不同神經(jīng)因子聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)重型腦外傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞增殖

朱業(yè)淘 劉 陽△ 王 童 王 雪

1）西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州646000 2）綿陽市第三人民醫(yī)院（四川省精神衛(wèi)生中心），四川 綿陽621000

重型創(chuàng)傷性顱腦外傷（severe traumatic brain injury, sTBI）是全球性的公共衛(wèi)生問題，也是導(dǎo)致人類殘疾和死亡的主要因素之一［1-2］。嚴(yán)重腦外傷后病理發(fā)展過程錯(cuò)綜復(fù)雜，主要是傷后自由基生成、去極化和水腫形成以及血腦屏障破壞［3］等。重型顱腦外傷的病理生理學(xué)包括對(duì)組織的直接物理損傷和繼發(fā)性損傷，其中原發(fā)性腦損害已經(jīng)是不可逆轉(zhuǎn)的，所以避免繼發(fā)性腦損傷造成的二次腦損害成為研究的焦點(diǎn)。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的基本構(gòu)成單位，其穩(wěn)態(tài)、存活可以通過神經(jīng)系統(tǒng)另一大類細(xì)胞——神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞得以維持［4］，目前重型顱腦外傷后神經(jīng)功能難以恢復(fù)，究其原因還是在于神經(jīng)細(xì)胞受損后難以再生。神經(jīng)因子是一類具有神經(jīng)營養(yǎng)活性，可以滋養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活和再生的生長因子［5］。目前已有部分研究證實(shí)了神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增生的作用［6-7］。神經(jīng)生長因子是神經(jīng)因子家族中的一員，已被多個(gè)研究證實(shí)其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，同時(shí)在神經(jīng)細(xì)胞的增殖、防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面起著重要的作用［8-9］。堿性成纖維細(xì)胞生長因子則是一類在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)的因子，已知其可以通過抑制過度自噬和抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡而對(duì)神經(jīng)產(chǎn)生保護(hù)作用［10］，同時(shí)堿性成纖維細(xì)胞生長因子還能夠促進(jìn)神經(jīng)元的增殖從而保護(hù)受損的神經(jīng)［11］。目前國內(nèi)外對(duì)神經(jīng)生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子在神經(jīng)疾病方面的研究多集中在缺血性神經(jīng)性疾病和功能性神經(jīng)疾病，少見于顱腦外傷，且多見于對(duì)其中某一種因子的研究，而將二者聯(lián)合應(yīng)用來觀察其對(duì)重型腦外傷后神經(jīng)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用更是罕見。本實(shí)驗(yàn)通過腦室途徑給重型腦外傷大鼠注入NGF與bFGF，探索這兩種神經(jīng)因子聯(lián)合應(yīng)用對(duì)重型腦外傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 神經(jīng)生長因子（北京義翹神州科技有限公司），堿性成纖維細(xì)胞生長因子（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體（Anti-GFAP）（Abcam 公司），兔抗神經(jīng)元核抗原（NeuN）抗體（Anti-NeuN）（Abcam 公司），Alexa Flour山羊抗兔熒光二抗（Abcam公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48 只成年SD 大鼠，雌雄不限，由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，體質(zhì)量250～300 g，隨機(jī)分為治療組A、B、C組和對(duì)照組D組，每組12只，每組再分為3 d、7 d、14 d 3個(gè)亞組，每個(gè)亞組4只［12］。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 腦外傷模型制備及神經(jīng)因子注射分別建立NGF 注射組（A 組）、bFGF 注射組（B 組）、NGF+bFGF注射組（C組），對(duì)照組（D組）注射生理鹽水，創(chuàng)傷性腦損傷模型的制作參考改良Feeney法［13］，造模成功后經(jīng)腦室內(nèi)注入神經(jīng)因子。A 組注入NGF 10 μL，B組注入bFGF 10 μL，聯(lián)合組注入NGF及bFGF各5 μL，對(duì)照組注入生理鹽水10 μL。

