鄂植8號(hào)、皮瓜爾油橄欖葉提取物對(duì)高血脂小鼠降血脂功效研究

王仲明, 謝躍杰, 李永紅,魏華恒,邢巧,陳聰,成欣咸,王強(qiáng)*

1(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,重慶,400067) 2(重慶第二師范學(xué)院 脂質(zhì)資源利用及兒童日化產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶,400067)

油橄欖(OleaeuropaeaL.),屬于木犀科(Oleaceae)木犀欖屬品種之一,富含各種營養(yǎng)物質(zhì),為亞熱帶常綠喬木,主要分布在地中海沿岸地區(qū)。油橄欖距今已有4 000多年的栽培歷史，20世紀(jì)中期,我國開始進(jìn)行油橄欖的引種栽培,主要種植于湖北、云南、甘肅、四川等地區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國已種植油橄欖5.3萬 hm2[1],油橄欖總資源超過170余份[2]。在地中海國家,橄欖葉的“煎服”常作為民間用藥[3],研究證明油橄欖葉提取物可增加動(dòng)脈血液流速[4]，具有降血糖、抗氧化、降血壓、抗微生物等作用[5],且油橄欖葉中的抗氧化活性物質(zhì)含量比油橄欖果、莖和樹皮都高[6]。橄欖葉主要含有橄欖苦苷、多酚和黃酮等活性物質(zhì)[7]。王潔等[8]對(duì)橄欖葉中常見功效成分的作用機(jī)制進(jìn)行了總結(jié),橄欖葉中的活性物質(zhì)可抑制膽固醇的生物合成、腸道吸收，并促進(jìn)膽汁酸糞便排泄,從而降低膽固醇的水平,對(duì)高血脂的治療具有重要意義。

高血脂是由于血液中高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)含量偏低,總膽固醇(total cholesterol, TCHO)和甘油三酯(triglyceride, TG)含量偏高引起的血脂異常疾病。研究表明,高血脂會(huì)加速動(dòng)脈粥樣硬化,從而引起糖尿病、高血壓等諸多疾病,其中動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病發(fā)病的主要原因[9-10]。高血脂癥患者同時(shí)患冠心病、心肌梗死和猝死的幾率均比正常人高[11]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界范圍內(nèi)每年死于高血脂癥及相關(guān)疾病的總?cè)藬?shù)約為1 800萬。相關(guān)研究表明,將有更多的人死于這類心血管疾病,且心血管疾病已經(jīng)成為導(dǎo)致死亡的首要疾病[12]。臨床醫(yī)學(xué)表明,高血脂、高血壓等疾病通過藥物治療效果不甚理想,且對(duì)人體有一定的副作用，而通過天然膳食調(diào)節(jié)的效果更佳。橄欖葉提取物能天然降壓,清理血管，降低膽固醇,且沒有嚴(yán)重的毒副作用,是天然的降脂植物。因此,橄欖葉提取物降血脂的研究對(duì)高血壓、高血脂以及糖尿病并發(fā)癥的防治具有一定意義,在保健功能產(chǎn)品開發(fā)領(lǐng)域具有較好的市場(chǎng)價(jià)值和發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料、試劑

4～6周齡的無特定病原體(specific pathogen free, SPF)雄性昆明小鼠60只,由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供,飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)小鼠同室分籠,分裝為5籠,每籠6只,室溫控制在(23±2)℃,濕度適中。經(jīng)學(xué)院倫理委員會(huì)審查,所選擇的動(dòng)物品種、等級(jí)、數(shù)量、規(guī)格合適。實(shí)驗(yàn)中善待動(dòng)物,給予麻醉和鎮(zhèn)痛處理,實(shí)驗(yàn)后給予安樂死,死后動(dòng)物無害化處理,沒有對(duì)環(huán)境帶來危害,實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究倫理標(biāo)準(zhǔn)。

皮瓜爾橄欖葉、鄂植8號(hào)橄欖葉,重慶江源油橄欖開發(fā)有限公司基地。普通飼料：主要含雞肉、魚粉、豆粕、麩皮、玉米、面粉等；高脂飼料：含18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)脂肪、25%蛋白質(zhì)、1%膽固醇、0.2%牛膽鹽,南京盛民科研動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。

TG試劑盒、TCHO試劑盒、HDL-C試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)試劑盒,南京建成生物工程研究所；其余試劑為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器和設(shè)備

