白花泡桐二倍體和同源四倍體抗逆基因差異表達(dá)的研究

趙曉改，李冰冰，呂鈺潔，徐賽賽，董洋，趙振利

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002)

在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中，不可避免地會(huì)遭受逆境脅迫[1]，而植物也在自然進(jìn)化過(guò)程中通過(guò)改變自身的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性來(lái)提高其抗逆性，從而保證植物的正常生長(zhǎng)。多倍化是植物自然進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力之一[2]。植物多倍化后通過(guò)調(diào)控氣孔變化、生物膜系統(tǒng)、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)、基因和蛋白質(zhì)表達(dá)[3-8]等方面使其生態(tài)適應(yīng)性和抗逆性顯著增強(qiáng)，這些生物學(xué)特性變化在對(duì)西瓜[9]、小麥[10]、大豆[11]、水稻[12]、楊桃[13]和桑樹(shù)[14]等多倍體植物的相關(guān)研究中得到了證實(shí)。泡桐在木材生產(chǎn)、改善生態(tài)環(huán)境和農(nóng)田防護(hù)林方面具有顯著作用[15]，目前在亞洲、歐洲、非洲、美洲和大洋洲的許多國(guó)家廣泛引種[16-17]。植物的形成層具有很強(qiáng)的分化能力，向外形成韌皮部，在適應(yīng)生物侵襲的防御能力和非生物脅迫中具有重要作用[18]，研究植物形成層和韌皮部的基因表達(dá)能有效篩選抗逆基因。ZHANG等[19]和XU等[20]的研究表明，四倍體泡桐在抗旱和抗鹽等抗逆性方面均明顯強(qiáng)于二倍體。本研究首次以大田8 a生白花泡桐二倍體和同源四倍體的形成層和韌皮部為材料，以白花泡桐基因組為參考序列，利用Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)白花泡桐二倍體和同源四倍體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)分析二者之間的基因表達(dá)變化情況，得到二者之間的抗逆基因，并將二、四倍體之間的差異基因進(jìn)行GO (Gene Ontology) 功能和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 代謝途徑富集分析，其結(jié)果將有助于提高對(duì)多倍體抗逆分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步了解抗逆基因表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以河南農(nóng)業(yè)大學(xué)許昌縣泡桐試驗(yàn)基地8 a生的白花泡桐(Paulowniafortunei)二倍體(PF2)和同源四倍體(PF4)為試驗(yàn)材料，分別剝?nèi)【嚯x地面1.5 m處泡桐樹(shù)干的韌皮部和形成層，迅速放于液氮中，并于-80 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 文庫(kù)構(gòu)建以及高通量測(cè)序 RNA提取參照李小凡等[21]的方法進(jìn)行，測(cè)序文庫(kù)使用Illumina由文庫(kù)試劑盒(NEBNext UltraTM RNA)生成。高通量測(cè)序參照李小凡等[21]的方法進(jìn)行，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.2 質(zhì)量控制 Clean reads(高質(zhì)量讀長(zhǎng))的獲得參照李小凡等[21]方法進(jìn)行，將clean reads比對(duì)到泡桐參考基因組序列上，進(jìn)行clean reads的GC含量計(jì)算和Q30百分比比較以及序列重復(fù)水平。

1.2.3 基因功能注釋 基因功能注釋分別采用NCB非冗余蛋白序列(Nr)、蛋白家族(Pfam)、同源蛋白群簇(KOG/COG)、非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Swiss-Prot)、KEGG以及GO，均參照DONG等[5]的方法。

1.2.4 可變剪切分析 使用分析軟件ASprofile(Version:1.0)將預(yù)測(cè)的mRNA轉(zhuǎn)錄本事件分為12類：外顯子可變剪切包括：第一個(gè)外顯子(TSS)和最后一個(gè)外顯子(TTS)；外顯子跳躍包括：?jiǎn)瓮怙@子(SKIP)、模糊邊界的單外顯子(XSKIP)、多外顯子(MSKIP)和模糊邊界的多外顯子(XMSKIP)；內(nèi)含子包括：?jiǎn)蝺?nèi)含子(IR)、模糊邊界的單內(nèi)含子(XIR)、多內(nèi)含子(MIR)和模糊邊界的多內(nèi)含子(XMIR)；5′或3′端剪切包括可變(AE)和模糊邊界的可變(XAE)。

