基于生物信息學(xué)分析ADD3在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的表達及臨床意義

石 林，劉薇婉，張帥帥，任翠愛

彌漫性大B細胞淋巴瘤(Diffuse Large B Cell Lymphoma，DLBCL)是最常見的淋巴瘤類型，約占成人非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，在發(fā)展中國家所占比例更高。DLBCL在表觀遺傳學(xué)、治療反應(yīng)、預(yù)后等方面存在較大的異質(zhì)性。一線R-CHOP治療方案使60%患者能夠長期生存，但仍有40%的患者存在治療無效或短暫緩解后復(fù)發(fā)的現(xiàn)象[1]。因此，積極尋找新的可以提示DLBCL患者預(yù)后的獨立生物標志物，具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫篩選目標基因 Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/resource/login.html)搜索設(shè)置是①分析類型：Cancer vs Normal Analysis；②癌癥類型：Diffuse Large B-Cell Lymphoma；③數(shù)據(jù)類型：mRNA。設(shè)定條件：under-expression，選擇Diffuse Large B-Cell Lymphoma點擊compare進行分析。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 分析ADD3在不同腫瘤的表達情況 搜索設(shè)置是①基因輸入：ADD3；②THRESHOLD(PVALUE):1E-4；THRESHOLD(FOLD CHANGE)：2；THRESHOLD(GENE RANK)：TOP 10%；③數(shù)據(jù)類型：mRNA。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 分析ADD3在DLBCL樣本中的表達 搜索設(shè)置是①基因：ADD3；②癌癥類型：Diffuse Large B-Cell Lymphoma；③數(shù)據(jù)類型：mRNA/DNA。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 GEO數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù)集組進行生存分析 Oncomine數(shù)據(jù)庫搜索設(shè)置是①分析類型：Cancer vs Normal Analysis；②癌癥類型：Diffuse Large B-Cell Lymphoma；③臨床數(shù)據(jù)：Survival Status；選擇合適的數(shù)據(jù)集，在PUBMED上下載數(shù)據(jù)集組，進行生存分析。

1.5 基于GEPIA2在線分析網(wǎng)站驗證ADD3基因與DLBCL異質(zhì)性生物特征分子的相關(guān)性 登錄GEPIA2網(wǎng)站(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)，選擇癌癥類型DLBCL，對ADD3進行“Correlation Analysis”驗證。

1.6 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析驗證ADD3在DLBCL不同亞組中表達情況 登陸癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)分析網(wǎng)站(UALCAN)(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)，①Gene Symbol：ADD3；②TCGA dataset：Lymphoid Neoplasm Diffuse Large B-cell Lymphoma。點擊“explore”；③Links for analysis：Expression，對不同亞組進行分析。

2 結(jié)果

2.1 分析篩選出目的基因ADD3 篩選結(jié)果顯示Oncomine數(shù)據(jù)庫共計收錄了40個有關(guān)DLBCL的數(shù)據(jù)合集，總計樣本數(shù)據(jù)2 194個。其中符合DLBCL中“Cancer vs Normal Analysis”設(shè)置的數(shù)據(jù)集共7個，總計551個樣本數(shù)據(jù)。篩選得到排名前200的低表達基因，除去已經(jīng)被研究報道過的基因，得到目的基因ADD3，ADD3在薈萃分析中，位于顯著低表達基因的104位，中位秩次492.0，P=0.02。

2.2ADD3在不同腫瘤中的差異表達情況 檢索ADD3在不同腫瘤中的差異性表達，結(jié)果顯示，Oncomine數(shù)據(jù)庫共收錄了有關(guān)ADD3的研究共692項，樣本數(shù)量總計82 519個。其中符合條件的數(shù)據(jù)集共455項，有5項研究顯示ADD3在腫瘤樣本中顯著高表達，26項研究顯示ADD3在腫瘤組織中顯著低表達，其中有11項研究顯示ADD3在淋巴瘤中低表達。這11項研究具體包括DLBCL，霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤。

