超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定血漿中伏立康唑的濃度及其在深部真菌感染患者伏立康唑血藥濃度監(jiān)測中的應(yīng)用

葛 欣 劉妍妍 劉 平

山東省滕州市中心人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東滕州 277500

伏立康唑（Voriconazole）是新型第2代三唑類廣譜抗真菌藥，為氟康唑的衍生物，是治療侵襲性真菌感染（invasive fungal infection，IFI）的一線藥物[1]。由于伏立康唑的體內(nèi)藥代動力學(xué)呈非線性，并且受藥物代謝酶肝臟細(xì)胞色素P450（CYP）2C19 基因多態(tài)性和潛在的藥物相互作用影響，因此其體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)和血藥濃度具有較大的個(gè)體差異[2-3]。研究表明，伏立康唑的藥物濃度與其治療效果及用藥不良反應(yīng)高度相關(guān)，因此有必要對其進(jìn)行治療藥物濃度監(jiān)測，以提高該藥物的應(yīng)用安全性和有效性，實(shí)現(xiàn)臨床個(gè)體化用藥[4]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道的伏立康唑藥物濃度監(jiān)測方法主要為高效液相色譜（HPLC）法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[5-20]。本試驗(yàn)旨在建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確、高專屬性、高靈敏度的測定伏立康唑血藥濃度的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法，并應(yīng)用于臨床，從而保障用藥安全有效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity I-Class 超高效液相色譜儀、Sample Manager FTN自動進(jìn)樣器、Binary Solvent Manager 二 元泵、Xevo TQD 三重四級桿質(zhì)譜儀、電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）及Masslynx 4.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Waters 公司）；Milli-Q 超純水機(jī)（美國Millipore公司）；Eppendorf5804R 低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；BSA224S 電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；MD 200-2 氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）；IKA-MS3 渦旋混合器（德國IKA 公司）。

1.2 藥品及試劑

甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨（色譜純，美國Fisher Scientific 公司）；乙酸乙酯（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，北京百靈威科技有限公司，純度：97.0%）；水為超純水，由實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)自制；對照品：伏立康唑（北京百靈威科技有限公司，純度：98.0%；批號：942087）、內(nèi)標(biāo)氟康唑（中國食品藥品檢定研究院，純度：99.7%；批號：100314-201605）；空白血漿由山東省滕州市中心人民醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，為無菌采制；抗凝劑為EDTA K2，符合各項(xiàng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Acquity UPLCRBEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：水（含0.1%甲酸及2 mmol/L 甲酸銨，A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～3 min，50%A；3～4 min，50%→2%A；4～4.5 min，2%A；4.5～5 min，2%→50%A）；流速：0.1 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為ESI；正離子電離模式（ESI+）；毛細(xì)管電壓：2.88 kV；錐孔電壓：28 V；錐孔溫度：110℃；離子源溫度：450℃；脫溶劑氣氮?dú)猓∟2）流速：500 L/h；錐孔反吹氣流速：50 L/h；采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（multi reaction monitoring，MRM）掃描；用于定量分析的離子對分別為m/z 350.0→126.9（伏立康唑）和m/z 307.0→219.9（內(nèi)標(biāo)）。

2.3 溶液的配制

分別精密稱取伏立康唑10 mg 和氟康唑1 mg，分別置于10 mL 量瓶和100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別獲得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的伏立康唑儲備液和質(zhì)量濃度為10 μg/mL的氟康唑儲備液。

精密取伏立康唑儲備液適量，用甲醇依次稀釋，得到伏立康唑質(zhì)量濃度分別為20、100、500、1000、2000、4000、6000、8000、20 000 ng/mL的對照品系列溶液，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

精密取氟康唑儲備液適量，用甲醇稀釋成2.0 μg/mL的氟康唑內(nèi)標(biāo)溶液，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿樣品的處理

精密吸取血漿樣品100 μL，置于1.5 mL 離心管中，加入“2.3”項(xiàng)下的氟康唑內(nèi)標(biāo)溶液（質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL）50 μL，加入0.1 mmol/L 氫氧化鈉溶液（pH=10）50 μL，渦旋1 min，加入乙酸乙酯1 mL，渦旋5 min，于13 000 r/min（離心半徑r=6 cm）低溫離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，以N2吹干，殘?jiān)砸译?甲醇（75:25）100 μL 復(fù)溶，再以13 000 r/min（離心半徑r=6 cm）離心5 min，取上清液1 μL 進(jìn)樣分析。

