米酒生香酵母的分離篩選鑒定及其性能研究

李澤洋, 伍時華, 龍秀鋒*, 吳軍, 易弋

1(廣西科技大學 生物與化學工程學院,廣西 柳州,545006) 2(廣西糖資源綠色加工重點實驗室,廣西 柳州,545006) 3(廣西科技大學 教學質(zhì)量監(jiān)控與評估中心,廣西 柳州,545006)

米酒具有蜜香清雅、入口柔綿、落口爽凈的特點,深受消費者的喜愛[1]。米酒主體香氣成分為乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇[2],主要是由微生物在米酒釀造過程中代謝產(chǎn)生。用于釀酒的生香酵母具有產(chǎn)生芳香化合物的能力,在酒的釀造過程中發(fā)揮著重要作用。生香酵母分泌的酯酶能使酵母代謝產(chǎn)生的醇類和酸類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)生成多種具有香味的酯類物質(zhì)[3]。β-苯乙醇則通過艾利希途徑代謝調(diào)節(jié)而產(chǎn)生[4]。生香酵母多存在于酒曲或水果當中,其種類多樣,常見的生香酵母有異常畢赤酵母(Pichiaanomala)[5-6]、漢遜酵母(Hansenula)[7]、假絲酵母(Candida)[8]、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)[9]和接合酵母(Zygosaccharomyces)[10]等。優(yōu)良生香酵母的篩選、研究不但可以應(yīng)用于酒類釀造,對醬油[11-12]、醋[13-15]和腌菜[16]等的發(fā)酵也具有積極作用。

為得到米酒釀造中產(chǎn)香能力突出的酵母,通過嗅聞法初篩得到產(chǎn)香味明顯的純菌株,再通過測定其發(fā)酵米酒過程中乙酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇和乙醇的積累量復篩得到產(chǎn)香最突出的菌株,并對其進行形態(tài)學和分子生物學鑒定,進一步探究其發(fā)酵米酒產(chǎn)生的風味物質(zhì),及添加前體物對其發(fā)酵米酒中風味物質(zhì)形成的影響。

1 材料與方法

1.1 原料

秈米：市售,保存完好,無霉無蛀。

菌種來源：通過多種途徑得到11種不同篩菌原料,如表1所示。

表1 原料樣品信息Table 1 Information of the samples of raw material

1.2 試劑

孟加拉紅培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱生物科技有限公司；酵母粉、蛋白胨,賽默飛世爾科技有限公司；葡糖淀粉酶、α-淀粉酶,滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；L-苯丙氨酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上均為生化試劑

乙酸乙酯、乙醇、β-苯乙醇、乳酸乙酯,均為色譜純，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；L-乳酸(高純),上海麥克林生化科技有限公司；乙酸(分析純),成都市科龍化工試劑廠；葡萄糖(分析純),天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5,葡萄糖10,KH2PO41,MgSO40.5,瓊脂15,孟加拉紅0.033,氯霉素0.1。115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20,酵母粉10,蛋白胨20,瓊脂15,自然pH。115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200(去皮切塊,加水煮沸20 min,收集濾液),葡萄糖20,瓊脂15,自然pH。115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20,酵母粉10,蛋白胨20,自然pH。每200 mL分裝至500 mL三角瓶,115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：秈米打粉,以10 U/g米添加α-淀粉酶,95 ℃液化4 h,以150 U/g米添加葡糖淀粉酶,65 ℃糖化4 h,以料液比=1∶4(g∶mL)補足水,每200 mL分裝至500 mL三角瓶,105 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.4 儀器與設(shè)備

BX43生物顯微鏡,日本奧林巴斯有限公司；Tpersonal聚合鏈式反應(yīng)儀,德國Biometra公司；DYY-6D型電泳儀,北京市六一儀器廠；ZXSD-R1430生化培養(yǎng)箱、ZWYR-C2402C智城恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZHJH-C1112C超凈工作臺,上海智城分析儀器制造有限公司；LDZH-100KBS立式壓力滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠；賽里安456GC氣相色譜儀(TM-930色譜柱：25 m×0.53 mm,1 μm),荷蘭賽里安儀器(scion instruments)公司；TRACE 1300-ISQQD氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(色譜柱HP5-MS 30 m×0.25 mm,0.25 μm),賽默飛世爾科技有限公司；H2100R醫(yī)用離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 種子培養(yǎng)