LUX多功能性酶標(biāo)儀,美國Thermo Fisher Scientific公司；R1002VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；ICEN-24R高速冷凍離心機(jī),杭州奧盛儀器有限公司；BX43生物顯微鏡,日本奧林巴斯公司；多孔恒溫水浴鍋,鄭州長(zhǎng)城科工有限公司；過濾裝置(漏斗與濾瓶)；粉碎機(jī),天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 灌胃物質(zhì)

取橄欖葉100 g,置于粉碎機(jī)中粉碎成粉末狀。分別在稱取15、30、45 g橄欖葉粉末于燒杯中,加入200 mL蒸餾水(粉末均勻分散于水中,不呈現(xiàn)塊狀或糊狀),置于85 ℃的水浴鍋中充分水浴50 min。取出過濾(若殘?jiān)^多,考慮抽濾)。將濾液放于燒杯中后轉(zhuǎn)移至500 mL圓底燒瓶中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),蒸發(fā)至100 mL(燒瓶中無沉淀物析出)。最終分別制得質(zhì)量濃度為150、300、450 g/L的皮瓜爾油橄欖葉(Picual olive leaves, POL)和鄂植8號(hào)油橄欖葉(E planting No.8 olive leaves, EP8OL)提取物為灌胃物質(zhì)。

1.3.2 誘導(dǎo)高脂小鼠模型

小鼠隨機(jī)分為普通組和高脂飼料組,飼喂普通飼料一周以適應(yīng)環(huán)境。普通組以普通飼料為食,高脂飼料組參考文獻(xiàn)[13-14]對(duì)小鼠高血脂體誘導(dǎo)的研究為模型,借鑒文獻(xiàn)[15-16]對(duì)的高脂飼料成分進(jìn)行配比,喂食28 d得到實(shí)驗(yàn)所需的高脂體小鼠模型。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組與灌胃

以健康小鼠為空白組(普通飼料+自來水),模型小鼠分為對(duì)照組(高脂飼料+蒸餾水)、橄欖葉提取物低劑量組(高脂飼料+150 g/L提取物)、橄欖葉提取物中劑量組(高脂飼料+300 g/L提取物)、橄欖葉提取物高劑量組(高脂飼料+450 g/L提取物)；每日灌胃量為0.2 mL,灌胃周期為4周,灌胃期間均用普通飼料投食,每周對(duì)小鼠進(jìn)行1次稱重并記錄。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)小鼠取材

灌胃結(jié)束后,將小鼠絕食(不斷水)24 h,并進(jìn)行解剖前稱重,對(duì)小鼠經(jīng)摘眼球取血后,將小鼠處死解剖,將全部解剖完的小鼠尸體進(jìn)行集中無害化處理[17]。血液用2 mL離心管收集,在1 000 r/min條件下離心10 min,分離血清,并立即放于4 ℃冰箱冷凍保存,用于后續(xù)測(cè)定血清中TCHO、TG、HDL-C、LDL-C含量；取出小鼠肝臟,剪下一小部分裝入含有體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液的2 mL離心管中,于4 ℃冰箱冷藏保存,用于后續(xù)制作蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色切片。

1.3.5 血清生化指標(biāo)測(cè)定

將小鼠已離心好的血清全部解凍,TCHO、TG、HDL-C、LDL-C按照試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

96孔板注射方法：取一個(gè)潔凈的96孔板,將其標(biāo)注為空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、樣本孔,用10 μL移液槍吸取蒸餾水注入96孔板的前3個(gè)孔作為空白孔,每個(gè)孔2.5 μL；在空白孔后3個(gè)孔每孔注入2.5 μL校準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)孔；其余為樣本孔,樣本孔為實(shí)驗(yàn)組的5組樣品。滴加順序依次為空白組、低濃度組(150 g/L%)、中濃度組(300 g/L)、高濃度組(450 g/L)和對(duì)照組,每組5個(gè)樣品,每個(gè)樣品滴加3個(gè)孔,做平行試驗(yàn),每個(gè)孔注入樣品2.5 μL。

1.3.6 肝組織病理學(xué)觀察

取出肝臟組織,按照固定→脫水→浸蠟→包埋→切片→脫蠟→復(fù)水→染色→烘干→封片→觀察的步驟進(jìn)行制片,于40×10倍的電子顯微鏡下,觀察小鼠肝臟切片的組織細(xì)胞(主要觀察主動(dòng)脈周圍),對(duì)小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)進(jìn)行分析。剩余的組織存于自封袋,于-80 ℃保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全部來自于3次以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用Origin 軟件作圖。采用SPSS進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05認(rèn)為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖葉提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

