反應(yīng)結(jié)束后用PBS離心洗滌3次,重懸于PBS中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 制備納米金

將氯金酸溶液和超純水加入圓底燒瓶進(jìn)行磁力攪拌煮沸,加入4 mL檸檬酸鈉。反應(yīng)保持沸騰持續(xù)攪拌20 min,得到酒紅色溶液,冷卻后待用。

1.3.6 構(gòu)建基于TR-FRET檢測(cè)PEF的方法

在檢測(cè)體系中,以一定濃度熒光探針檢測(cè)不同濃度的PEF溶液。在1 mL結(jié)合緩沖液(100 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L CaCl2,pH 7.6)中加入靶標(biāo)PEF并與熒光檢測(cè)探針于21 ℃ 振搖孵育1 h,反應(yīng)后測(cè)定溶液的TRF強(qiáng)度。設(shè)定測(cè)定條件為：激發(fā)波長(zhǎng)252 nm,延遲時(shí)間0.1 ms,檢測(cè)時(shí)間1 ms。

1.3.7 基于TR-FRET檢測(cè)PEF測(cè)定牛奶樣品中PEF

將此檢測(cè)方法應(yīng)用于實(shí)際食品樣品中PEF的定量檢測(cè),并對(duì)此方法的分析性能進(jìn)行探索。牛奶樣品處理具體步驟如下：將PEF標(biāo)準(zhǔn)品用純牛奶進(jìn)行溶解,在室溫4 000×g離心20 min,去除牛奶樣品的上層脂肪層,將加標(biāo)的牛奶樣品用結(jié)合緩沖液進(jìn)行10倍稀釋,加以空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)原理

檢測(cè)PEF的原理如圖1所示。首先分別將能特異性識(shí)別PEF的適配體與NaYF4∶Ce/Tb連接、將cDNA與納米金連接獲取2種材料,后將這2種材料通過(guò)核酸序列互補(bǔ)雜交獲得檢測(cè)探針。檢測(cè)探針中的納米金與NaYF4∶Ce/Tb距離靠近時(shí)引起熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,導(dǎo)致檢測(cè)體系中熒光信號(hào)淬滅；加入靶標(biāo)PEF時(shí),靶標(biāo)PEF會(huì)與cDNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適配體,但適配體會(huì)優(yōu)先與靶標(biāo)PEF特異性結(jié)合,使得納米金與熒光材料脫離,引起檢測(cè)體系中熒光信號(hào)恢復(fù),最終通過(guò)檢測(cè)時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度與PEF濃度進(jìn)行線性分析,測(cè)定靶標(biāo)PEF的濃度。

圖1 基于核酸適配體識(shí)別-時(shí)間分辨熒光檢測(cè)PEF原理圖Fig.1 Schematic diagram of PEF based on aptamer recognition-TRPL detection

2.2 適配體與PEF分子對(duì)接分析

根據(jù)步驟1.3.1描述的工具模擬獲得PEF適配體的二級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)(圖2-a)。利用AutoDock、Discovery Studio軟件對(duì)適配體和PEF進(jìn)行分子對(duì)接,其關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)如圖2-b所示,主要集中在適配體的莖環(huán)及長(zhǎng)莖區(qū)域(圖2-a紅框示意)。因此根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理,設(shè)計(jì)得到適配體互補(bǔ)鏈cDNA序列為5′-TTA CGA TTG TAG A-3′。

圖2 適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖(a)與適配體與PEF分子對(duì)接示意圖(b)Fig.2 Secondary structure prediction diagram of aptamer(a) and docking diagram of aptamer with PEF molecular(b)

