Quaterrylene-環(huán)糊精腫瘤光熱治療劑的大鼠腎-尿代謝研究

李金梅，羅亞麗，王克讓

(1. 保定市第一中心醫(yī)院 病理科，河北 保定 071000；2. 河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點實驗室，河北 保定 071002)

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人們健康. 根據(jù)最新統(tǒng)計結(jié)果，全球每年新增腫瘤患者約1 810萬人，每年約960萬人死于惡性腫瘤，而中國新增患者約380.4萬，死亡患者約229.6萬[1]. 光熱治療(photothermal therapy, PTT)是將光能轉(zhuǎn)化為熱能而達(dá)到治療效果的一種新的治療手段，具有組織穿透性深、靈敏度高、全身毒性低、精確可控性高,以及無創(chuàng)性或微創(chuàng)性等優(yōu)點，在癌癥治療方面具有重要應(yīng)用[2]. 目前，廣泛研究的光熱治療劑主要包括：無機(jī)納米材料[2]、碳納米材料[3]、有機(jī)聚合物[4]和有機(jī)小分子[5]等. 每種光熱治療劑都有其自身固有的特殊理化性質(zhì)，具有各自的優(yōu)點和局限性.

根據(jù)美國食品和藥品管理局(FDA)規(guī)定所有注射藥物分子應(yīng)在一定的時間從體內(nèi)完全清除[7]. 腫瘤光熱治療劑作為診療一體化分子，代謝問題是限制其臨床應(yīng)用研究的關(guān)鍵科學(xué)問題之一. 藥物代謝的主要途徑是肝脾代謝和腎代謝. 藥物的腎-尿代謝與肝脾代謝相比，具有代謝時間短、對機(jī)體其他器官損傷小和潛在的長期毒副作用低等優(yōu)點[8]. 因此，發(fā)展腎-尿代謝型光熱治療劑在腫瘤光熱治療方面具有重要意義.

最近，筆者設(shè)計合成了環(huán)糊精修飾的quaterrylene衍生物(QDI-CD，圖1)，其在體外和體內(nèi)具有良好的光熱治療作用，光熱轉(zhuǎn)化效率達(dá)62.53%. 另外，代謝研究發(fā)現(xiàn)QDI-CD在昆明鼠體內(nèi)的腎-尿代謝率可達(dá)(67.00±2.37)%，并且治療組和空白組的腎臟病理顯示其對腎臟沒有損傷(圖1)[9]. 與昆明鼠相比，SD大鼠的體質(zhì)量約為200 g，是昆明鼠體質(zhì)量(50 g)的4倍. 另外，腹腔注射和尾靜脈注射是藥物研究主要的給藥方式，SD大鼠體質(zhì)量大，更有利于研究腹腔注射給藥對藥物代謝的影響[10-11]. 因此，筆者研究了QDI-CD在SD大鼠體內(nèi)的代謝情況，發(fā)現(xiàn)QDI-CD具有好的腎-尿代謝率，并且代謝前后QDI-CD的結(jié)構(gòu)沒有改變.

圖1 環(huán)糊精修飾quaterrylene衍生物QDI-CD的結(jié)構(gòu)(a)，以及光熱治療(b)和空白組(c)的腎臟病理圖[9]Fig.1 Structure of cyclodextrin modified quaterrylene derivative (QDI-CD)(a), Hematoxylin and eosin (H&E)-stained histological sections of kidney obtained from mice in the PTT group (b) and control group (c)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高分辨質(zhì)譜儀：FT-MALDI MS (布魯克公司)；紫外-可見分光光度計：Cary 5000 (安捷倫科技有限公司)；小鼠代謝籠；常用有機(jī)溶劑為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠尿液收集

4只SD大鼠，體質(zhì)量為200 g/只，隨機(jī)分為4組，放在代謝籠中，分為實驗組1、實驗組2、實驗組3和空白組. 代謝實驗前，SD大鼠禁食12 h. 將1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的QDI-CD光熱治療劑腹腔注射到SD大鼠體內(nèi)，空白組腹腔注射1 mL的PBS緩沖溶液，在代謝籠內(nèi)分別收集SD大鼠12 h和24 h的尿液.

1.2.2 SD大鼠尿液處理及測試

將收集的SD大鼠不同代謝時間的尿液用去離子水稀釋到合適質(zhì)量濃度，尿液12 000 r/min離心5 min，取上層清液，在紫外-可見分光光度計上測試其紫外吸收特征.

1.2.3 尿液的高分辨質(zhì)譜分析

將收集的SD大鼠的尿液用二氯甲烷萃取3次，將二氯甲烷相合并，濃縮，通過硅膠柱層析分離純化，洗脫劑為V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1. 分離純化后的尿液代謝物經(jīng)高分辨質(zhì)譜分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 SD大鼠尿液的紫外-可見光譜分析及代謝率

按1.2.1小節(jié)操作收集尿樣.如表1所示，腹腔注射12 h后，實驗組1～3收集的尿液分別為9.9、6.1和5.1 mL. 腹腔注射24 h后，實驗組1～3收集的尿液分別為6.2、7.3、6.8 mL. 基于QDI-CD分子在600～1 000 nm內(nèi)具有紫外-可見特征吸收峰，而尿液中的代謝物在這一吸收區(qū)間沒有干擾，因此，通過紫外-可見分光光度計測試了代謝尿液的紫外-可見吸收峰.