2.3ADD3在DLBCL樣本中的表達情況 篩選出8個符合篩選條件的數(shù)據(jù)集，結(jié)果顯示其中7個數(shù)據(jù)集ADD3的mRNA表達量與正常樣本相比，均顯示出明顯的低表達，且所有差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。ADD3的DNA表達量沒有明顯改變，提示ADD3 mRNA表達降低，可能是轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)異常，而不是DNA拷貝數(shù)減少的影響。其中Basso Lymphoma(Under-expression Gene Rank：24，P-value：9.24E-11，t-Test：-7.839，F(xiàn)old change：-2.975)，Alizadeh Lymphoma(Under-expression Gene Rank：27，P-value：1.01E-4，t-Test：-5.049，F(xiàn)old change：-2.716)，Brune Lymphoma(Under-expression Gene，Rank：2 375，P-value：0.004，t-Test：-3.077，F(xiàn)old change：-1.944)，Rosenwald Lymphoma(Under-expression Gene Rank：331，P-value：0.005，t-Test：-3.500，F(xiàn)old change：-1.491)，Compagno Lymphoma(Under-expression Gene Rank：537，P-value：2.15E-14，t-Test：-9.739，F(xiàn)old change：-2.220)，Rosenwald Multi-Cancer(Under-expression Gene Rank：492，P-value：0.002，t-Test：-3.259，F(xiàn)old change：-2.276)，Storz Lymphoma(Under-expression Gene Rank：1 513，P-value：0.011，t-Test：-2.869，F(xiàn)old change：-3.009)為分析mRNA表達的數(shù)據(jù)集，TCGA Lymphoma(Under-expression Gene Rank：3 809，P-value：0.140，t-Test：-1.117，F(xiàn)old change：-1.025)為分析DNA表達的數(shù)據(jù)集。

2.4ADD3對DLBCL患者的預(yù)后意義 Hummel Lymphoma Dataset(GSE4475數(shù)據(jù)集)使用Human Genome U133A Array基因表達譜芯片，共檢測221例淋巴瘤患者，包括28例非典型伯基特淋巴瘤患者，8例伯基特淋巴瘤患者，1例伯基特白血病患者，18例成熟B細胞非霍奇金淋巴瘤患者和166例DLBCL患者，該數(shù)據(jù)集同時包含了患者的治療經(jīng)歷，基因異位情況，總體生存時間等，其中具有完整生存信息的123例。Lenz Lymphoma Dataset(GSE10846數(shù)據(jù)集)使用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays基因芯片，共檢測414例初治的DLBCL患者，該數(shù)據(jù)集還包含了患者的化療方案，總體生存時間，年齡，性別，疾病分期等數(shù)據(jù)。Shaknovich Lymphoma Dataset(GES23501數(shù)據(jù)集)同樣使用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays基因芯片，共檢測69例DLBCL患者的基因表達狀況，同時記錄患者的年齡，性別，疾病分期，總體生存狀況等。從GEO數(shù)據(jù)庫下載上述3個數(shù)據(jù)集原始數(shù)據(jù)，分析DLBCL患者的生存預(yù)后與ADD3表達量之間的關(guān)系。兩個數(shù)據(jù)集生存分析結(jié)果皆顯示，ADD3低表達組預(yù)后更差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，圖1(A)、(B)。Hummel Lymphoma Dataset中共收集了166例DLBCL患者數(shù)據(jù)，去除缺少生存預(yù)后數(shù)據(jù)的樣本，符合條件的樣本共有123個，ADD3低表達組的中位生存期為12.8個月，高表達組為55.3個月，HR=0.531 3(0.323 1～0.873 6)，P=0.012 7，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Lenz Lymphoma Dataset(n=414)，ADD3低表達組中位生存期為4.13年，高表達組未達，HR=0.5642(0.415 0～0.767 0)，P=0.000 3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖1(C)為Shaknovich Lymphoma Dataset(n=69)數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果，P=0.141 1，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與樣本數(shù)量較少有關(guān)。由于ShaknovichLymphoma Dataset與Lenz Lymphoma Dataset數(shù)據(jù)集均使用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays基因芯片，整合兩個數(shù)據(jù)集進行生存分析，結(jié)果顯示，ADD3低表達組中位生存期為6.08年，高表達組未達，HR=0.579 3(0.431 1～0.778 5)，P=0.000 4，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，圖1(D)。由于Lenz Lymphoma的患者分別使用了CHOP化療方案(n=181)和Rituximad-CHOP化療方案(n=233)，為了區(qū)分不同治療方案所導(dǎo)致的生存差異，因此，將Lenz Lymphoma分為CHOP-treated和Rituximad-CHOP-treated兩個亞組，分別進行生存分析和表達量分析，結(jié)果顯示，在不同亞組間，ADD3的表達量無明顯差異，且ADD3低表達組預(yù)后皆為不良，圖1(E)、(F)、(G)。

