急性脊髓損傷后炎癥反應(yīng)、自噬和凋亡相關(guān)因子的變化以及JAK2/STAT3信號通路研究

彭 成，劉佩雷，陶 鈞，張 樂，陶奇昌，代建昊，李 強(qiáng)

急性脊髓損傷(Acute Spinal Cord Injury，ASCI)分為急性期(2周內(nèi))和慢性期(2周～6個(gè)月)病理改變，其中急性期臨床癥狀以機(jī)械性脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)破壞為主[1]，如感覺、運(yùn)動功能下降或喪失，部分患者急性期神經(jīng)缺失癥狀可能不明顯，導(dǎo)致治療延誤。而持續(xù)的炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡將進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞的功能喪失，這是導(dǎo)致ASCI后神經(jīng)功能永久性障礙的重要原因之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)，ASCI急性期和慢性期均可觀察到自噬活性的增強(qiáng)，且與神經(jīng)細(xì)胞的功能障礙有關(guān)[3]。JAK2/STAT3信號通路是真核生物體內(nèi)調(diào)控多種細(xì)胞因子和生長因子表達(dá)以及細(xì)胞增殖、分化和凋亡的重要細(xì)胞內(nèi)途徑之一，同樣也參與ASCI的發(fā)生發(fā)展過程[4]。基于此，本研究觀察大鼠ASCI后神經(jīng)細(xì)胞炎癥、自噬、凋亡相關(guān)因子的表達(dá)水平，揭示其JAK2/STAT3信號通路活化機(jī)制，從而為ASCI的靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備 主要儀器：光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，蛋白電泳儀、超聲溶解儀購自北京六一廠，PVDF膜購自美國R&D公司。主要試劑：兔抗大鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、熱休克蛋白-27(Heat Shock Protein-27，HSP-27)單克隆抗體一抗及羊抗兔對應(yīng)抗體二抗，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液均購自江蘇碧云天科技有限公司；BCA蛋白定量檢測試劑，兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白和β-actin抗體一抗及羊抗兔對應(yīng)抗體二抗均購自美國Sigma公司；兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubule-Associated Protein1 Light Chain 3，MAP1LC3)-Ⅱ抗體一抗及羊抗兔對應(yīng)抗體二抗均購自北京中杉金橋生物有限公司；Lab Works 4.5凝膠成像軟件購件美國Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 選擇健康成年8～10周齡SD雄性大鼠45只，體質(zhì)量(245±25)g，購自上海生工動物實(shí)驗(yàn)中心(動物許可證號：滬2018-04-012)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組 將45只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和JAK2抑制劑AG-490干預(yù)組，每組各15只。假手術(shù)組僅切開T9全椎板，不損傷脊髓。模型組采用改良Allen法[5]復(fù)制ASCI模型(大鼠出現(xiàn)擺尾反射、雙下肢和軀體回縮樣撲動、清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓視為造模成功)；AG-490干預(yù)組將AG-490溶于45%甲基亞楓溶劑中，在復(fù)制ASCI模型(與模型組同法)前20 min經(jīng)腹腔注入。

1.4 檢測指標(biāo) 參考Delgado[5]研究分別于損傷后6、12和24 h處死大鼠(每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只)，檢測脊髓組織中IL-6、TNF-α、HSP-27分子和MAP1LC3-Ⅱ的陽性表達(dá)率，以及JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白和Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。

1.4.1 免疫組化染色 大鼠麻醉、打開胸腔、切開右心耳、4%多聚甲醛固定40 min，經(jīng)背部切口鈍性剝離脊髓，獲取以損傷段為中心、長約1 cm的脊髓組織。常規(guī)制作脊髓組織切片，厚度5 μm，處理后滴加兔抗大鼠IL-6、TNF-α和HSP-27單克隆抗體一抗(工作濃度1∶2 000)，置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，以正常大鼠IgG代替一抗作為陰性對照；PBS溶液洗滌后滴加羊抗兔對應(yīng)抗體二抗(工作濃度1∶500)，置于濕盒中27 ℃孵育20 min；PBS溶液洗滌后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液置于濕盒中27 ℃孵育20 min；PBS溶液洗滌、DAB顯色后封片觀察。結(jié)果判定：每張切片選擇上、下、左、右和中央5個(gè)視野，以細(xì)胞核或胞漿黃染為陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞占視野中所有細(xì)胞的百分比，結(jié)果取平均值。