種子液：將菌落挑取一環(huán)接入種子培養(yǎng)基,30 ℃、150 r/min培養(yǎng)18 h。

1.5.2 初篩

取5.0 g樣品溶于45 mL無菌水中混勻,靜置取上層菌懸液,以10倍系列稀釋制備10-3、10-4、10-5、10-6、10-7菌懸液,分別移取100 μL涂布于孟加拉紅平板培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng),分離、劃線純化出具有典型酵母菌菌落特征的菌株,接種于YPD斜面培養(yǎng)基,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將純化得到的酵母劃線于PDA平板培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)3～4 d,通過嗅聞法篩選出使平板具有明顯香味的菌株。

1.5.3 復篩

將初篩得到的酵母以10%(體積分數(shù))的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d,利用氣相色譜儀測定乙酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇及乙醇的含量,取樣平行測定3次。

樣品處理：樣品經(jīng)11 000 r/min、4 ℃離心15 min,取上清液。

GC條件：初始溫度50 ℃,3 ℃/min升至80 ℃,保持2 min,再以5 ℃/min升至180 ℃,保持2 min,進樣口溫度180 ℃,檢測器溫度210 ℃,進樣量0.5 μL,分流比20∶1。

1.5.4 菌株的鑒定

1.5.4.1 形態(tài)學鑒定

將篩選出的菌株劃線于YPD平板培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)3 d,觀察菌落及其微觀形態(tài)特征,參考《真菌鑒定手冊》[17]進行形態(tài)學鑒定。

1.5.4.2 分子生物學鑒定

引物：ITS1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′),ITS4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。

PCR反應(yīng)體系：預(yù)混酶25 μL；引物ITS1、ITS4各2 μL；菌液2 μL；ddH2O 19 μL。擴增條件：預(yù)變性94 ℃、5 min;變性94 ℃、1 min;退火55 ℃、1 min;延伸72 ℃、1 min,循環(huán)30次;再延伸72 ℃、10 min,4 ℃保存。

取PCR擴增產(chǎn)物,進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳條帶切膠回收,送至廣州賽默飛世爾科技公司測序。測序結(jié)果提交于美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對,使用軟件Mega 5.0,并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5.5 菌株發(fā)酵風味物質(zhì)測定

將復篩得到的菌株的發(fā)酵液進行風味物質(zhì)測定。

樣品處理：4 ℃、11 000 r/min離心15 min,取上清液和二氯甲烷各30 mL于250 mL三角瓶中,置于搖床(100 r/min)萃取60 min,繼續(xù)加入20 mL二氯甲烷萃取30 min,最后加入10 mL二氯甲烷萃取10 min。萃取結(jié)束后使用分液漏斗分液,收集下層溶液并減壓濃縮至5 mL,使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定風味物質(zhì)。

程序升溫：40 ℃保持5 min,以5 ℃/min升至180 ℃保持5 min,再以5 ℃/min升至240 ℃保持2 min；進樣口溫度280 ℃；氦氣流速1 mL/min；進樣量1 μL；不分流進樣。

質(zhì)譜條件：離子源溫度300 ℃；傳輸通道溫度為280 ℃；電離方式為EI電離源；電子能量70 eV；質(zhì)譜掃描范圍40～600 amu。

1.5.6 香氣前體物對菌株釀造米酒香氣物質(zhì)的影響

利用GC測定發(fā)酵液中乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇的積累量,取樣平行測定3次。

GC條件：初始溫度40 ℃,3 ℃/min升溫至70 ℃,保持3 min,再以10 ℃/min升至180 ℃,保持2 min,進樣口溫度200 ℃,檢測器溫度230 ℃,進樣量0.5 μL,分流比20∶1。

1.5.6.1 乙酸對菌株釀造米酒乙酸乙酯積累量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%(體積分數(shù))的乙酸(0.22 μm濾膜過濾),以體積分數(shù)10%的接種量接種,在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)10 d,每天測定發(fā)酵液中乙酸乙酯積累量。