2.3 納米材料及其表面功能化的表征

本實(shí)驗(yàn)采用溶劑熱法,以AEP為表面活性劑和封端劑,在控制納米顆粒材料生長(zhǎng)的同時(shí),使納米顆粒材料表面氨基功能化,得到TRF納米顆粒材料NaYF4∶Ce/Tb。如圖3-a所示,該熒光材料的衰減時(shí)間為(8.96±0.09) ms。在252 nm波長(zhǎng)紫外激發(fā)下,納米材料NaYF4∶Ce/Tb的熒光為綠色,NaYF4∶Ce/Tb的熒光光譜如圖3-b所示,在543、583和620 nm處有較強(qiáng)發(fā)射譜峰,最大發(fā)射波長(zhǎng)為543 nm,因此本實(shí)驗(yàn)選取發(fā)射波長(zhǎng)543 nm處熒光作為檢測(cè)信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)采用透射電子顯微鏡、X射線衍射儀以及紫外分光光譜儀(UV-visible spectrophotometer,UV-vis)對(duì)熒光納米顆粒的形貌、晶型結(jié)構(gòu)以及親和素修飾的完成度進(jìn)行表征。由圖3-e可知,透射電鏡圖表明合成的熒光納米顆粒形貌基本呈球狀,分散均勻。利用X射線衍射技術(shù)對(duì)熒光納米顆粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,圖3-c得出采用溶劑熱法制備的熒光納米材料具有純立方相結(jié)構(gòu)。由圖3-d可看出,NaYF4∶Ce/Tb在親和素修飾后280 nm處的吸收度較修飾前減弱,表明親和素修飾NaYF4∶Ce/Tb完成。

2.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

TRF納米材料與納米金因適配體與cDNA的互補(bǔ)配對(duì)而拉近,發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致熒光淬滅,加入靶標(biāo)PEF后熒光恢復(fù),從而完成PEF目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè),因此,本實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化主要針對(duì)納米金與互補(bǔ)鏈比例以及適配體與互補(bǔ)鏈比例,結(jié)果如圖4-a所示。當(dāng)cDNA∶納米金為150∶1時(shí),NaYF4∶Ce/Tb的熒光強(qiáng)度在543 nm處的熒光減弱,淬滅效果最優(yōu)且趨于穩(wěn)定,因此選擇cDNA∶納米金最佳比例為150∶1。圖4-b表明,當(dāng)cDNA加入量為140 pmol時(shí)熒光淬滅最強(qiáng),選擇探針組裝最佳用量為140 pmol。但隨著cDNA濃度逐漸增大,熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先上升后又下降的趨勢(shì),原因可能是反應(yīng)體系后期受到納米金表面空間條件的限制,過(guò)量的cDNA會(huì)直接與適配體

a-時(shí)間分辨熒光材料壽命圖；b-時(shí)間分辨熒光光譜；c-X射線衍射圖；d-親和素功能化前后UV-Vis光譜圖；e-透射電鏡圖圖3 NaYF4∶Ce/Tb納米材料及功能化表征Fig.3 NaYF4∶Ce/Tb functionalized characterization

堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度又降低。

a-cDNA與納米金比例優(yōu)化;b-適配體與互補(bǔ)鏈比例優(yōu)化圖4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of experimental conditions

2.5 特異性分析

基于適配體特異性結(jié)合靶標(biāo)PEF的特點(diǎn),選取PEF及其他6種抗生素(質(zhì)量濃度均為1 mg/mL),包括磺胺甲惡唑、農(nóng)用硫酸鏈霉素、氨芐青霉素鈉、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星和恩諾沙星,離心取上清液測(cè)定其熒光強(qiáng)度,判斷建立的基于TRF結(jié)合納米金法檢測(cè)PEF的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,在相同濃度下,7種抗生素所引起的熒光強(qiáng)度的變化明顯不同,其中PEF的相對(duì)熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于磺胺甲惡唑、農(nóng)用硫酸鏈霉素和氨芐青霉素鈉的強(qiáng)度。如果設(shè)定PEF響應(yīng)值為100%,則PEF的同屬氟喹諾酮類獸藥環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為PEF的9.73%、12.57%和12.71%,相較于PEF,環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星引起的熒光信號(hào)變化較小,基本可以忽略。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法選擇性良好,可應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)。