1.2.5 差異基因的鑒定 FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)值作為mRNA的表達(dá)水平[22]。將log2(fold change)>2或<-2且P<0.05的基因選定為差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)[23]。

1.2.6 差異表達(dá)基因GO和KEGG通路富集分析 對(duì)DEGs進(jìn)行GO [http://www.geneontology.org/] 富集分析，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)[http://www.genome.ad.jp/kegg]進(jìn)行通路富集分析并預(yù)測(cè)基因的潛在功能。

1.2.7 Quantitative Real-Time PCR 隨機(jī)挑選8個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行Quantitative Real-Time PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證。引物設(shè)計(jì)如表1所示，qRT-PCR操作方法參見(jiàn)LIU等[24]的方法。18S rRNA作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct法[25]，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

表1 QRT-PCR驗(yàn)證6個(gè)轉(zhuǎn)錄本的引物序列Table 1 Primers for quantitative qRT-PCR analysis of 6 transcripts

1.2.8 泡桐與其他11個(gè)物種多酚氧化酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 其他11個(gè)物種的多酚氧化酶(PPO)的序列來(lái)源于NCBI。采用軟件MEGA7.0對(duì)泡桐和其他11個(gè)物種的PPO蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，PPO的序列進(jìn)行對(duì)比，以構(gòu)建Bootstrap值為1 000的Neighbor-Joining進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白花泡桐二倍體和同源四倍體測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

從PF2和PF4 的mRNA文庫(kù)中分別得到245 331 892和236 029 526 原始讀長(zhǎng)，去除低質(zhì)量的讀長(zhǎng)，得到有效數(shù)據(jù)分別為122 665 946和118 014 763個(gè)，其中，Q30堿基比例分別為：92.94%～93.25%，92.80%～93.83%，GC 含量約為45.18%和45.61%(表2)。分別將PF2(PF2-1、PF2-2和PF2-3)和PF4(PF4-1、PF4-2和PF4-3)的clean reads與泡桐基因組序列進(jìn)行比對(duì)，PF2比對(duì)效率為91.47%～91.79%，PF4為92.08%～92.50%(表3)。PF2和PF4轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量結(jié)果表明，插入片段在基因上的分布范圍為50～800 bp(圖1)，表明測(cè)序基因的片段長(zhǎng)度較好，可以用于后續(xù)分析。

圖1 插入片段長(zhǎng)度模擬分布圖Fig.1 Insert length simulation distribution graph

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistical analysis of sequencing reads

表3 測(cè)序數(shù)據(jù)與泡桐參考基因組的序列比對(duì)Table 3 Sequencing data and Paulownia reference genome sequence alignment

2.2 白花泡桐二倍體和同源四倍體基因表達(dá)量分析

通過(guò)箱線圖(圖2)可以看出，基因表達(dá)水平在PF2-1、PF2-2、PF2-3和PF4-1、PF4-2、PF4-3的離散程度較好(圖2-a)，能夠用于后續(xù)試驗(yàn)。生物學(xué)重復(fù)如圖2-b所示，可以看出，PF2-1、PF2-2、PF2-3和PF4-1、PF4-2、PF4-3皮爾遜相關(guān)系數(shù)為1，皮爾遜相關(guān)系數(shù)通常被用于生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性的評(píng)估指標(biāo)，說(shuō)明生物學(xué)重復(fù)性好。

2.3 白花泡桐二倍體和同源四倍體可變剪切分析

在非生物和生物脅迫的響應(yīng)中，可變剪切(AS)在基因表達(dá)過(guò)程中起顯著作用[5]。本研究中，使用分析軟件ASprofile(Version:1.0)將預(yù)測(cè)的mRNA轉(zhuǎn)錄本事件分為12類(表4)，在32 748個(gè)基因中鑒定出56 287個(gè)AS事件，其中，TSS是AS事件最多的，其次是TTS (表4)。PF2和PF4相比之下，PF4生成的AS異構(gòu)體更多，可能在調(diào)控抗逆基因表達(dá)過(guò)程中具有重要的作用。

表4 基因可變剪接類型統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of gene alternative splicing type

