L- 精氨酸基姜黃素衍生物的合成及抑菌性評價(jià)

李海鷹，邱明恒，陳健，王桂靜，楊文智

(河北大學(xué) 藥學(xué)院，生命科學(xué)與綠色發(fā)展研究院，河北 保定 071002)

姜黃素(Cur，1,7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮)，存在于姜科和天南星科植物根莖中，經(jīng)提取并精制可獲其橘黃色粉末.姜黃素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤和抗類風(fēng)濕等天然活性，一些活性研究已進(jìn)入臨床階段，該化合物收載于《中華人民共和國藥典》，世界衛(wèi)生組織和FDA批準(zhǔn)其為天然食品添加劑[1-2].其中，姜黃素在腫瘤預(yù)防方面的研究成為熱點(diǎn)，美國國立腫瘤所已將其列為第3代癌化學(xué)預(yù)防藥[3].姜黃素水中溶解度僅11 ng/mL，體內(nèi)利用率低，限制其在臨床應(yīng)用[4].目前，研究者主要采用2種方案改善姜黃素溶解度和提高其穩(wěn)定性.其一，采用新型藥物制劑遞送方法，改善姜黃素溶解度并獲得良好的體內(nèi)生物利用度[5]；其二，采用化學(xué)方法修飾姜黃素，獲得其前體藥物，以期獲得一系列具有開發(fā)價(jià)值、具備良好藥動(dòng)學(xué)特性和生物活性的新型姜黃素衍生物[6].此外，琥珀酸和體內(nèi)必需精氨酸，均屬于機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)，參與機(jī)體代謝且具有良好水溶性[7].本文參照課題組常用的酯化條件[8-9]，以琥珀酸為連接臂，制備改善姜黃素溶解性的精氨酸基姜黃素衍生物，并評價(jià)其抑菌性能.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

ZF-1三用紫外分析儀(上海馳唐實(shí)業(yè)有限公司)；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；FT-IR 8400S傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津儀器公司)；AVANCEⅢ 600 Hz核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)；DSC-60 Plus差示掃描量熱儀(日本島津儀器公司)；Synergy HT酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司).

姜黃素、L-精氨酸、琥珀酸酐、EDC·HCl、DMAP均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉購自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白胨購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；瓊脂購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Cur-Sa-Arg的制備

琥珀酸姜黃素(Cur-Sa)的制備：取姜黃素0.494 5 g(1.34 mmol)溶于25 mL二氯甲烷中，分別加入EDC 0.249 2 g(1.3 mmol)和0.037 6 g DMAP，35 ℃恒溫水浴攪拌活化1.5 h，然后加入琥珀酸酐0.163 4 g(1.62 mmol)，反應(yīng)48 h，減壓蒸餾，取20 mL乙酸乙酯復(fù)溶，飽和食鹽水洗滌3次.柱層析分離純化得黃色產(chǎn)物，產(chǎn)量0.262 2 g，產(chǎn)率42%.

L-精氨酸甲酯的制備：-10 ℃下將6.56 g(55.07 mmol)二氯亞砜滴加到20 mL甲醇，加入L-精氨酸4 g(23.0 mmol)，35 ℃攪拌過夜，減壓蒸餾除去溶劑，加入30 mL乙醚在-20 ℃重結(jié)晶，結(jié)晶真空干燥，產(chǎn)量4.26 g，產(chǎn)率98%.

L-精氨酸基姜黃素(Cur-Sa-Arg)的制備：取琥珀酸姜黃素(Cur-Sa)0.224 7 g(0.48 mmol)，溶于30 mL二氯甲烷中，分別加入EDC 0.092 6 g(0.48 mmol)和DMAP 0.012 7 g(0.096 mmol)，于35 ℃恒溫水浴反應(yīng)2 h，加入L-精氨酸甲酯0.112 8 g(0.60 mmol)，反應(yīng)48 h，減壓蒸餾，20 mL乙酸乙酯復(fù)溶，飽和食鹽水洗滌3次，柱層析分離得紅褐色產(chǎn)物，產(chǎn)量0.102 5 g，產(chǎn)率33%.Cur-Sa-Arg的合成過程見圖1.

圖1 L-精氨酸基姜黃素合成路線Fig.1 Synthetic route of Cur-Sa-Arg

1.2.2 Cur-Sa-Arg的表征

UV-Vis分析：樣品用四氫呋喃溶解，四氫呋喃為空白，在190～600 nm波長處進(jìn)行掃描.