2.5 血樣的采集

12例深部真菌感染患者連續(xù)給藥3 d后，于第4天給藥前1 h 采集患者外周靜脈血2～4 mL 至EDTA 抗凝管中，于3000 r/min（離心半徑r=6 cm）低溫離心5 min，取上層血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性分別取6份來自不同患者的空白血漿樣本、空白血漿+伏立康唑+內(nèi)標(biāo)、患者給藥后的血漿樣本+內(nèi)標(biāo)，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，伏立康唑和內(nèi)標(biāo)的色譜峰峰形良好，分離完全，其保留時(shí)間分別為1.56、1.08 min，空白血漿在伏立康唑和內(nèi)標(biāo)出峰處均無雜質(zhì)峰干擾，表明該方法專屬性良好。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限分別精密吸取空白血漿50 μL 至1.5 mL 離心管中，加入“2.3”項(xiàng)下的伏立康唑?qū)φ掌废盗腥芤?0 μL，混勻，配制質(zhì)量濃度為10、50、250、500、1000、2000、3000、4000、10 000 ng/mL 系列伏立康唑血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，每一份質(zhì)量濃度樣本平行測定2份，記錄色譜圖。

以伏立康唑峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y 為縱坐標(biāo)，伏立康唑質(zhì)量濃度X（ng/mL）為橫坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重系數(shù)W=1/X2）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=1.303 93×10-3X+1.002 17，r=0.9992。結(jié)果表明，該檢測方法在10～10 000 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量下限為10 ng/mL（S/N＞5），連續(xù)測定5份樣本，RSD 為4.96%。

2.6.3 精密度和準(zhǔn)確度分別配置伏立康唑的定量限、低、中、高（10、25、1500、8000 ng/mL）4個(gè)濃度的血漿樣本。按“2.4”項(xiàng)下方法處理樣本，于同日內(nèi)每一質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本平行測定5份，連續(xù)測定3 d。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本的濃度，考察方法的準(zhǔn)確度和日內(nèi)、日間精密度，準(zhǔn)確度通過計(jì)算測定濃度與理論濃度的百分比獲得，精密度通過計(jì)算RSD 獲得，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，日內(nèi)、日間RSD 均＜7%，準(zhǔn)確度在95.2%～104.8%。精密度和準(zhǔn)確度考察結(jié)果均合格。

圖1 血漿樣品的典型LC-MS/MS 色譜圖

表1 方法精密度和準(zhǔn)確度的考察結(jié)果

2.6.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取“2.6.3”項(xiàng)下的低、中、高（25、1500、8000 ng/mL）3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，每一份質(zhì)量濃度樣本平行測定6份，獲得相應(yīng)峰面積（A）。同時(shí)另取空白血漿100 μL，按“2.4”項(xiàng)下方法處理至取上清液后，加入“2.3”項(xiàng)下的伏立康唑?qū)φ掌啡芤汉蛢?nèi)標(biāo)溶液配制成濃度為25、1500、8000 ng/mL的樣品，進(jìn)樣獲得相應(yīng)峰面積（B），每一質(zhì)量濃度樣本平行測定6份。同時(shí)另取100 μL 流動相代替空白血漿，按上述方法處理，獲得相應(yīng)峰面積（C），每一質(zhì)量濃度樣本平行測定6份。按上述3種方法得到內(nèi)標(biāo)峰面積分別為A、B 和C。計(jì)算公式為：伏立康唑的提取回收率=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%；內(nèi)標(biāo)提取回收率=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%。提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果見表2。結(jié)果表明，伏立康唑的質(zhì)控樣品和內(nèi)標(biāo)的提取回收率最小為（75.3±3.25）%，最大為（89.2±5.02）%，基質(zhì)效應(yīng)最小為（86.2±8.32）%，最大為（115.3±7.29）%，RSD 均＜5%，考察結(jié)果合格。

表2 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果（n=6）

2.6.5 穩(wěn)定性考察 取“2.6.3”項(xiàng)下的低、中、高（25、1500、8000 ng/mL）質(zhì)量濃度的伏立康唑血漿質(zhì)控樣本，在室溫放置24 h，處理后自動進(jìn)樣器（4℃）放置24 h，反復(fù)凍融3次，于-80℃環(huán)境中冷凍保存60 d后，測定樣品的穩(wěn)定性，每個(gè)質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本平行測定5份。結(jié)果顯示，在上述條件下，伏立康唑的質(zhì)控樣品回收率為92.7%～102.5%，RSD 為4.7%～6.5%。結(jié)果表明，在上述穩(wěn)定性考察條件下，伏立康唑穩(wěn)定性良好。