1.4.2 Western Blot法檢測 將獲取的脊髓組織剪成小片狀多次離心，超聲碎解后加入BCA蛋白定量檢測試劑，經(jīng)內(nèi)參β-actin抗體進(jìn)行劑量標(biāo)準(zhǔn)化。取30 μg樣品蛋白和等量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，于8%SDS-PAGE電泳分離，將分離區(qū)帶電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；滴加兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白和β-actin抗體一抗(工作濃度1∶2 000)靜置過夜；PBS溶液洗滌后滴加羊抗兔對應(yīng)抗體二抗(工作濃度1∶500)室溫孵育4 h；PBS溶液洗滌、ECL顯色，結(jié)果掃描保存，采用Lab Works4.5凝膠成像軟件進(jìn)行半定量分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值為最終結(jié)果。

1.4.3 免疫熒光標(biāo)記法檢測 脊髓組織切片經(jīng)前期處理(同1.4.1)后，滴加兔抗大鼠MAP1LC3-Ⅱ抗體一抗(工作濃度1∶500)4 ℃孵育過夜；PBS溶液洗滌后滴加熒光標(biāo)記羊抗兔抗體二抗(工作濃度1∶500)4 ℃孵育過夜；PBS溶液洗滌后DAPI染色2 min，避光條件下采用熒光顯微鏡觀察。于400倍視野下選擇上、下，左、右和中央共5個(gè)區(qū)域，計(jì)算MAP1LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)百分比。

2 結(jié)果

2.1 三組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織IL-6、TNF-α和HSP-27分子陽性表達(dá)率 與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織IL-6、TNF-α和HSP-27陽性表達(dá)率增加(P<0.05)，而干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)上述指標(biāo)低于模型組(P<0.05，圖1，圖2)。

圖1 脊髓組織IL-6、TNF-α和HSP-27分子陽性表達(dá)(免疫組化染色×100)

圖2 三組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織IL-6、TNF-α和HSP-27分子陽性表達(dá)率比較模型組同時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較，#P<0.05；干預(yù)組同時(shí)間點(diǎn)與模型組比較，*P<0.05

2.2 三組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織p-JAK、p-STAT3蛋白表達(dá)水平增加，而干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)上述指標(biāo)均低于模型組(P<0.05)；三組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織JAK2、STAT3總蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3、圖4)。

圖3 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和β-actin蛋白表達(dá)

圖4 三組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平的比較模型組同時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較，#P<0.05；干預(yù)組同時(shí)間點(diǎn)與模型組比較，*P<0.05

2.3 三組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織MAP1LC3-Ⅱ陽性表達(dá)率 與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)組織MAP1LC3-Ⅱ陽性表達(dá)率增加，而干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)均低于模型組(P<0.05，圖5，圖6)。

圖5 脊髓組織MAP1LC3-Ⅱ陽性表達(dá)(×400)

圖6 三組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織MAP1LC3-Ⅱ陽性表達(dá)率比較模型組同時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較，#P<0.05；干預(yù)組同時(shí)間點(diǎn)與模型組比較，*P<0.05

2.4 三組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織Caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)組織Caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平均增加，而干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)上述指標(biāo)均低于模型組(P<0.05，圖7)。

圖7 三組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織Caspase-3和bax/bcl-2蛋白表達(dá)水平比較模型組同時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較，#P<0.05；干預(yù)組同時(shí)間點(diǎn)與模型組比較，*P<0.05