1.4 大鼠腦組織取材及免疫組化、免疫熒光染色在造模后的第3、7、14 天麻醉大鼠，采用多聚甲醛對(duì)大鼠灌注后進(jìn)行斷頭取腦，將腦組織固定于多聚甲醛中24 h，將含有海馬、側(cè)腦室的組織塊取出脫水、石蠟包埋后切片。免疫組化和免疫熒光：對(duì)大腦石蠟切片進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色，方法參考Envision法，分別在光鏡和熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)損傷側(cè)皮質(zhì)、室管膜下區(qū)、海馬以及對(duì)側(cè)相對(duì)應(yīng)部位的陽性細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，成組設(shè)計(jì)的兩均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用LSD 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組化及免疫熒光結(jié)果顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)，大鼠腦損傷側(cè)皮質(zhì)、室管膜下區(qū)、海馬區(qū)以及對(duì)側(cè)相對(duì)應(yīng)的區(qū)域，聯(lián)合組以及單一注射組神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均顯著多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而單一因子組之間陽性細(xì)胞數(shù)量無顯著差異（P＞0.05）。見表1～3、圖1～3。對(duì)于造模后不同時(shí)間點(diǎn)取材所檢測到的相應(yīng)部位陽性細(xì)胞也有差別，其中造模后第7 天各部位陽性細(xì)胞數(shù)量最多（圖4），且損傷側(cè)皮質(zhì)、室管膜下區(qū)部位陽性細(xì)胞均多于損傷對(duì)側(cè)相對(duì)應(yīng)區(qū)域（圖5）。

表1 各組大鼠損傷側(cè)海馬和對(duì)側(cè)海馬神經(jīng)元數(shù)比較 （±s，n=4）Table 1 Comparison of neuron numbers between injured hippocampus and contralateral hippocampus of rats in each group （±s）

表1 各組大鼠損傷側(cè)海馬和對(duì)側(cè)海馬神經(jīng)元數(shù)比較 （±s，n=4）Table 1 Comparison of neuron numbers between injured hippocampus and contralateral hippocampus of rats in each group （±s）

注：與D組比較，aP ＜0.05；與C組比較，bP ＜0.05

組別損傷側(cè)海馬損傷對(duì)側(cè)海馬A組B組C組D組第14天135.4±6.3ab 141.5±7.6ab 172.6±7.3a 25.7±6.0第3天323.3±47.5ab 302.4±25.3ab 512.1±32.3a 166.4±16.2第7天408.6±17.3ab 402.1±27.6ab 624.3±32.4a 197.5±10.1第14天285.2±27.3ab 265.4±22.1ab 485.2±36.2a 143.6±17.1第3天146.3±9.5b 152.7±13.6ab 198.5±11.4a 34.3±7.4第7天198.5±7.2ab 185.4±20.2ab 236.9±19.7a 56.1±8.3

表2 各組大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)和對(duì)側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較 （±s）Table 2 Comparison of glial cells in injured cortex and contralateral cortex of rats in each group （±s）

表2 各組大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)和對(duì)側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較 （±s）Table 2 Comparison of glial cells in injured cortex and contralateral cortex of rats in each group （±s）

注：與D組比較，aP ＜0.05；與C組比較，bP ＜0.05

組別A組B組C組D組損傷側(cè)皮質(zhì)損傷對(duì)側(cè)皮質(zhì)第3天455.4±24.3ab 452.1±12.4ab 661.4±17.5a 205.3±9.6第7天563.2±11.4ab 676.2±17.5ab 988.1±20.3a 332.4±9.6第14天375.3±20.1ab 371.1±13.5ab 632.6±20.1a 210.4±13.6第3天360.5±10.1b 342.7±11.6ab 378.2±13.2a 147.2±6.7第7天403.4±8.5ab 391.3±11.2ab 475.3±14.6a 265.3±7.6第14天281.2±7.3ab 241.4±5.7ab 336.5±11.2a 138.6±8.5

表3 各組大鼠損傷側(cè)室管膜下區(qū)和對(duì)側(cè)室管膜下區(qū)神經(jīng)元數(shù)比較 （±s）Table 3 Comparison of the number of neurons in the injured subependymal area and contralateral subependymal area of rats in each group （±s）

表3 各組大鼠損傷側(cè)室管膜下區(qū)和對(duì)側(cè)室管膜下區(qū)神經(jīng)元數(shù)比較 （±s）Table 3 Comparison of the number of neurons in the injured subependymal area and contralateral subependymal area of rats in each group （±s）

注：與D組比較，aP ＜0.05；與C組比較，bP ＜0.05

組別A組B組C組D組損傷側(cè)室管膜下區(qū)損傷對(duì)側(cè)室管膜下區(qū)第3天562.2±34.3ab 537.6±21.3ab 768.2±41.7a 150.1±14.3第7天621.4±13.4ab 601.5±22.3ab 982.6±17.4a 212.3±9.6第14天502.1±13.4ab 487.5±18.3ab 702.3±27.1a 121.4±14.2第3天224.3±8.1b 201.4±11.7ab 325.6±14.2a 63.2±6.7第7天305.4±6.5ab 287.3±16.4ab 428.5±16.3a 173.2±9.4第14天202.1±6.5ab 185.3±7.6ab 356.2±8.3a 85.6±7.1