1.5.6.2L-苯丙氨酸對菌株釀造米酒β-苯乙醇積累量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0、2、4、6、8、10 g/L的L-苯丙氨酸(滅菌前添加),以體積分數(shù)10%的接種量接種、在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)10 d,每天測定發(fā)酵液中β-苯乙醇積累量。

1.5.6.3L-乳酸對菌株釀造米酒乳酸乙酯積累量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%(體積分數(shù))的乳酸(0.22 μm濾膜過濾),以體積分數(shù)10%的接種量接種,在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)10 d,每天測定發(fā)酵液中乳酸乙酯積累量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 2018、Excel Microsoft 365對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,分析結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生香酵母的初篩

從11種樣品中分離純化得到20株酵母菌,如表2所示,將其分別在PDA平板劃線30 ℃培養(yǎng),經(jīng)嗅聞初篩得到香氣突出的菌株6株,分別為2Z1、10Z1、10Z2、10Z3、11Z1和11Z6。

表2 原料中酵母菌分離純化結(jié)果Table 2 Results of isolation and purification of strains from raw materials

2.2 生香酵母的復篩

將初篩得到的菌株以體積分數(shù)10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基,在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d,使用氣相色譜儀進行乙酸乙酯、β-苯乙醇、乳酸乙酯和乙醇積累量測定,結(jié)果見表3。

表3 初篩菌株發(fā)酵米酒香氣物質(zhì)及乙醇含量 單位：g/L

由表3可知,發(fā)酵7 d的菌株11Z1發(fā)酵液中乙酸乙酯積累量最高,達到(2.833±0.260)g/L,其次為菌株11Z6和10Z2,其余菌株發(fā)酵雖產(chǎn)乙酸乙酯,但積累量明顯較低,均低于0.05 g/L。徐麗萍[18]從滬型大曲中篩選出一株產(chǎn)酯漢遜酵母,經(jīng)條件優(yōu)化產(chǎn)酯積累量可達到1.479 g/L,而菌株11Z1在未優(yōu)化的條件下產(chǎn)酯含量明顯優(yōu)于此菌株。與其他發(fā)酵液相比,菌株11Z1發(fā)酵液中β-苯乙醇積累量最高,達到(0.301±0.028)g/L,積累量明顯突出。菌株10Z2發(fā)酵液中乳酸乙酯積累量最高,達到(0.170±0.015)g/L,其次為菌株11Z6,其余均相對較低。菌株2Z1發(fā)酵液中乙醇積累量最高,其次為菌株11Z1、10Z1、11Z6、10Z3和10Z2,最低仍可達到(27.445±2.164)g/L；乙醇既可作為香氣物質(zhì)的前體物,又對米酒發(fā)酵酒精度的提高有積極作用。綜合分析,菌株11Z1發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯、β-苯乙醇的能力均優(yōu)于其他菌株,且產(chǎn)乳酸乙酯及乙醇的能力較強,因此篩選出菌株11Z1進行進一步研究。

2.3 菌株11Z1的鑒定

2.3.1 菌株11Z1的形態(tài)學鑒定

將菌株11Z1在PDA平板中劃線,30 ℃培養(yǎng)3 d,觀察菌落形態(tài)及顯微形態(tài),其結(jié)果如圖1所示。菌株11Z1菌落大且厚,濕潤黏稠易挑起,質(zhì)地均勻,邊緣整齊,呈乳白色,通過顯微鏡可觀察細胞呈卵圓形,細胞個體較大,直徑約5.53～10.57 μm,出芽生殖,無鞭毛及假絲。

圖1 菌株11Z1的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)(400倍)Fig.1 Colony morphology and micromorphology of strain 11Z1

2.3.2 菌株11Z1的分子生物學鑒定

將菌株11Z1測序結(jié)果在NCBI進行BLAST比對,并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖2所示。根據(jù)BLAST比對,菌株11Z1與CyberlindnerafabianiiAMC CF002(KU962046.1)相似性達到99.83%,且在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚于同一分支,可以確定菌株11Z1為Cyberlindnerafabianii。此種酵母并非常見的生香酵母,多存在于水果之中[19-23],國內(nèi)外對此種酵母生香性能的研究較少,深入研究具有一定的價值。

圖2 采用鄰接法構(gòu)建菌株11Z1與相關(guān)分類群系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of strain 11Z1 and related taxa constructed注：Bar表示每單位核苷酸替換數(shù)為0.02

