基于網(wǎng)絡藥理學及GEO數(shù)據(jù)分析探究赤芍治療IgAN的作用機制研究

龐欣欣，邢玉鳳，彭紫凝，石秀杰，張雅歌，韓佳瑞

IgA腎病(IgA Nephropathy，IgAN)是全球最常見的免疫相關性腎小球炎癥疾病，約占原發(fā)性腎小球疾病的20%～47%，主要以半乳糖缺陷型IgA與抗體復合物沉積于腎小球系膜區(qū)為病理特征[1]。大多數(shù)IgAN患者呈慢性進展性發(fā)展，約有15%～40%的IgAN患者在確診后20年內(nèi)發(fā)展為終末期腎病[2]。臨床中IgAN多以血尿、蛋白尿、高血壓及腎功能損害為主要表現(xiàn)，但由于其發(fā)病機制尚不明確，傳統(tǒng)的激素、免疫抑制劑、ACEI類等西藥藥物治療不能完全阻止IgAN病情的進展，部分患者不可避免的進入終末期腎病，甚至需要透析治療[3-4]。

傳統(tǒng)醫(yī)學認為IgAN病機多與血瘀、熱邪有關，多將其歸于尿血、癃閉等范疇[5]。赤芍為毛茛科芍藥或川赤芍的干燥根，味苦、微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱涼血、散瘀鎮(zhèn)痛之功效[6]。其化學成分復雜，主要包括單萜苷類化合物、鞣花酸、谷甾醇、兒茶素等成分[7]。現(xiàn)代藥理實驗證明，赤芍具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、降血脂、降血壓、抗動脈硬化、抗腫瘤、保肝等作用[8]。以赤芍為組方的方藥對IgAN有良好的治療效果[9]。目前,關于赤芍的研究多集中在化學成分、藥理作用等方面，缺乏對其在特定疾病中藥物作用機制的探討。

網(wǎng)絡藥理學是近年來的新興技術，在中藥抗病機制研究方面具有優(yōu)勢，能夠通過建立“藥物-靶點-基因-疾病”相互作用關系網(wǎng)絡，從多靶點角度對藥物成分作用于疾病的機制進行綜合分析。基因表達綜合(Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫，收錄了生物學領域大量的高通量實驗數(shù)據(jù)，能夠對與疾病發(fā)展密切聯(lián)系的基因進行分析，與網(wǎng)絡藥理學結合更加符合中醫(yī)藥學整體性和系統(tǒng)性的基本特點[10]。本研究以網(wǎng)絡藥理學方法為指導系統(tǒng)分析了中藥赤芍可能治療IgAN的活性成分和作用機制，同時采用GEO數(shù)據(jù)庫來驗證關鍵靶點，證實本研究的可行性，為赤芍治療IgAN活性成分的開發(fā)和作用機制研究提供參考。

1 方法

1.1 赤芍有效成分和靶點篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)挖掘赤芍的所有化學成分，根據(jù)各個成分的吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)及排泄(Excretion)，即ADME參數(shù)篩選有效成分，其中篩選條件為藥物口服生物利用度(Oralbioavailability，OB)≥30%，類藥性(Drug like，DL)≥0.18。同時以“Chishao”為關鍵詞在該數(shù)據(jù)庫對赤芍有效成分進行靶點篩選，采用Cytoscape 3.7.2軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.2 IgAN的相關靶點檢索 GeneCards是公共集成數(shù)據(jù)庫，提供了約150個網(wǎng)絡來源的以人類基因為中心的全面基因注釋和預測信息，包括基因組學、轉錄組學、遺傳信息學、臨床基因信息等。以“IgA nephropathy”為關鍵詞在GeneCards里篩選與IgAN有關的所有靶點，并在DrugBank、DisGeNET、GAD等數(shù)據(jù)庫中篩選補充。