表1 實驗組SD大鼠在12 h和24 h的尿液體積

由于SD大鼠的代謝尿液量不同，導(dǎo)致QDI-CD含量不同，實驗組2和實驗組3的QDI-CD的特征吸收峰超出紫外-可見分光光度計的測試量程，因此，將實驗組2和實驗組3的12 h和24 h代謝尿液用去離子水分別稀釋5倍到30.5 mL/36.5 mL和25.5 mL/34.0 mL. 如圖2實驗組1-3在600～1 000 nm內(nèi)有QDI-CD的特征吸收峰，最大吸收峰處的吸光強(qiáng)度分別為0.551 659、0.190 959、0.328 329. 根據(jù)朗伯比爾定律，經(jīng)折算尿液中QDI-CD的質(zhì)量分別為0.406 2、0.433 2、0.622 8 mg. 因此，QDI-CD光熱治療劑在每組SD大鼠的腎-尿代謝率分別為40.62%、43.32%、62.28%. 3組實驗組的QDI-CD光熱治療劑的平均腎-尿率達(dá)到48.74%. 研究結(jié)果表明，無論是體質(zhì)量為50 g的昆明鼠，還是體質(zhì)量達(dá)到200 g的SD大鼠，QDI-CD都有較高的腎-尿代謝率. 另外，QDI-CD腹腔注射24 h后，SD大鼠的代謝尿液中沒有QDI-CD的特征吸收峰，說明腹腔注射12 h后，QDI-CD已基本代謝完全. 這些研究結(jié)果說明QDI-CD在SD大鼠體內(nèi)能快速代謝.

圖2 腹腔注射12 h后，QDI-CD(1 mL, 1 mg/mL)的腎-尿代謝的尿液的紫外-可見吸收光譜(a)，藥物注射12 h和24 h后，不同實驗組的平均腎-尿代謝率(b)Fig.2 UV-Vis spectra of urines for the SD rats after injection of PBS and QDI-CD group 1, QDI-CD group 2 and QDI-CD group 3 at 12 h (a), and the renal clearance efficiencies at 12 and 24 h, respectively(b)

2.2 QDI-CD代謝后的高分辨質(zhì)譜

代謝前后藥物分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是評價藥物臨床應(yīng)用的重要指標(biāo)之一. 鑒于QDI-CD具有好的腫瘤光熱治療效果[9]和好的腎-尿代謝過程，進(jìn)一步研究了QDI-CD在大鼠體內(nèi)代謝前后的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性. 腹腔注射1 mL的QDI-CD(1 mg/mL)，收集SD大鼠12 h內(nèi)的尿液. 由于尿液中的成分比較復(fù)雜，為了提高高分辨質(zhì)譜測試的準(zhǔn)確度，將SD大鼠的尿液做了分離. 由于環(huán)糊精分子的修飾，QDI-CD既能溶于水溶液，又能溶于常見的有機(jī)溶劑. 因此，用二氯甲烷萃取尿液，進(jìn)而經(jīng)柱層析分離純化，再進(jìn)行質(zhì)譜分析. QDI-CD的結(jié)構(gòu)式為C168H234N2O72，理論相對分子質(zhì)量為3 432.474 4. 如圖3所示，SD大鼠尿液的高分辨質(zhì)譜為3 455.478 4，分析QDI-CD的結(jié)構(gòu)特征，3 455.478 4的質(zhì)譜峰為QDI-CD的[M+Na]+. QDI-CD的[M+Na]+的分子式為C168H234N2NaO72，相對分子質(zhì)量為3 455.464 2，高分辨質(zhì)譜圖(圖3)顯示3 455.478 4. 研究結(jié)果說明QDI-CD腎-尿代謝前后分子結(jié)構(gòu)沒有改變，QDI-CD具有非常好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.

圖3 QDI-CD腹腔注射12 h后，SD大鼠尿液的高分辨質(zhì)譜(MALDI-TOF)Fig.3 MALDI-TOF spectrum of QDI-CD in urine samples from SD rats after 12 h of intraperitoneal injection

3 結(jié)論

研究了環(huán)糊精修飾quaterrylene衍生物QDI-CD在SD大鼠中的腎-尿代謝情況，發(fā)現(xiàn)腹腔注射1 mL的QDI-CD(1 mg/mL)12 h后，QDI-CD可代謝完全，平均腎-尿代謝率達(dá)到48.74%. 另外，通過高分辨質(zhì)譜研究了SD大鼠代謝尿液中QDI-CD的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果顯示QDI-CD代謝前后分子結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變，說明其具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性. 分析QDI-CD的結(jié)構(gòu)特征可知，quaterrylene作為近紅外吸收分子具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[12]，全甲基化環(huán)糊精分子中羥基被甲氧基取代，不僅增強(qiáng)了水溶性，而且增強(qiáng)了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[13]. 此外，環(huán)糊精類衍生物不僅具有良好的水溶性，而且作為腎-尿代謝促進(jìn)分子廣泛用于腎功能研究[14]. QDI-CD分子作為腎-尿代謝型有機(jī)光熱治療劑在腫瘤治療方面具有潛在的應(yīng)用價值.