圖1 造模7 d后聯(lián)合組（D）損傷側(cè)海馬區(qū)域神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（箭頭所示）廣泛增殖,明顯多于神經(jīng)生長因子組（A）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子組（B）和對(duì)照組（C）（×400）Figure 1 Seven days after modeling, glial cells （as shown by the arrow） in the hippocampus of the injured side in combination group （D） proliferated extensively, significantly more than those in nerve growth factor group （A）, basic fibroblast growth factor group （B） and control group （C）（×400）

圖2 聯(lián)合組造模7 d后損傷側(cè)海馬區(qū)域神經(jīng)元（箭頭所示）增殖情況（C），明顯較堿性成纖維細(xì)胞生長因子組（B）、神經(jīng)生長因子組（A）及對(duì)照組（D）神經(jīng)元數(shù)量多（×400）Figure 2 Seven days after modeling, the proliferation of neurons （as shown by the arrow） in the injured side hippocampus of rats in the combination group （C） was significantly higher than that in the basic fibroblast growth factor group （B）, nerve growth factor group （A）, and control group （D）（×400）

圖3 免疫組化結(jié)果顯示，聯(lián)合組（C）在造模7 d后損傷側(cè)皮質(zhì)新增神經(jīng)元數(shù)量明顯多于神經(jīng)生長因子組（A）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子組（B）和對(duì)照組（D）（×200）Figure 3 Immunohistochemical results showed that the number of new neurons in the injured lateral cortex of combination group （C） was significantly more than that of nerve growth factor group （A）, basic fibroblast growth factor injection group （B） and control group （D） seven days after modeling （×200）

圖4 免疫組化顯示聯(lián)合組在造模后第7天（B）損傷側(cè)皮質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯多于造模后第3天（A）和第14天（C）（×200）Figure 4 Immunohistochemistry showed that the number of glial cells in the damaged lateral cortex on day 7（B） after modeling in the combination group was significantly more than those on day 3（A） and 14（C） after modeling（×200）

圖5 免疫組化顯示，聯(lián)合組在造模7 d 后損傷側(cè)皮質(zhì)（A）與損傷側(cè)室管膜下區(qū)（C）神經(jīng)元數(shù)量明顯多于損傷對(duì)側(cè)皮質(zhì)（B）及損傷對(duì)側(cè)室管膜下區(qū)（D）（×200）Figure 5 Immunohistochemistry showed that the number of neurons in the damaged lateral cortex （A） and the damaged lateral ependymal region （C） was significantly more than that in the damaged contralateral cortex （B） and the damaged contralateral ependymal region （D）（×200）