1.3 赤芍-IgAN作用靶點篩選及PPI網(wǎng)絡構建 將獲得的赤芍有效成分靶點和IgAN靶點基因進行Venn分析，獲得兩者交集靶點基因。藥物調(diào)控機體的病理生理過程網(wǎng)絡關系復雜，除直接作用靶點外，有多重間接調(diào)控方式，蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡可以輔助探索蛋白質之間的潛在相互作用，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點，為數(shù)據(jù)的構建與挖掘提供新方式。STRING數(shù)據(jù)庫可以預測蛋白質之間的相互關系并構建PPI網(wǎng)絡，利用該數(shù)據(jù)庫構建赤芍作用靶點與IgAN靶點的交集PPI網(wǎng)絡并篩選核心靶點。篩選參數(shù)設置主要有生物機體選擇為人類，最低要求交互分數(shù)設置最高置信度0.4。

1.4 赤芍治療IgAN網(wǎng)絡調(diào)控可視化 基于赤芍和IgAN的蛋白互作靶點數(shù)據(jù)，引入赤芍可作用于IgAN的有效成分，提取兩者交集，采用Cytoscape 3.7.2軟件把這些數(shù)據(jù)制作成可視化網(wǎng)絡圖，其中“圓形”代表靶蛋白，“三角形”代表分子，以“邊”表示不同成分與靶點之間的關系，挖掘其相互之間的作用關系。即得到赤芍治療IgAN的疾病-藥物-分子-靶點調(diào)控網(wǎng)絡圖。

1.5 GEO芯片差異基因驗證 利用GEO數(shù)據(jù)庫，搜索“IgA Nephropathy”，物種選擇人類，選擇基因數(shù)據(jù)，下載基因矩陣與平臺數(shù)據(jù)文件，運用Perl腳本將下載的探針對應為基因ID。采用R語言中“Limma”安裝包，篩選在IgAN組和正常組模型中高表達或低表達的差異基因，獲取高表達和低表達的差異基因，其中限定條件P<0.05。

1.6 GO和KEGG富集分析 DAVID(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)數(shù)據(jù)庫廣泛應用于基因注釋，可通過該數(shù)據(jù)庫挖掘基因與疾病的相關性。GO分析是生物學領域中用于基因產(chǎn)物細胞功能、分子功能和生物功能的分類系統(tǒng)，可以通過DAVID工具進行GO富集分析。同時應用DAVID工具對赤芍和IgAN交集蛋白靶標基因進行KEGG通路富集分析，得到赤芍治療IgAN的主要作用通路。GO和KEGG富集分析，考察赤芍的潛在靶標可能具有的生物學功能，參與的生物學通路。校正統(tǒng)計學超幾何分布定量(P.adjust值)來評估存在于各GO和KEGG注釋中的蛋白生物學功能和通路富集情況的顯著性，P.adjust值在圖中顏色越紅，顯著性越強。

2 結果

2.1 赤芍有效成分及靶點篩選結果 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫中赤芍所有成分，按照OB≥30%和DL≥0.18篩選出赤芍有效成分29個。再對赤芍有效成分進行所有靶點篩選，刪除未有靶點富集的成分，得到13個有效成分和80個相關靶點，并對數(shù)據(jù)進行分析，表1、圖1。

表1 赤芍有效活性成分

圖1 赤芍活性成分及有效靶點六邊形代表赤芍，三角形代表赤芍13個成分，圓形代表赤芍的所有靶點

2.2 IgAN的相關靶點檢索結果 在GeneCards、DrugBank、DisGeNET、GAD等數(shù)據(jù)庫中篩選IgAN相關靶點，刪除重復值，共得到1 267個與疾病相關的靶點。

2.3 赤芍-IgAN作用靶點及靶蛋白互作關系分析 將80個赤芍有效成分靶點和1 267個IgAN靶點基因進行Venn分析，得到35個共同靶基因，圖2。采用STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，得到271條PPI關系，圖3。依據(jù)其富集節(jié)點數(shù)目，對靶點做出柱狀圖，得到赤芍-IgAN核心靶點。其中橫軸為富集節(jié)點數(shù)目，縱軸為靶點基因名稱，核心靶點圖，圖4，主要有蛋白激酶-1(AKT1)、炎癥因子-6(IL-6)、c-JUN氨基末端激酶(JUN)、環(huán)氧合酶-2(PTGS2)、血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGFA)、半胱氨酸依賴性天冬氨酸特異性蛋白酶家族胱天蛋白酶(CASP3)、基質金屬蛋白酶-9(MMP9)、過氧化氫酶(CAT)、趨勢因子白細胞介素-8(CXCL8)、磷酸化c-FOS抗體(FOS)等。