2.4 白花泡桐二倍體和同源四倍體基因注釋及抗逆性相關(guān)差異基因

基于泡桐參考基因組序列，共發(fā)現(xiàn)前期未被注釋的1 850個(gè)新基因的注釋信息，其中，注釋數(shù)量1 842(NR)、1 672(EggNOG)、1 240(Swiss-Prot)、1 184(GO)、1 149(Pfam)、1 054(KOG)、777(KEGG)和589 (COG)，從而進(jìn)一步豐富泡桐基因組的注釋(圖3)。

(a)FPKM箱線圖；(b) 重復(fù)相關(guān)性評(píng)估。(a) FPKM boxplot;(b) Repeated correlation assessments.圖2 樣品總體分布和重復(fù)相關(guān)性評(píng)估Fig.2 Evaluation of the overall distribution and repeated correlation of all the sample

圖3 新基因功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.3 New gene function annotation result statistics

根據(jù)差異基因標(biāo)準(zhǔn)，共獲得3 138個(gè)(圖4)差異基因，其中綠色代表1 209個(gè)下調(diào)差異基因，如與抗逆性有關(guān)的：水分通道蛋白(Aquaporin)、9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素加氧酶(NCED)、蛋白質(zhì)S-?；D(zhuǎn)移酶(S-AAT)和周期素依賴性激酶5(CDK5)。紅色圓點(diǎn)代表1 929個(gè)上調(diào)差異基因，如：超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白(14-3-3蛋白))、甜菜堿醛脫氫酶(BADH)和吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CRs)等與抗逆性有關(guān)的基因。

圖4 PF2和PF4差異表達(dá)基因火山圖Fig.4 Volcanic map of PF2 and PF4 differentially expressed genes

2.5 白花泡桐二倍體和同源四倍體差異基因qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)選擇8個(gè)DEGs，包括超氧化物歧化酶(Paulownia_CONTIG01571G000017)、多酚氧化酶(Paulownia_LG16G000444)、受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Paulownia_LG8G000614)、假設(shè)蛋白F511_21580(Paulownia_LG8G001775)、WD重復(fù)蛋白26(Paulownia_LG8G001915)、CDK5活化蛋白(Paulownia_CONTIG01571G000067)、蛋白質(zhì)S-?；D(zhuǎn)移酶 16(Paulownia_CONTIG01580G000123)和假設(shè)蛋白CDL12_29010(Paulownia_LG12G000316)利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，在PF2與PF4中，8個(gè)DEGs的相對(duì)表達(dá)量與測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致(圖5)，說(shuō)明本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果是準(zhǔn)確的。

圖5 PF2和PF4表達(dá)量qRT-PCR驗(yàn)證Fig.5 The expression levels of PF2 and PF4 verified by qRT-PCR

2.6 白花泡桐二倍體和同源四倍體差異基因功能分析

為了更好地理解3 138個(gè)DEG的功能和分類，運(yùn)用GO和KEGG進(jìn)行基因功能分析。KEGG代謝通路分析表明，差異基因共參與了116個(gè)KEGG通路(圖6)。其中，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(42)，碳代謝(37)，淀粉和蔗糖的代謝(33)，剪接體(32)等通路高度富集，表明抗逆性相關(guān)差異基因可能參與了激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。GO功能分析表明(圖7)：在生物過(guò)程類別中，代謝(701)，細(xì)胞(277)和單組織過(guò)程(247)是最豐富的；在細(xì)胞成分分類中，以細(xì)胞(750)，細(xì)胞部分(721)和細(xì)胞膜(474)最為豐富；在分子功能分類中，最豐富的是催化活性(996)，結(jié)合(920)和運(yùn)輸活動(dòng)(153)。

圖6 差異表達(dá)基因KEGG通路富集散點(diǎn)圖Fig.6 Rich distribution point diagram of differentially expressed gene KEGG pathway

圖7 差異表達(dá)基因的GO注釋分類統(tǒng)計(jì)Fig.7 GO annotation classification statistics of differentially expressed genes

2.7 泡桐抗逆性相關(guān)的基因PPO與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

PPO作為ROS的清除劑，其活性高低是衡量植物抗逆性過(guò)程中的一些重要指標(biāo)[27]。為了更深入的了解泡桐PPO的功能，泡桐和其他11個(gè)物種的PPO蛋白序列通過(guò)MEGA7.0用于進(jìn)化樹(shù)系統(tǒng)發(fā)育分析(圖8)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12個(gè)PPO蛋白序列被分為兩個(gè)分支，泡桐的PPO序列與玄參科的獨(dú)腳金和黃色猴面花，苦苣苔科的旋蒴苣苔和胡麻科芝麻的蛋白序列相似度達(dá)到78%以上，其中，泡桐與芝麻的同源性最高(88%)，與芝麻銅脅迫下PPO 活性都迅速得到提高結(jié)果一致[28]，研究結(jié)果表明，泡桐可能是通過(guò)PPO基因倍增和丟失的差異變化來(lái)響應(yīng)逆境脅迫。