FT-IR分析：樣品溴化鉀壓片，在波長240～4 500 cm-1掃描，分辨率為2 cm-1，掃描50次.

1H NMR分析：樣品溶于氘代DMSO，置于AVANCE Ⅲ(600 MHz)核磁共振波譜儀中檢測.

DSC分析：樣品置于差示掃描量熱分析儀中檢測，升溫速度10 ℃ /min，起始溫度50 ℃，截止溫度為300 ℃，N2氣流保護(hù)，流速為50 mL/min.

1.2.3 Cur-Sa-Arg溶解度測定

精密稱取20 mg姜黃素，無水乙醇定容至10 mL容量瓶中，分別移取姜黃素溶液5、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 μL置于10 mL容量瓶，無水乙醇定容得姜黃素溶液質(zhì)量濃度分別為1、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 μg/mL.在紫外可見分光光度計(jì)190～600 nm處波長掃描，確定姜黃素最大吸收波長為424 nm，在此波長處測定配制姜黃素溶液的吸光度.將Cur-Sa-Arg飽和水溶液，超聲30 min，12 000 r/min高速離心10 min，取上清液200 μL，無水乙醇定容至10 mL，得待測樣品溶液備用[7].以質(zhì)量濃度x(μg/mL)對吸光度y作圖，得標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.129 5x+0.065，R=0.995 4.測定Cur-Sa-Arg樣品中姜黃素吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算Cur-Sa-Arg含量，乘上相應(yīng)稀釋倍數(shù)得其水中溶解度.

1.2.4 抑菌評價(jià)

選擇常見敏感菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、鼠沙門氏菌(Salmonellaratus)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)來驗(yàn)證Cur-Sa-Arg化合物抑菌效果.

LB液體培養(yǎng)基配置：按胰蛋白胨∶酵母粉∶氯化鈉=2∶1∶2(質(zhì)量比)加入去離子水搖勻，胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4，121 ℃下高壓蒸氣滅菌25 min，備用.

藥液配置：精密稱取25 mg Cur和Cur-Sa-Arg分別溶于0.5 mL DMSO中，充分溶解搖勻，得到50 mg/mL的藥物儲(chǔ)備液.精密量取儲(chǔ)備液100 μL，加蒸餾水稀釋至1 mL，充分搖勻，得其混懸液[10]，備用.

菌懸液制備：采用固體斜面活化法傳代2次后，用滅菌PBS pH 7.4 磷酸緩沖液3～4 mL反復(fù)沖洗固體培養(yǎng)基表面菌株，收集洗液離心，倒掉上清液，保留底部菌沉淀，加無菌緩沖液稀釋至1×105CFU/mL搖勻，備用.

抑菌評價(jià)：采用微量二倍稀釋法，在96孔板每個(gè)孔中均加入100 μL滅菌LB液體培養(yǎng)基.測試組：第1孔加入100 μL藥物混懸液，反復(fù)吹吸混合均勻后，吸取100 μL加入到第2孔，以此類推稀釋至第9孔時(shí)吸取100 μL打掉，最后加入100 μL菌液；對照組：第1孔加入100 μL空白溶劑，反復(fù)吹吸混合均勻后，吸取100 μL加入到第2孔，以此類推稀釋至第9孔時(shí)吸取100 μL打掉，最后加入100 μL菌液；空白組：加入100 μL無菌緩沖液.每組重復(fù)3次.在600 nm處，用酶標(biāo)儀測定OD值，37 ℃下靜置培養(yǎng)18 h，測定OD值.抑菌率計(jì)算公式如式1所示，求得Cur-Sa-Arg和Cur的半數(shù)抑菌濃度IC50(μg/mL).

抑菌率=(ODR-OD)/(ODR-ODB)×100%,

(1)

其中，OD為實(shí)驗(yàn)組測定孔的吸光值；ODR對照組孔的吸光值；ODB為空白組孔的吸光值.

2 結(jié)果與討論

2.1 Cur-Sa-Arg的制備及表征

本研究以琥珀酸作連接臂，通過酯化和?；磻?yīng)，將精氨酸鍵接到姜黃素上，獲得L-精氨酸基姜黃素(Cur-Sa-Arg)化合物.產(chǎn)物經(jīng)UV-Vis、FT-IR、1H NMR和DSC表征，證明成功合成.