圖2 赤芍活性成分有效靶基因與IgAN相關靶基因

圖3 赤芍與IgAN的PPI關系圖黃色：蛋白互作關系；黑色：基因共表達的關系；淺藍色：蛋白同源性；深藍色：基因共進化；紅色：基因融合；綠色：基因臨接

圖4 赤芍治療IgAN的核心作用靶點

2.4 赤芍治療IgAN網(wǎng)絡可視化分析 通過進行赤芍治療IgAN的疾病-藥物-分子-靶點互相作用網(wǎng)絡的可視化分析，納入上述PPI網(wǎng)絡篩選的35個基因和分析篩選得到11個赤芍可用有效成分，同時在網(wǎng)絡中加入疾病和藥物使網(wǎng)絡圖更加直觀，圖5。

圖5 赤芍-IgAN-有效成分-靶點網(wǎng)絡關系圖六邊形代表赤芍，菱形代表IgAN，三角形代表赤芍11個有效作用成分，圓形代表赤芍作用于IgAN的35個靶點

2.5 GEO芯片差異基因驗證 獲取GEO數(shù)據(jù)庫下載的GSE93798芯片與平臺數(shù)據(jù)。共計樣本42個，其中正常樣本22個，IgAN樣本20個。分析得到具有顯著性差異基因347個，基因高表達為紅色，基因低表達為綠色，得到熱圖圖6。通過分析差異基因，驗證赤芍治療IgAN的前10個關鍵靶點，其中將具有顯著性差異的靶點FOS、JUN做出箱式圖，圖7，P表示差異性。

圖6 GSE93798芯片分析熱圖

圖7 關鍵靶基因FOS和JUN差異分析圖*P<0.01

2.6 GO功能富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對赤芍和IgAN交集蛋白靶基因進行GO富集分析，得到赤芍可治療IgAN的作用靶點的生物學功能50種，綜合分析后取前20種功能特性，表2。

表2 赤芍治療IgAN作用靶點GO功能富集分析(前20位)

赤芍有效成分靶點主要通過肽鏈內(nèi)切酶活性、DNA結合轉錄激活活性、RNA聚合酶II型特異性、血紅素結合性、四吡咯結合性、泛素蛋白連接酶結合性等生物學功能特性治療IgAN，圖8。氣泡顏色越紅，則P.adjust值越高，顯著性越強，氣泡越大，則該生物學功能富集的靶點越多。

圖8 赤芍治療IgAN的相關生物學功能“count”值代表與該生物學功能相關的靶點數(shù)量，P.adjust值表示顯著性

2.7 KEGG信號通路富集分析 采用DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG信號通路分析，得到赤芍治療IgAN的信號通路有120條，綜合分析后取前20條信號通路，表3。

表3 赤芍治療IgAN有效靶點KEGG信號通路富集分析(前20位)

KEGG分析顯示，赤芍治療IgAN的有效靶點主要通過乙型肝炎(Hepatitis B)通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路等多條信號通路產(chǎn)生作用，圖9。其中柱形圖顏色越紅，則P.adjust值越高，顯著性越強，柱形越長，則該通路富集的靶點越多。