圖8 12個(gè)物種的PPO蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.8 Phylogenetic tree analysis of PPO protein sequences of 12 species

3 結(jié)論與討論

SOD直接參與活性氧的解毒過(guò)程中，可有效降低活性氧濃度，在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用[29]。當(dāng)植物遭受逆境時(shí)，過(guò)氧化氫(OH-)、單線態(tài)氧(1O2)、羥基自由基(-OH)和體內(nèi)超氧根離子(O2—)等含量將會(huì)過(guò)度積累，與體內(nèi)一些有機(jī)物發(fā)生反應(yīng)而損傷細(xì)胞，造成DNA突變、蛋白質(zhì)損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化和酶失活等毒害[30-31]，而SOD能夠清除O2—形成H2O2和O2，進(jìn)一步被過(guò)氧化氫酶催化生成H2O[32]，在過(guò)去的研究中，SOD活性常常可視為一個(gè)抗逆性指標(biāo)[33]。在本研究中，SOD(Paulownia_CONTIG01571G000017)在PF4中比PF2的表達(dá)量明顯升高，推測(cè)與PF2相比，PF4四倍體具有更強(qiáng)的清除活性氧能力。

PPO作為ROS的清除劑，可直接參與應(yīng)激保護(hù)[27]。例如，在番茄中PPO活性的提高可以增強(qiáng)番茄對(duì)干旱的反應(yīng)[34]。在馬鈴薯塊莖和蘋(píng)果芽的外植體中已成功轉(zhuǎn)入外源PPO基因，顯著提高了其抗病性[35]。因此，PPOs的活性高低是衡量植物抗逆性過(guò)程中的一些重要指標(biāo)[27，36]。而在本研究中，利用高通量測(cè)序?qū)Π谆ㄅ萃┒扼w和同源四倍體進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定白花泡桐同源四倍體中與抗逆相關(guān)基因，其中，PF4的PPO(Paulownia_LG16G000444)表達(dá)量明顯高于PF2，推測(cè)PPOs在提高泡桐的抗逆性方面具有重要的作用。

14-3-3蛋白主要作為同源二聚體或異源二聚體存在于所有真核生物中，參與生物和非生物脅迫、細(xì)胞周期和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等代謝和信號(hào)通路[37]。在已報(bào)道的研究中，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)14-3-3蛋白時(shí)，棉花對(duì)干旱脅迫的耐受性增強(qiáng)[38]，這可能是通過(guò)14-3-3蛋白和H+-ATPase酶的復(fù)合物調(diào)控氣孔。本研究中，PF4的14-3-3蛋白(Paulownia_LG11G000182)表達(dá)量明顯高于PF2，推測(cè)這也可能是PF4抗逆性優(yōu)于PF2的原因之一。

植物多倍化后，通過(guò)基因表達(dá)和表觀遺傳的相應(yīng)變化來(lái)調(diào)控氣孔大小、海綿組織的結(jié)構(gòu)[3-4]、生物膜系統(tǒng)細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)[5-6]和抗氧化系統(tǒng)[7-8]，從而增強(qiáng)自身的抗逆性。前人研究結(jié)果表明，多倍體植物對(duì)干旱、高溫、低溫、病害和鹽脅迫等往往具有更強(qiáng)的抗性[12]。在建立PF2和PF4文庫(kù)并進(jìn)行高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上，本文開(kāi)展了白花泡桐二倍體和同源四倍體抗逆基因差異研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PF4的SOD(Paulownia_CONTIG01571G000017)、PPO (Paulownia_LG16G000444) 和14-3-3蛋白(Paulownia_LG11G000182)表達(dá)量明顯高于PF2，表明其可能在四倍體抗逆性機(jī)制中起重要調(diào)控作用。本研究篩選鑒定到了不同倍性白花泡桐中的抗逆相關(guān)基因并進(jìn)行了功能分析，研究結(jié)果為揭示多倍體抗逆性的分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。