3 討論

繼發(fā)神經(jīng)細(xì)胞功能障礙是ASCI的主要病理機(jī)制，也是改善患者生存預(yù)后的重要靶點(diǎn)。根據(jù)既往報(bào)道，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和自噬行為在ASCI繼發(fā)神經(jīng)細(xì)胞功能障礙的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要角色。揭示ASCI后實(shí)驗(yàn)動物脊髓組織的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)因子的水平，同時(shí)觀察靶向干預(yù)JAK2/STAT3信號通路對上述病理過程的影響，對于理解疾病發(fā)生機(jī)制以及提供針對性干預(yù)位點(diǎn)具有重要意義。

3.1 ASCI后神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)因子變化 早期炎癥反應(yīng)的敏感標(biāo)志物有IL-6、TNF-α和HSP-27等[6]。HSP-27是細(xì)胞在缺氧、應(yīng)激環(huán)境下大量表達(dá)的一種損傷修復(fù)分子，主要發(fā)揮“分子伴侶”的功能，在不同細(xì)胞局部環(huán)境誘導(dǎo)下，發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。也就是說，HSP-27既可降低損傷細(xì)胞DNA折疊錯誤率、增強(qiáng)細(xì)胞抵御損傷因素的能力，又可激活細(xì)胞周期分裂，促使細(xì)胞DNA錯配和異常蛋白的翻譯和表達(dá)[7]。Boraiah等[8]研究指出，與第0天比較，第30天HSP-27表達(dá)顯著下調(diào)，HSP-27可能在脊髓損傷中發(fā)揮重要作用。Nasouti等[9]研究指出，海藻糖可以通過調(diào)節(jié)HSP-27和HSP-70及Caspase-3基因的表達(dá)來保護(hù)脊髓免受損傷。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組6、12、24 h脊髓組織IL-6、TNF-α和HSP-27陽性表達(dá)率均高于假手術(shù)組，而干預(yù)組則低于模型組(P<0.05)，提示炎癥反應(yīng)紊亂參與了ASCI的發(fā)生過程，干預(yù)JAK2/STAT3信號通路能夠抑制炎癥反應(yīng)，阻止ASCI進(jìn)程。

需要強(qiáng)調(diào)的是，JAK2/STAT3信號通路的活化既需要炎癥因子IL-6和TNF-α的誘導(dǎo)，同時(shí)又可加劇炎癥因子的釋放，形成炎癥瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)傷[10]。因此，本研究觀察到，除了假手術(shù)組，模型組和干預(yù)組IL-6、TNF-α和HSP-27陽性表達(dá)率隨損傷時(shí)間的延長而不斷升高，24 h內(nèi)未觀察到峰值出現(xiàn)，提示炎癥反應(yīng)可伴隨ASCI發(fā)生的早期全過程，且隨時(shí)間延長而程度加重[11]。