體質(zhì)量是一項(xiàng)可以衡量人和動(dòng)物肥胖的指標(biāo),而肥胖是影響心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素[18],是誘發(fā)心血管疾病的主要原因[19],肥胖與甘油三酯水平增加、HDL-C水平減少密切相關(guān)[20]。因此,在控制體質(zhì)量的同時(shí)也能控制血清中膽固醇的水平,降低血脂水平,減少心血管疾病的發(fā)生。研究表明,油橄欖葉直接喂食反芻動(dòng)物,可使瘤胃細(xì)菌合成蛋白質(zhì)量增加[21]。

由圖1可知,經(jīng)灌胃處理后,與高脂對(duì)照組相比,2組小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)速度明顯降低,隨著提取物濃度的增加效果越明顯。經(jīng)EP8OL灌胃的小鼠在1～3周的體質(zhì)量無明顯差異,第3周體質(zhì)量呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)；經(jīng)POL灌胃的小鼠在灌胃期內(nèi)體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組,從第2周開始實(shí)驗(yàn)組的體質(zhì)量增長(zhǎng)趨于平緩。

圖1 鄂植8號(hào)橄欖葉(a)、皮瓜爾橄欖葉(b)提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量變化的影響Fig.1 Effect of EP8OL (a) and POL (b) on body mass of mice

實(shí)驗(yàn)表明,EP8OL和POL提取物均對(duì)高脂小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)具有抑制作用,各劑量組的抑制效果一致,其中EP8OL對(duì)降低小鼠體質(zhì)量的作用效果明顯。

2.2 橄欖葉提取物對(duì)小鼠血脂指標(biāo)的影響

小鼠經(jīng)飼喂高脂飼料后,血清中總膽固醇含量上升顯著,甘油三酯、LDL-C含量上升,HDL-C含量下降。說明飼喂高脂飼料后,小鼠脂類代謝失調(diào),血清中的膽固醇水平升高,產(chǎn)生高脂血癥。經(jīng)橄欖葉提取物灌胃后,小鼠血脂顯著降低,肝臟脂肪樣變減少,組織損傷減低。POUDYAL等[22]發(fā)現(xiàn)橄欖葉提取物降糖、降血脂作用與其較強(qiáng)的抗氧化能力有關(guān),其機(jī)制可能與其改善肝臟氧化應(yīng)激水平有關(guān)[23]。

2.2.1 血清中總膽固醇含量

人體膽固醇約2/3由肝臟進(jìn)行內(nèi)源性合成。在肝細(xì)胞中,通過HMG-CoA還原酶途徑,在細(xì)胞內(nèi)形成膽固醇。正常情況下,細(xì)胞內(nèi)過多的膽固醇會(huì)外流[24]。若外流機(jī)制受損,膽固醇就會(huì)在細(xì)胞內(nèi)蓄積,導(dǎo)致人體內(nèi)的脂類代謝失調(diào),血清中的膽固醇水平就會(huì)升高,從而產(chǎn)生高脂血癥。

根據(jù)圖2可知,空白組小鼠中總膽固醇含量最低。與對(duì)照組相比,低劑量組降低膽固醇含量效果最佳,效果與濃度呈負(fù)相關(guān),說明提取物的濃度過高并不利于降低膽固醇。2種灌胃物質(zhì)在抑制小鼠體內(nèi)的總膽固醇水平的作用效果相似。

圖2 橄欖葉提取物灌胃后小鼠總膽固醇水平Fig.2 Total cholesterol level in mice after gavage of olive leaf extract

實(shí)驗(yàn)表明,小鼠體內(nèi)總膽固醇含量：低濃度組<中濃度組<高濃度組<對(duì)照組,說明降低高脂小鼠膽固醇含量效果最佳的是150 g/L橄欖葉提取物,其中POL降低小鼠體內(nèi)膽固醇水平更穩(wěn)定,EP8OL提取物灌胃后小鼠血清膽固醇含量是POL提取物的數(shù)倍,說明體內(nèi)膽固醇的蓄積還可能與小鼠自身體質(zhì)、消化吸收有關(guān)。