2.4 菌株11Z1發(fā)酵主要風味物質(zhì)分析

利用GC-MS對復篩得到的菌株11Z1的發(fā)酵液進行發(fā)酵代謝風味物質(zhì)分析,結(jié)果如表4所示。菌株11Z1釀造米酒產(chǎn)生的主要風味物質(zhì)共21種,包括醇類5種、酯類3種、酸類5種、酚類1種、酮類1種、烷烴類2種、其他類4種,其中異丁醇、異戊醇、正戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乳酸乙酯、苯甲酸和2-甲基丁酸都是酒類發(fā)酵中常見香味物質(zhì)[24-25],對增加酒的香氣及酒體風格的形成具有積極作用。

2.5 添加不同的前體物對菌株11Z1釀造米酒香氣成分的影響

在培養(yǎng)基中添加不同的前體物(乙酸、L-苯丙氨酸和L-乳酸),以體積分數(shù)10%的接種量接種菌株11Z1,30 ℃、150 r/min培養(yǎng)10 d,研究前體物對菌株11Z1發(fā)酵米酒香氣成分的影響。

2.5.1 添加乙酸對菌株11Z1釀造米酒乙酸乙酯積累量的影響

乙酸乙酯具有果香味,對酒的風味起著重要作用。可嘗試通過添加乙酸乙酯前體物來增加乙酸乙酯的含量。本研究通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%(體積分數(shù))的乙酸,每天測定發(fā)酵液中乙酸乙酯的積累量,研究乙酸對菌株11Z1發(fā)酵米酒香氣成分的影響,結(jié)果如圖3所示。

表4 C.fabianii 11Z1發(fā)酵主要風味物質(zhì)Table 4 Main flavor compounds of C.fabianii 11Z1

圖3 外源添加乙酸釀造米酒過程中乙酸乙酯積累量Fig.3 Accumulation of ethyl acetate during fermenting rice wine with the addition of acetic acid

由圖3可知,不添加乙酸進行發(fā)酵時,發(fā)酵5 d乙酸乙酯積累量達到最大值,為(3.43±0.89)g/L。加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%(體積分數(shù))的乙酸進行發(fā)酵時,分別發(fā)酵5、7、9、10和10 d乙酸乙酯積累量達到最大值,分別為(3.78±0.15)、(7.49±0.58)、(8.95±0.28)、(7.69±0.55)和(1.98±0.24)g/L,除添加0.5%乙酸外,乙酸乙酯最高積累量均大于不添加時,依次提高了10.01%、118.06%、160.71%和123.84%。基本符合積累量逐天上升而后下降的趨勢。由此可知,添加體積分數(shù)0.3%的乙酸,發(fā)酵9 d更加有利于乙酸乙酯的積累。

2.5.2 添加L-苯丙氨酸對菌株11Z1釀造米酒β-苯乙醇積累量的影響

微生物細胞中的艾利希途徑可使L-苯丙氨酸通過氨基酸的轉(zhuǎn)氨作用生成苯丙酮酸,再脫羧成苯乙醛,而后生成β-苯乙醇,或在脫羧酶作用下形成苯乙胺,再通過氧化形成苯乙醛,進而生成β-苯乙醇[26-28]。在發(fā)酵過程中可嘗試通過添加L-苯丙氨酸,利用微生物代謝提升β-苯乙醇的含量。本研究在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0、2、4、6、8和10 g/LL-苯丙氨酸,每天測定發(fā)酵液中β-苯乙醇的積累量,研究L-苯丙氨酸對菌株11Z1發(fā)酵米酒香氣成分的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 外源添加L-苯丙氨酸釀造米酒過程中β-苯乙醇積累量Fig.4 Accumulation of β-phenylethanol during fermenting rice wine with the addition of L-phenylalanine