3.2 ASCI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)因子變化 凋亡機(jī)制在ASCI中也起到重要作用。凋亡下游多種途徑的共同效應(yīng)因子Caspase-3是蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的組成部分，主要通過對蛋白激酶、核酸酶及細(xì)胞骨架的裂解，產(chǎn)生核皺縮、DNA片段等凋亡現(xiàn)象，最終控制凋亡的發(fā)生和進(jìn)程[12]，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞凋亡的程度。Bax/Bcl-2比值則往往決定凋亡的方向，當(dāng)抗凋亡分子Bcl-2/促凋亡分子Bax>50%時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)明顯的抗凋亡效應(yīng)[13]。Yuan等[14]研究指出，神經(jīng)節(jié)苷脂能夠抑制急性脊髓損傷大鼠Caspase-3的表達(dá)水平，進(jìn)而提高神經(jīng)生長因子濃度和改善脊髓損傷癥狀。Wang等[15]研究指出，丙種球蛋白缺乏通過促進(jìn)小鼠神經(jīng)炎癥(TNF-α/IL-1β/IL-6/IL-10)和細(xì)胞凋亡(Bax/Bcl-2)加重脊髓損傷。反映自噬活性的標(biāo)志性蛋白有MAP1LC3、Atgl2與Atg5復(fù)合體等，其中AP1LC3-Ⅰ和AP1LC3-Ⅱ參與自噬體的形成，AP1LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成AP1LC3-Ⅱ，定位于自噬體膜上，其含量與自噬體數(shù)目成正比[16]。Wang等[17]研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓損傷48 h自噬體膜上標(biāo)志性的MAP1LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯升高。本研究結(jié)果證實(shí)，模型組6、12和24 h脊髓組織MAP1LC3-Ⅱ陽性表達(dá)率、Caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)組，而干預(yù)組則低于模型組(P<0.05)。提示細(xì)胞自噬和凋亡參與了ASCI的發(fā)生過程，靶向干預(yù)JAK2/STAT3信號通路可抑制細(xì)胞自噬和凋亡水平。

3.3 JAK2/STAT3信號通路干預(yù)機(jī)制 JAK2/STAT3信號通路已被證實(shí)在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)控、腫瘤發(fā)生中發(fā)揮十分重要的作用。陳霄雷等[18]研究指出，大鼠ASCI后應(yīng)用AG490干預(yù)可阻斷JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)大鼠雙下肢運(yùn)動能力的恢復(fù)。在生理狀態(tài)下，JAK2/STAT3處于非磷酸化，機(jī)體受應(yīng)激刺激時(shí)可發(fā)生瞬時(shí)、快速的磷酸化轉(zhuǎn)化，持續(xù)時(shí)間較短，約6～12 h，然后快速消失。而通過胞內(nèi)段的酪氨酸蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)，與相應(yīng)受體如IL-6、TNF-α、HSP-27等相結(jié)合，JAK2/STAT3可激活下游各種靶蛋白的酪氨酸殘基，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[19]。JAK2/STAT3信號通路在ASCI發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可影響炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬和凋亡的進(jìn)程，進(jìn)而影響神經(jīng)功能的損傷和恢復(fù)情況。在神經(jīng)損傷領(lǐng)域，STAT3也是一種具有關(guān)鍵作用的雙功能蛋白，靶向阻斷JAK2/STAT3信號通路激活可明顯減輕大鼠中樞和外周神經(jīng)組織創(chuàng)傷性或缺血損害，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能缺損。Xia等[20]研究指出，模型組p-JAK2、p-STAT3、IL-6、TNF-α和LC3-Ⅱ的表達(dá)水平以及Caspase-3和Bax/Bcl-2的mRNA表達(dá)水平均顯著高于AG-490干預(yù)組，假手術(shù)組最低(P<0.05)。認(rèn)為JAK2/STAT3信號通路可介導(dǎo)大鼠ASCI發(fā)病后早期的自噬和凋亡活動。吳楠等[21]研究指出，脊髓損傷后miR-136-5p沉默可抑制STAT3的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥因子的過度表達(dá)，最終抑制脊髓炎癥反應(yīng)。本研究中模型組6、12和24 h脊髓組織p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)組，而干預(yù)組則低于模型組(P<0.05)。提示JAK2/STAT3通過激活后參與了ASCI的發(fā)生過程，而靶向干預(yù)JAK2/STAT3信號通路的激活程度能夠影響ASCI進(jìn)程。而各組間脊髓組織中JAK2和STAT3總蛋白表達(dá)水平變化不明顯，提示只有處于激活狀態(tài)的JAK2/STAT3才能發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能，影響ASCI過程。

綜上所述，ASCI早期病理改變可能涉及神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、自噬、凋亡以及JAK2/STAT3信號通路的活化，靶向干預(yù)JAK2/STAT3信號通路的活化可抑制ASCI進(jìn)程，進(jìn)而為ASCI的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。