2.6.6 伏立康唑的血藥濃度監(jiān)測 收集12例山東省滕州市中心人民醫(yī)院收治的重癥真菌感染患者，其中，男10例，女2例；年齡49～83歲，平均（65±18）歲；肺部感染10例，腹腔感染2例?；颊呔?jīng)臨床醫(yī)師診斷需要伏立康唑片（商品名：威凡，輝瑞制藥有限公司，規(guī)格：0.2 g/片，生產(chǎn)批號：C20190532）治療，在3～4個(gè)維持劑量后，在下一次給藥前1 h 于對側(cè)抽取靜脈血2～4 mL 置于EDTA 抗凝管中，3000 r/min（離心半徑r=6 cm）離心10 min，取上層血漿，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣，測定結(jié)果見表3。其中患者的穩(wěn)態(tài)谷濃度最大值為9054.24 ng/mL，最小值為817.29 ng/mL。有4例患者的血藥濃度不在推薦治療濃度范圍內(nèi)，患者出現(xiàn)惡心、發(fā)熱、皮疹、肝功能異常等明顯不良反應(yīng)。結(jié)合患者發(fā)生的不良反應(yīng)和用藥情況，已及時(shí)反饋給臨床醫(yī)師，從而對治療方案進(jìn)行調(diào)整。

表3 12例患者的臨床資料及谷濃度測定結(jié)果

3 討論

目前國內(nèi)外測定伏立康唑藥物濃度的方法主要為HPLC 法和LC-MS/MS 法[5-20]，由于LC-MS/MS 法在專屬性、靈敏度、檢測效率上的優(yōu)勢，已成為近年來治療藥物監(jiān)測的首選方法。LC-MS/MS 法中，樣品前處理方法包括固相萃取、液液萃取和蛋白質(zhì)沉淀法[10]。由于蛋白質(zhì)沉淀法通常產(chǎn)生較大的基質(zhì)效應(yīng)，而固相萃取成本較高且費(fèi)時(shí)費(fèi)力[11]，本試驗(yàn)采用液液萃取法。已有文獻(xiàn)報(bào)道的液液萃取的萃取劑包括二氯甲烷、叔丁基甲醚、乙醚-二氯甲烷、乙醚等[5-20]，本方法采用毒性較小且安全性較好的乙酸乙酯，經(jīng)驗(yàn)證提取回收率>75%，基質(zhì)效應(yīng)最小為（86.2±8.32）%，最大為（115.3±7.29）%，符合生物樣本測定要求。由于伏立康唑?yàn)槿鯄A性藥物，可加堿性試劑調(diào)節(jié)pH值以提高萃取率[5-10]。經(jīng)本試驗(yàn)驗(yàn)證，調(diào)節(jié)溶液pH=10時(shí)，萃取率達(dá)到最高。LC-MS/MS 法中內(nèi)標(biāo)選取通常以穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)為佳[13]，但價(jià)格較為昂貴，本方法采用結(jié)構(gòu)相似的氟康唑作為內(nèi)標(biāo)，其質(zhì)譜、色譜條件與伏立康唑較為接近，且信號強(qiáng)、穩(wěn)定性好。綜上所述，本研究所建立的檢測方法安全、經(jīng)濟(jì)、有效，可為伏立康唑臨床合理用藥提供支持。

根據(jù)《中國伏立康唑個(gè)體化用藥指南推薦意見》，推薦中國人群目標(biāo)血藥谷濃度范圍為0.5～5 μg/mL[22]。通過對12例患者的伏立康唑血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測，并結(jié)合臨床分析，可認(rèn)為伏立康唑谷濃度及治療時(shí)間與其不良反應(yīng)高度相關(guān)。若伏立康唑血藥濃度超過5 μg/mL，其藥物不良反應(yīng)發(fā)生率大大增加。伏立康唑具有非線性藥代動力學(xué)特點(diǎn)，并且由于15%～20%的亞洲人屬于CYP2C19 肝藥酶弱代謝者，且患者的年齡、體質(zhì)量、肝功能都會影響伏立康唑的代謝，因此同一劑量會造成不同人群伏立康唑血藥濃度的較大差異。由于本項(xiàng)研究大部分患者為老年患者，病情較為危重，且存在肝藥酶、血漿白蛋白等水平上的差異，同時(shí)受基礎(chǔ)疾病和聯(lián)合用藥的影響，在臨床上應(yīng)結(jié)合CYP2C19 基因多態(tài)性、患者個(gè)體資料、藥物相互作用等因素對患者進(jìn)行個(gè)體化給藥設(shè)計(jì)。由于伏立康唑谷濃度個(gè)體差異大，臨床上可按照體重給藥[22]，有助于提高其血藥濃度達(dá)標(biāo)率。未來研究還需要擴(kuò)大樣本量和進(jìn)一步的分析加以確認(rèn)和證實(shí)。