2.2.2 血清中甘油三酯含量

“甘油三酯”又稱脂肪,是由食物脂肪與肝臟合成的,由長(zhǎng)鏈脂肪酸和甘油形成,是血脂檢查中比較重要的一項(xiàng)指標(biāo)。輕度甘油三酯增高,可能是糖類食物攝入過多、吸煙、肥胖等因素引起,重度的高甘油三酯,多與糖尿病、肝病、慢性腎炎等有關(guān)。研究表明,高甘油三酯可引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[25],增加胞內(nèi)Ca+濃度,導(dǎo)致高甘油三酯血癥性胰腺炎[26]。

由圖3可知,各濃度組的甘油三酯含量均低于對(duì)照組,說明油橄欖葉提取物能有效降低小鼠的甘油三酯含量,中濃度組的降低效果最佳,但各濃度組降低效果無顯著差異,小鼠體內(nèi)甘油三酯含量：中濃度組<低濃度組<高濃度組。與正常小鼠(空白組)相比,EP8OL高劑量和中劑量組小鼠甘油三酯含量更低,而POL劑量組小鼠的甘油三酯含量均高于空白組,說明同一劑量濃度下,EP8OL降低小鼠體內(nèi)甘油三酯含量效果更好。

圖3 橄欖葉提取物灌胃后小鼠甘油三酯含量Fig.3 Average contents of triglyceride in mice after gavage of olive leaf extract

2種提取物均能降低高脂小鼠甘油三酯含量,隨灌胃物質(zhì)濃度的升高,甘油三酯含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),但POL提取物灌胃組的小鼠體內(nèi)甘油三酯含量波動(dòng)更大,而EP8OL組小鼠體內(nèi)的甘油三酯含量較平穩(wěn)。

2.2.3 血清中HDL-C含量

高密度脂蛋白膽固醇可通俗地理解為“好”膽固醇,血漿脂蛋白中,HDL具有抗炎性反應(yīng)作用[27],可減少主動(dòng)脈壁VCAM-1、ICAM-1的表達(dá)[28],減少代謝性內(nèi)毒素血癥[29]?？煽箘?dòng)脈粥樣硬化,調(diào)節(jié)血脂水平,減少患冠狀動(dòng)脈心臟病的危險(xiǎn)。

根據(jù)圖4可知,HDL-C含量空白組高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,說明高脂飲食能影響小鼠體內(nèi)的高密度蛋白膽固醇水平。2組小鼠中空白組與對(duì)照組的HDL-C含量差值為0.1～0.11 mmol/L；3個(gè)濃度組與對(duì)照組間對(duì)比可得,一定濃度的橄欖葉提取物有利于提升HDL-C的含量,但提升并不顯著,且在同一濃度下2種灌胃物質(zhì)對(duì)小鼠體內(nèi)HDL-C含量的影響波動(dòng)范圍均在0.2 mmol/L。

圖4 橄欖葉提取物灌胃后小鼠HDL-C含量Fig.4 HDL-C content in mice after gavage of olive leaf extract

2類物質(zhì)在穩(wěn)定HDL-C含量的最佳濃度不同,且HDL-C水平各組間比較平穩(wěn)。因此,EP8OL和POL對(duì)于小鼠體內(nèi)HDL-C的血脂水平作用效果一致。

2.2.4 血清中LDL-C含量

人或動(dòng)物體內(nèi)的LDL-C主要負(fù)責(zé)把膽固醇從肝臟運(yùn)送到各個(gè)組織,再由高密度脂蛋白將各處的膽固醇送回肝臟代謝[30]。但當(dāng)?shù)兔芏戎鞍走^量時(shí),由它攜帶的膽固醇便積存在動(dòng)脈壁上,容易引起動(dòng)脈硬化,影響血脂水平,引發(fā)心血管疾病[31]。

根據(jù)圖5,鄂植8號(hào)組的正常小鼠LDL-C含量明顯高于實(shí)驗(yàn)組、略低于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組,說明EP8OL提取物能顯著降低小鼠體內(nèi)的LDL-C含量,其中油橄欖提取物濃度對(duì)小鼠體內(nèi)LDL-C水平影響不大,中濃度組小鼠LDL-C含量最低；POL實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組,說明POL能有效降低高脂小鼠的LDL-C含量,其中高濃度組小鼠LDL-C含量最低。實(shí)驗(yàn)表明,橄欖葉提取物能有效降低小鼠體內(nèi)LDL-C水平,EP8OL作用效果更佳,能將小鼠體內(nèi)LDL-C水平降低至正常小鼠以下。因此,降脂效果與小鼠個(gè)體體質(zhì)、橄欖葉品種、提取物濃度有關(guān)。