圖2為反應(yīng)物與產(chǎn)物的紫外可見光譜圖.姜黃素溶液(圖2a)最大吸收峰出現(xiàn)在421 nm，琥珀酸酐溶液(圖2b)僅在239 nm處有強(qiáng)吸收峰，而合成的琥珀酸姜黃素化合物(圖2c)最大吸收峰紅移至410 nm，表明琥珀酸酐酯化姜黃素分子上的羥基生成單琥珀酸姜黃素，琥珀酸酐開環(huán)，其羧基與姜黃素羥基成酯.姜黃素分子中提供孤對電子的氧原子與琥珀酸羰基形成P-π共軛，羰基吸電子效應(yīng)使姜黃素共軛體系電子云密度降低，吸收峰發(fā)生紅移[11].此外，琥珀酸酐開環(huán)形成琥珀酰二羧酸，酸酐開環(huán)共軛效應(yīng)減小，使得電子躍遷需要高能量，導(dǎo)致紫外最大吸收峰藍(lán)移至253 nm處.上述變化證明Cur-Sa的成功合成.L-精氨酸甲酯(圖2d)紫外最大吸收峰出現(xiàn)在280 nm處，而姜黃素在280 nm處無紫外吸收峰.L-精氨酸基姜黃素(圖2e)在281 nm處有強(qiáng)的紫外吸收峰，推測生成Cur-Sa-Arg產(chǎn)物.

反應(yīng)物及產(chǎn)物的紅外圖譜見圖3.姜黃素(圖3a)在3 454 cm-1處出現(xiàn)酚羥基的伸縮振動(dòng)吸收，1 629和1 506 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)CH和C=C的振動(dòng)吸收峰[12].琥珀酸酐(圖3b)在2 974 cm-1處出現(xiàn)亞甲基C—H的伸縮振動(dòng)峰，1 760 cm-1處為環(huán)內(nèi)酯羰基C=O的伸縮振動(dòng)峰[13].L-精氨酸(圖3c)富含氨基、羥基和胍基，故3 000～3 400 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)紅外吸收峰，1 681 cm-1處為酰胺C=O峰，1 620 cm-1處為羧基C=O吸收峰，胍基的彎曲振動(dòng)吸收在1 544 cm-1處[14].相比姜黃素，琥珀酸姜黃素游離出單羧基，在3 436 cm-1處的吸收峰變強(qiáng)；1 695 cm-1處酯鍵伸縮振動(dòng)吸收峰以及2 916與2 842 cm-1的亞甲基和次甲基伸縮振動(dòng)吸收峰明顯變強(qiáng)[14]，顯示成功合成琥珀酸姜黃素(圖3d).與L-精氨酸相比，L-精氨酸甲酯(圖3e)的酯羰基峰出現(xiàn)在1 743 cm-1處，而1 620 cm-1處的羧基羰基吸收峰消失，可證明L-精氨酸甲酯合成.與琥珀酸姜黃素(圖3d)相比，L-精氨酸基姜黃素形成酰胺鍵，游離羧基消失，故在3 436 cm-1處吸收峰強(qiáng)度改變，3 070 cm-1處新出現(xiàn)胍基峰，1 749 cm-1處出現(xiàn)L-精氨酸甲酯的酯羰基峰，1 568 cm-1出現(xiàn)強(qiáng)酰胺Ⅱ帶吸收峰(圖3f).

a. 姜黃素；b. 琥珀酸酐；c. 琥珀酸姜黃素；d. L-精氨酸甲酯；e. L-精氨酸基姜黃素.圖2 樣品紫外-可見光譜Fig.2 UV-Vis spectra of samples

a. 姜黃素；b. 琥珀酸酐；c. L-精氨酸；d. 琥珀酸姜黃素；e. L-精氨酸甲酯；f. L-精氨酸基姜黃素.圖3 樣品紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of samples