圖9 赤芍治療IgAN關鍵信號通路橫軸代表在該信號通路上的靶點數(shù)量，P.adjust值表示顯著性

3 討論

IgAN發(fā)病機制復雜，單純的西醫(yī)治療不能有效阻止疾病進展。近年來，中醫(yī)藥在防治IgAN發(fā)生發(fā)展、延緩腎功能惡化等方面取得了較大進展，臨床實踐發(fā)現(xiàn)，活血化瘀藥可以減輕IgAN患者的血尿等癥狀[11]。反復發(fā)作性血尿是其主要特征之一，醫(yī)家們認為“出血證多伴有瘀血”等觀點，正如唐容川所云[12]：“離經(jīng)之血,與好血不相合，是謂瘀血”，同時王麗萍等[13]發(fā)現(xiàn)血瘀證與IgAN腎組織病理損害有一定正相關性，能夠反映IgAN的腎臟病變輕重程度，提示瘀血是貫穿IgAN始終的重要因素。另外，熱邪侵襲也可導致IgAN患者血尿的生成，如《金匱要略》“熱在下焦者,則尿血”，熱邪入血，血熱互結，血受熱煎，不暢而瘀，正如《醫(yī)林改錯》曰：“血受熱則煎熬成塊”。陳香美等[14]對IgAN中醫(yī)證候的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，熱邪和血瘀證是IgAN最為常見的標證,分別占31.6%和28.9%，這也進一步說明，除血瘀證外，熱邪也是IAgN的重要病機。

赤芍性寒、歸肝經(jīng)，為我國傳統(tǒng)的清熱活血類中藥,有著悠久的用藥歷史,《醫(yī)學衷中參西錄》記載“化瘀血，赤者較優(yōu)……為其能化毒熱之瘀血不使?jié)⒛撘病盵15]，臨床常用于治療瘀滯疼痛、癰腫瘡毒、出血等。血尿是臨床上IgAN患者最常見的癥狀之一，可由血瘀所致[16]。李康康等[17]發(fā)現(xiàn)，以赤芍為君藥的活血通絡方能夠改善IgAN患者肌膚甲錯、腰痛固定、舌紫黯等血瘀癥狀，并可以有效降低患者尿紅細胞數(shù)目、血肌酐、尿素氮等。同時有研究者發(fā)現(xiàn)[18]，在大量臨床IgAN治療醫(yī)案中，以赤芍為組方的枸芪復腎丸也能夠改善IgAN患者血尿情況。這些研究提示，赤芍對于改善IgAN患者癥狀具有良好效果。

本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法篩選出赤芍中有13個主要活性成分及80個靶點，在GeneCards、DrugBank、DisGeNET、GAD等數(shù)據(jù)庫中得到IgAN靶點基因1 267個，與赤芍的靶點映射得到赤芍治療IgAN的靶基因35個?？芍嗌种委烮gAN具有多成分、多靶點的特點。綜合分析“藥物-疾病靶點”網(wǎng)絡和PPI網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)赤芍治療IgAN的關鍵化合物有芍藥苷、兒茶素、鞣花酸、黃芩甙元、β-谷甾醇、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、(2 r,3 r)4-methoxyl-distylin、7-豆甾烯-3β-醇、菜油甾-5烯-3β-醇等，關鍵靶點涉及AKT1、IL6、JUN、PTGS2、VEGFA、CASP3、MMP9、CAT、CXCL8、FOS等。通過對GEO數(shù)據(jù)庫臨床樣本GSE93798芯片的基因矩陣與平臺數(shù)據(jù)文件進行分析，篩選差異基因，驗證了在赤芍治療IgAN的前10關鍵靶點中FOS和JUN具有顯著性差異，進一步證實了本研究的結論。

赤芍總苷是赤芍的主要活性成分，其中又以芍藥苷為主。赤芍總苷具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)[19]，赤芍總苷能夠阻斷體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)Toll樣受體的活化、抑制巨噬細胞浸潤，降低腎病大鼠24 h尿蛋白排泄率，改善腎功能，延緩腎臟疾病進展。赤芍的另一活性成分兒茶素也具有降低蛋白尿、改善腎功能的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素可通過抑制氧化應激反應、調(diào)節(jié)腎小球系膜細胞周期調(diào)控蛋白表達,抑制腎臟系膜細胞增殖,改善腎小球基底膜通透性,降低蛋白濾過,改善血脂代謝及腎臟功能,延緩腎臟病理慢性進展[20]。本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法發(fā)現(xiàn)赤芍可能主要利用以上化合物對IgAN發(fā)揮治療作用。