由圖4可知,不添加L-苯丙氨酸進行發(fā)酵時,β-苯乙醇積累量明顯低于其他處理,最大值達到(0.36±0.015)g/L,且發(fā)酵后每天的β-苯乙醇積累量并無明顯變化。當培養(yǎng)基中加入2、4、6、8和10 g/L的L-苯丙氨酸,分別在發(fā)酵4、4、5、4和4 d時,β-苯乙醇積累量達到最高,分別為(0.96±0.05)、(1.07±0.01)、(1.08±0.06)、(1.14±0.05)和(1.09±0.04)g/L,基本符合先增加而后減少并趨于穩(wěn)定的趨勢,與不添加相比，最大積累量分別提高了166.39%、197.39%、199.09%、215.48%和201.00%,由此可知，添加8 g/L的L-苯丙氨酸,發(fā)酵4 d更加有利于β-苯乙醇的積累。

2.5.3 添加L-乳酸對菌株11Z1釀造米酒乳酸乙酯積累量的影響

酒中的乳酸乙酯具有消除水味、增加濃厚感的作用,對酒的風味尤其是口感起著重要作用?？蓢L試添加乳酸乙酯前體物乳酸來增加乳酸乙酯的含量,本研究在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加體積分數(shù)為0%、1%、2%、3%、4%和5%的L-乳酸,每天測發(fā)酵液中乳酸乙酯積累量,研究乳酸對菌株11Z1米酒發(fā)酵香氣成分的影響,結(jié)果如圖5所示。

圖5 外源添加L-乳酸釀造米酒過程中乳酸乙酯積累量Fig.5 Accumulation of ethyl lactate during fermenting rice wine with the addition of L-lactic acid

由圖5可知,不添加L-乳酸進行發(fā)酵時,發(fā)酵4 d乳酸乙酯積累量達到最大值,為(0.08±0.009)g/L。加入體積分數(shù)為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%L-乳酸進行發(fā)酵時,分別在發(fā)酵5、5、6、8和9 d達到最大值,積累量分別為(0.13±0.014)、(0.14±0.010)、(0.16±0.014)、(0.19±0.014)和(0.16±0.008)g/L,與不添加相比最大積累量依次提高了64.21%、75.52%、107.08%、144.04%和103.78%。基本符合積累量逐天上升達到最大值而后下降的趨勢。由此可知,添加體積分數(shù)0.4%的L-乳酸,發(fā)酵8 d更加有利于乳酸乙酯的積累。

目前消費者更加關(guān)注天然產(chǎn)品,歐洲國家法律規(guī)定,從生產(chǎn)原料到最終產(chǎn)品都是“天然的”,才可以稱“天然”。當前,市場上的乙酸、L-苯丙氨酸和L-乳酸基本上都是采用微生物發(fā)酵法或酶法生產(chǎn)[29-31],天然且價格低,適用于生產(chǎn)。采用菌株11Z1發(fā)酵米酒,同時加入天然前體物或前體物產(chǎn)生菌,能達到提高米酒香氣成分含量的效果,可同時滿足消費者對產(chǎn)品風味及產(chǎn)品“天然”性的要求,具有良好的市場發(fā)展前景。

3 結(jié)論

從不同來源的酒曲及水果中通過嗅聞法初篩得到6株產(chǎn)香味突出的菌株,通過復篩得到產(chǎn)乙酸乙酯和β-苯乙醇均突出且具有產(chǎn)乳酸乙酯和乙醇能力的菌株11Z1,經(jīng)鑒定菌株11Z1為Cyberlindnerafabianii。

對菌株11Z1進行發(fā)酵風味物質(zhì)分析,主要風味物質(zhì)共21種,包括醇類5種、酯類3種、酸類5種、酚類1種、酮類1種、烷烴類2種和其他類4種,對增加酒的香氣,酒體風格的形成具有積極作用。

分別在培養(yǎng)基中添加前體物乙酸、L-乳酸及L-苯丙氨酸,研究其對菌株11Z1發(fā)酵風味物質(zhì)的影響,結(jié)果表明,添加體積分數(shù)為0.3%的乙酸發(fā)酵9 d,乙酸乙酯積累量最高,達到(8.95±0.28)g/L；添加8 g/L的L-苯丙氨酸發(fā)酵4 d,β-苯乙醇積累量最高,達到(1.14±0.05)g/L；添加體積分數(shù)為0.4%的L-乳酸發(fā)酵8 d,乳酸乙酯積累量最高,達到(0.19±0.014)g/L。與不添加前體物相比,乙酸乙酯、β-苯乙醇和乳酸乙酯最高積累量分別提高了160.71%、215.48%和144.04%。