圖5 本方法特異性分析Fig.5 Specificity analysis of the present detection

2.6 建立PEF檢測(cè)方法的工作曲線

在優(yōu)化的最佳試驗(yàn)條件下,將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEF加入反應(yīng)體系中,如圖6-a所示,隨著PEF添加量的增加,相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸增加。因此可利用PEF添加量與相對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行線性回歸擬合,3倍信噪比法測(cè)得檢測(cè)限。如圖6-b所示,當(dāng)ω(PEF)在0.2～20 μg/kg時(shí),相對(duì)熒光強(qiáng)度與ω(PEF)正相關(guān),其線性回歸方程為y=1 567.3x+3 956.3,相關(guān)系數(shù)為R2=0.974 2,檢測(cè)限為0.15 μg/kg。

a-PEF不同添加量體系的熒光強(qiáng)度;b-測(cè)定PEF的工作曲線圖6 建立檢測(cè)PEF的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Establishment of standard curve for detection of PEF

2.7 在純牛奶中的PEF檢測(cè)回收率

為驗(yàn)證本方法在實(shí)際樣品中應(yīng)用的準(zhǔn)確性,將此法用于檢測(cè)牛奶樣品中的PEF。采用步驟1.3.7進(jìn)行樣品預(yù)處理后,向牛奶樣品中分別加入1、5、15 μg/kg的PEF標(biāo)準(zhǔn)品液,每個(gè)添加量平行樣品測(cè)定3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,PEF加標(biāo)回收率在73.81%～99.86%,表明本法檢測(cè)牛奶中PEF準(zhǔn)確性較好,可應(yīng)用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

表1 牛奶中PEF的加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果Table 2 Recovery of PEF added in milk

2.8 與其他方法的比較

本方法構(gòu)建的PEF檢測(cè)體系得到的PEF檢測(cè)限為0.15 μg/kg,線性范圍為0.2～20 μg/kg,測(cè)得牛奶中PEF殘留加標(biāo)回收率為73.81%～99.86%。與表2中其他方法相比,本方法具有線性范圍較寬、檢測(cè)靈敏度較高的特點(diǎn)。同時(shí),基于此研究基礎(chǔ)上,可以拓寬至建立多種靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的體系,達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)低成本快速檢測(cè)的目標(biāo),可以更加有效地應(yīng)用于食品中獸藥殘留檢測(cè)。

表2 常見檢測(cè)PEF的方法Table 2 Common methods for the detection of PEF

3 結(jié)論

本文采用溶劑熱法合成了氨基化的熒光納米顆粒(NaYF4∶Ce/Tb),利用靶標(biāo)PEF與cDNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適配體的原理,使得淬滅的熒光恢復(fù)達(dá)到檢測(cè)PEF的目的。在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下,PEF的檢測(cè)線性范圍為0.2～20 μg/kg,相關(guān)系數(shù)R2為0.974 2。采用本方法對(duì)實(shí)際樣品牛奶中的PEF進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn),PEF的加標(biāo)回收率在73.81%～99.86%,結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度較高。另外,利用本方法檢測(cè)PEF時(shí),從樣品制備至完成檢測(cè)共需1～2 h,所需檢測(cè)時(shí)間短,可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。本研究建立了基于分子親和識(shí)別的新型熒光發(fā)光檢測(cè)方法,該方法的準(zhǔn)確度較高且成本低,但本研究還有需完善和發(fā)展的空間。由于適配體具有特異性且可體外合成,在檢測(cè)中可嘗試改變適配體來(lái)檢測(cè)多種靶標(biāo)物質(zhì)。本方法中利用的適配體與cDNA連接實(shí)現(xiàn)熒光淬滅原理可延伸到建立廣譜性的適配體探針,以此拓寬本方法檢測(cè)目標(biāo)范圍,從而達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)低成本快速檢測(cè)的目標(biāo),更好地應(yīng)用于獸藥殘留的檢測(cè)。