圖5 橄欖葉提取物灌胃后小鼠LDL-C含量Fig.5 LDL-C content in mice after gavage of olive leaf extract

2.2.5 橄欖葉提取物對(duì)小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

肝臟是脂肪攝取、氧化、脂肪酸代謝、膽固醇、磷脂和脂蛋白的合成和分泌的重要器官,正常狀態(tài)下,脂類代謝在肝臟中保持著動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)攝入脂質(zhì)過多時(shí),會(huì)引起脂代謝紊亂,大量脂肪從脂庫中出來,大部分進(jìn)入肝細(xì)胞。肝內(nèi)脂肪的增加超過了肝細(xì)胞將其氧化利用和合成脂蛋白運(yùn)輸出去的能力,則使肝細(xì)胞脂肪沉積及肝細(xì)胞變性,形成脂肪肝[32-33]。DAY[34]提出的“二次打擊”學(xué)說以脂質(zhì)代謝異常、脂質(zhì)過氧化等被廣泛接受。研究表明,油橄欖葉除具有抗氧化、抗菌、降脂作用外,對(duì)鉛中毒的小鼠各項(xiàng)臟器指標(biāo)具有改善作用[35]。因此,橄欖葉提取物對(duì)小鼠肝組織的病變也具有一定的改善、調(diào)節(jié)作用。

由圖6可知,兩大組的空白組小鼠肝臟細(xì)胞排列整齊、緊密,形態(tài)正常,細(xì)胞以中心經(jīng)脈為中心呈散發(fā)狀分布。對(duì)照組肝細(xì)胞排列雜亂無序、松散,中心經(jīng)脈周圍細(xì)胞排列雜亂,細(xì)胞界限不明顯,細(xì)胞間隙較大,肝損傷嚴(yán)重。進(jìn)行橄欖葉提取物營養(yǎng)干預(yù)后,低濃度組肝細(xì)胞排列較為紊亂,比較松弛,細(xì)胞核大小不一,細(xì)胞界限較為明顯,低濃度組肝細(xì)胞形態(tài)總體優(yōu)于對(duì)照組。300 g/L中濃度組肝細(xì)胞排列有序,比較緊密,細(xì)胞間隙比較明顯,中心靜脈周圍的細(xì)胞呈較有規(guī)律地排列,細(xì)胞呈有規(guī)律的散發(fā)狀分布,肝細(xì)胞總體形態(tài)有所緩解。高濃度組肝細(xì)胞形態(tài)與空白組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)更相近,排列相對(duì)規(guī)整。實(shí)驗(yàn)表明EP8OL可以有效緩解小鼠肝細(xì)胞損傷。2組空白組小鼠的肝臟均未受到損傷，經(jīng)灌胃后,2組小鼠的肝病變程度均隨著提取物濃度的增強(qiáng)而變小,說明了較高濃度的橄欖葉提取物對(duì)小鼠肝損傷病變有良好的治療作用,也對(duì)高血脂小鼠的肝臟病變有明顯的抑制和調(diào)節(jié)作用[36-37]。

1-空白組；2-對(duì)照組；3-低濃度組；4-中濃度組；5-高濃度組圖6 鄂植8號(hào)橄欖葉(a)、皮瓜爾橄欖葉(b)提取物對(duì)小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響Fig.6 Effect of EP8OL (a) and POL (b) extracts on liver histopathology in mice

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中2種橄欖葉提取物對(duì)模型小鼠體質(zhì)量控制具有較好的效果,EP8OL提取物降低小鼠體質(zhì)量的效果明顯,POL提取物也能有效地抑制小鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)速率。

2種橄欖葉提取物均能降低模型小鼠總膽固醇、甘油三酯、LDL-C的水平,并能提高小鼠HLD-C的含量,使實(shí)驗(yàn)小鼠血清指標(biāo)趨于正常水平,起到調(diào)節(jié)血脂的作用,其降脂效果相似,總體效果趨于一致。但2種橄欖葉提取物降低總膽固醇、甘油三酯、LDL-C水平,升高HDL-C水平的最佳濃度不同。2種橄欖葉提取物能降低高脂飲食對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟組織的損傷,隨提取物濃度的增加,作用效果越顯著。因此,橄欖葉能抑制高脂模型小鼠的肝臟病變,起到調(diào)節(jié)肝損傷的作用。