樣品的1H NMR圖譜(600 MHz，DMSO-d6)見圖4.姜黃素(圖4a)中9.78為酚羥基的質(zhì)子峰，6.84～7.64歸屬于苯環(huán)質(zhì)子峰，3.63為環(huán)上甲氧基質(zhì)子峰[15].與姜黃素相比，琥珀酸姜黃素(圖4b)中的琥珀酸的2個(gè)—CH2—質(zhì)子峰出現(xiàn)在2.42～2.54；此外，12.1處新出現(xiàn)的峰為琥珀酸酐鍵接姜黃素羥基后游離出的單羧基質(zhì)子峰[16]，證明單琥珀酸姜黃素成功合成.L-精氨酸甲酯(圖4c)氨基和胍基質(zhì)子峰出現(xiàn)在8.69、8.50、7.99、7.89，甲氧基質(zhì)子峰出現(xiàn)在3.75，氨基酸碳鏈在1.49～4.06出現(xiàn)多重質(zhì)子峰[17].L-精氨酸基姜黃素(圖4d)中6.74～7.55歸屬為苯環(huán)質(zhì)子峰，3.62為甲氧基質(zhì)子峰，在2.41～2.70出現(xiàn)琥珀酸連接臂的2個(gè)—CH2—質(zhì)子峰，3.15～3.83處出現(xiàn)精氨酸甲酯—OCH3質(zhì)子峰，胍基和氨基質(zhì)子峰出現(xiàn)在8.21～8.62.上述1H NMR圖譜數(shù)據(jù)顯示單琥珀酸姜黃素成功連接精氨酸甲酯.

主要原料及產(chǎn)物的差示掃描量熱圖(DSC)如圖5所示.姜黃素粉末(圖5a)的熔融吸熱峰出現(xiàn)在183 ℃.琥珀酸酐(圖5b)熔點(diǎn)吸熱峰出現(xiàn)在125 ℃.L-精氨酸(圖5c)分別在223、246 ℃處出現(xiàn)2個(gè)吸熱峰，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18].酯化合成的琥珀酸姜黃素(圖5d)，在167 ℃出現(xiàn)單一熔點(diǎn)吸熱峰，佐證琥珀酸姜黃素的合成.L-精氨酸甲酯(圖5e)生成新酯鍵，其熔點(diǎn)吸熱峰呈現(xiàn)在193 ℃.L-精氨酸基姜黃素(圖5f)新形成的酰胺鍵，在232 ℃時(shí)出現(xiàn)新熔點(diǎn)吸熱峰.

a.姜黃素；b.琥珀酸姜黃素；c.L-精氨酸甲酯；d.L-精氨酸基姜黃素.圖4 樣品核磁圖譜Fig.4 1H NMR spectra of samples

a. 姜黃素；b. 琥珀酸酐；c. L-精氨酸；d. 琥珀酸姜黃素；e. L-精氨酸甲酯；f. L-精氨酸基姜黃素.圖5 樣品的差示掃描量熱圖Fig.5 DSC thermograms of the samples

2.2 Cur-Sa-Arg中Cur溶解度測定

采用紫外-可見分光光度法考察了Cur-Sa-Arg中姜黃素(Cur)的溶解度.經(jīng)溶解度實(shí)驗(yàn)測得每毫升Cur-Sa-Arg水溶液中含Cur 30.1 μg，文獻(xiàn)[4]報(bào)道Cur在水中的溶解度為11 ng/mL，制備Cur-Sa-Arg將Cur溶解度提高了約3 000倍.

2.3 Cur-Sa-Arg抑菌評價(jià)

采用測定半數(shù)抑菌濃度IC50值來評價(jià)合成的Cur-Sa-Arg對銅綠假單胞菌、大腸桿菌和鼠沙門氏菌等革蘭氏陰性菌以及革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性.

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與姜黃素相比，Cur-Sa-Arg新化合物對銅綠假單胞菌、大腸桿菌和鼠沙門氏菌等革蘭氏陰性菌的抑菌的IC50降低3～6倍，對金黃色葡萄球革蘭氏陽性菌抑菌的IC50降低2倍.結(jié)果表明，姜黃素衍生物水溶性改善，提高了姜黃素的體外抑菌力.

表1 Cur-Sa-Arg和Cur的半數(shù)抑菌濃度IC50測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文選琥珀酸作連接臂，通過酯化和?；磻?yīng)，將精氨酸鍵接到姜黃素上，獲得Cur-Sa-Arg化合物.化合物經(jīng)UV-Vis、FT-IR、1H NMR譜和DSC表征，證明成功合成Cur-Sa-Arg.相比姜黃素，Cur-Sa-Arg化合物可極大改善姜黃素水中溶解度，且化合物呈現(xiàn)更優(yōu)的抗菌性.