3 討論

目前世界上針對(duì)腦外傷的各種治療方法效果均欠佳，究其原因還是在于神經(jīng)細(xì)胞受損后難以再生。大腦中的海馬齒狀回顆粒層（hippocampal dentate gyrus，HDG）和室管膜下區(qū)（subventricular zone，SVZ）存在大量的神經(jīng)細(xì)胞［14-15］，神經(jīng)細(xì)胞受損后凋亡，且再生極其困難，因此要達(dá)到修復(fù)神經(jīng)的目的可以選擇通過促進(jìn)受損部位神經(jīng)細(xì)胞的增殖進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，已有部分研究證實(shí)了神經(jīng)營養(yǎng)因子可以防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)其增殖［16-18］。因此，本次實(shí)驗(yàn)中使用了一些特殊的神經(jīng)營養(yǎng)因子改變腦外傷后局部腦組織的微環(huán)境，以保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖，達(dá)到腦外傷后神經(jīng)修復(fù)的治療目的。目前，一些研究證實(shí)了神經(jīng)生長因子可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖，而堿性成纖維細(xì)胞生長因子也有同樣的作用［10，19-21］。神經(jīng)生長因子是神經(jīng)營養(yǎng)因子中的一員，目前對(duì)于神經(jīng)生長因子的研究已非常透徹，是一類可以營養(yǎng)神經(jīng)元、調(diào)節(jié)神經(jīng)突起生長的因子，研究表明神經(jīng)生長因子可以保護(hù)神經(jīng)元和促進(jìn)神經(jīng)纖維再生，從而使神經(jīng)系統(tǒng)損傷得到一定程度的恢復(fù)［22］，而神經(jīng)生長因子也被證實(shí)可以改善腦外傷后大鼠的認(rèn)知功能［23］。堿性成纖維細(xì)胞生長因子則具有保護(hù)神經(jīng)、抵抗神經(jīng)元凋亡作用［24-25］，同時(shí)還能維持神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的存活，促進(jìn)交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)軸突的生長，促進(jìn)受損神經(jīng)的修復(fù)和神經(jīng)突觸的生長。堿性成纖維細(xì)胞生長因子可以在腦外傷后保護(hù)血腦屏障的完整性，減輕腦損傷，改善腦外傷后神經(jīng)功能［26-27］。SUN 等［28］研究則證實(shí)通過腦室注射途徑將堿性成纖維細(xì)胞生長因子注入創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型后，可以促進(jìn)腦外傷后大鼠的認(rèn)知恢復(fù)。由此可見，堿性成纖維細(xì)胞生長因子與神經(jīng)生長因子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的增殖作用是明確的，且能夠促使腦損傷后神經(jīng)功能得到一定的恢復(fù)。本次實(shí)驗(yàn)表明神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠促進(jìn)腦外傷后神經(jīng)細(xì)胞的增殖，證實(shí)了將堿性成纖維細(xì)胞生長因子與神經(jīng)生長因子聯(lián)合應(yīng)用能促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞增殖，增殖數(shù)量明顯高于對(duì)照組，且較單一注射組陽性細(xì)胞數(shù)量多，在不同時(shí)間點(diǎn)造模后檢測出相應(yīng)部位的陽性細(xì)胞數(shù)量也有明顯差別，其中造模后第7 天各部位相應(yīng)的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯多于造模后第3天和第14天。通過回顧相關(guān)文獻(xiàn)得知，這種結(jié)果的可能原因在于重型腦外傷的急性期損傷部位局部微環(huán)境改變會(huì)釋放大量興奮性氨基酸、自由基以及一些炎性因子等，可能抑制神經(jīng)因子作用，亦或抑制新生神經(jīng)元的產(chǎn)生導(dǎo)致早期相應(yīng)部位新生神經(jīng)細(xì)胞較少；隨著時(shí)間推移，在損傷后第7 天左右局部微環(huán)境的恢復(fù)以及自身一些神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌達(dá)到高峰，新生細(xì)胞也在此時(shí)達(dá)到高峰，在損傷后第14 天自身分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子下降，瘢痕組織增生從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量有所下降［29］。本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)各組大鼠損傷側(cè)相應(yīng)部位的陽性細(xì)胞數(shù)量均多于損傷對(duì)側(cè)相應(yīng)部位，可能原因在于腦組織損傷刺激損傷部位自身神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，以防止局部神經(jīng)細(xì)胞凋亡及促進(jìn)新生神經(jīng)細(xì)胞的增殖［30-36］。本次實(shí)驗(yàn)不足之處在于運(yùn)用的免疫組化與免疫熒光單標(biāo)僅從側(cè)面反映神經(jīng)細(xì)胞的增殖與表達(dá)情況，具體二者聯(lián)合運(yùn)用對(duì)于內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)制并未得到闡明，同時(shí)二者聯(lián)用是否增強(qiáng)了內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化還需進(jìn)一步研究以明確。

外源性神經(jīng)生長因子聯(lián)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子可以使重型腦外傷大鼠內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞增殖，且二者聯(lián)合運(yùn)用效果最為顯著，這也為運(yùn)用神經(jīng)營養(yǎng)因子改善腦外傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)提供了重要參考。

作者貢獻(xiàn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為劉陽，實(shí)驗(yàn)實(shí)施為朱業(yè)淘、王童、王雪，實(shí)驗(yàn)評(píng)估為朱業(yè)淘、王童，資料收集為朱業(yè)淘、王雪

經(jīng)費(fèi)支持：該研究接受了“綿陽市衛(wèi)計(jì)委資助項(xiàng)目（201801、201901）、綿陽市第三人民醫(yī)院重點(diǎn)培育項(xiàng)目（201905、202003）”的資助，所有作者聲明經(jīng)費(fèi)支持沒有影響文章觀點(diǎn)和對(duì)研究數(shù)據(jù)客觀結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析及其報(bào)道

利益沖突：文章的全部作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突

機(jī)構(gòu)倫理問題：實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程遵循了國際獸醫(yī)學(xué)、編輯協(xié)會(huì)《關(guān)于動(dòng)物倫理與福利的作者指南共識(shí)》和本地及國家法規(guī)