為進一步分析赤芍治療IgAN靶點所涉及的信號通路和生物過程，本研究對赤芍治療IgAN的靶點進行了KEGG信號通路和GO功能富集分析。KEGG信號通路富集分析得到與赤芍治療IgAN相關的信號通路有120條，其中主要涉及Hepatitis B通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等。這些通路大多數(shù)與免疫調(diào)節(jié)、炎癥有關，符合IgAN的病理診斷特點。其中Hepatitis B通路主要指HBV感染。HBV感染具有廣嗜性，除肝臟外，還能在其他多種臟器中復制，損害相應臟器，而腎臟是最常受累的肝外組織之一。大多數(shù)學者認為IgAN是由免疫復合物IgA沉積導致的免疫損傷造成的,且認為HBV所形成的HBsAg抗原抗體免疫復合物在腎小球內(nèi)沉積導致的免疫損傷是引發(fā)乙肝相關性腎炎的主要原因[21]。熊子波等[22]研究發(fā)現(xiàn)，伴有HBV感染的IgAN患者，其HBsAg主要在腎小球系膜區(qū)沉積。同時有學者研究顯示，HBV感染率與IgAN發(fā)病率呈正相關[23]。這在一定程度上說明了HBV感染與IgAN密切相關。相關文獻表明[24]赤芍能夠通過降低HBsAg表達，抑制HBV復制，提示赤芍可能是通過影響HBV通路，改善機體免疫能力來治療IgAN。

IL-17是一種強大的前炎性細胞因子，也是炎性反應的微調(diào)因子，參與腎臟炎性反應的發(fā)生和發(fā)展[25]。研究發(fā)現(xiàn)IgAN患者尿液中IL-17水平明顯增加[26]，而患者血清IL-17水平與24 h尿蛋白呈正相關[27]，這些結果提示IL-17可能參與IgAN的發(fā)病。林佳如等[28]發(fā)現(xiàn)，IL-17可促進半乳糖缺陷型IgA的分泌及免疫復合物IgA的腎臟沉積，引起IgAN的發(fā)生，進一步提示IL-17參與了IgAN免疫發(fā)病機制及進展。在TNF信號通路中，TNF超家族成員13(TNFSF13)、TNF-α發(fā)揮了重要作用。其中TNFSF13已被確定為IgAN的易感基因，且血漿中高水平的TNFSF13與IgAN的預后較差有關[29]。而TNF-α作為一種由免疫細胞分泌的多效應細胞因子，具有抗腫瘤、抗炎和調(diào)節(jié)免疫功能。Lai等[30]發(fā)現(xiàn)，當發(fā)生IgAN時腎小球系膜細胞分泌的TNF-α上升，上調(diào)足細胞中TNF-α及TNF-αR2表達，進而加重炎癥反應。同時TNF-α也可導致足細胞相關蛋白下調(diào)，腎小球濾過膜通透性增加，進而造成蛋白尿[31]。在多種慢性腎臟疾病中，赤芍具有調(diào)節(jié)腎臟TNF-α等炎癥因子表達、減輕蛋白尿的功能[32]。這些研究進一步提示本研究預測通路的可行性。除此之外，本研究結果還顯示，富集群還包括沙門氏菌感染、人巨細胞病毒感染、HIV等疾病，同時直腸癌、小細胞肺癌等癌癥相關信號通路也被顯著富集。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，赤芍主要通過肽鏈內(nèi)切酶活性、DNA結合轉錄激活活性、RNA聚合酶II型特異性、血紅素結合性、四吡咯結合性、泛素蛋白連接酶結合性等生物學功能特性治療IgAN，這些生物過程均與IgAN的發(fā)生有關，也體現(xiàn)了赤芍多成分、多靶點、多通路治療IgAN的特點。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的科學手段，對赤芍治療IgAN的機制進行了初步探討，發(fā)現(xiàn)赤芍在治療IgAN方面的多成分、多靶點、多通路的特點，同時采用GEO數(shù)據(jù)庫對關鍵靶點進行分析驗證，證實本研究可行性，為深入探討其作用機制提供了科學依據(jù)。但是，本研究不可避免的存在一些不足之處，缺乏體內(nèi)外實驗探索，本課題組將對此進行進一步機制研究，為臨床治療IgAN提供新思路。