圖1 ADD3表達水平與患者預(yù)后關(guān)系

2.5ADD3低表達為DLBCL的預(yù)后不良因素，與年齡、性別等因素?zé)o關(guān) 對Hummel Lymphoma Dataset，Lenz Lymphoma Dataset進行亞組分析(由于Shaknovich Lymphoma Dataset樣本量較少，故不再進行亞組分析)，圖2(A)、(B)，Hummel Lymphoma Dataset數(shù)據(jù)集顯示，DLBCL中ADD3的表達量在性別和年齡亞組無顯著差異。圖2(C)顯示，Lenz Lymphoma Dataset中，在性別亞組，ADD3的表達量無明顯差異。圖2(D)顯示，Lenz Lymphoma Dataset中，在年齡亞組，21～40歲年齡組，ADD3的表達量要高于41～60歲(P=0.006)、61～80歲(P=0.013)、81～100歲(P=0.002)年齡組。由于81～100歲年齡組人數(shù)較少，且41～60歲、61～80歲、81～100歲年齡組中ADD3的表達量無明顯差異，因此，將樣本分為21～40歲年齡組和41～100歲年齡組兩個亞組進行分析，結(jié)果顯示在21～40歲亞組中，ADD3低表達組預(yù)后更差，HR=0.101 8(0.022 83～0.454 2)，P=0.002 7，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，圖2(E)。41～100歲年齡組中，ADD3低表達組中位OS為3.93年，ADD3高表達組的中位OS為7.49年，HR=0.618 5(0.451 4～0.847 4)，P=0.003 1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，圖2(F)。在不同年齡亞組中，ADD3低表達組預(yù)后皆為不良。

圖2 DLBCL的預(yù)后不良因素

2.6ADD3與DLBCL異質(zhì)性生物特征分子呈弱相關(guān)性 比較顯示ADD3與DLBCL異質(zhì)性生物特征分子c-Myc(P=0.014，R=0.36)，Bcl2(P=0.000 55，R=0.49)，P53(P=0.003 1，R=0.42)等呈弱相關(guān)性。

2.7 UALCAN網(wǎng)站驗證ADD3在DLBCL不同亞組的表達 數(shù)據(jù)庫分析網(wǎng)站(UALCAN)，對DLBCL中疾病階段，種族，性別，體質(zhì)量，年齡以及TP53突變等亞組進行逐個分析，結(jié)果顯示DLBCL中ADD3的表達與疾病階段，種族，性別，體質(zhì)量，年齡以及TP53突變等無關(guān)，圖3。

圖3 ADD3在DLBCL不同亞組的表達

3 討論

DLBCL是具有高度侵襲性的非霍奇金淋巴瘤，根據(jù)Globalcancerstatistics 2018的最新統(tǒng)計[2]，非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率占全球癌癥發(fā)病率的2.8%，死亡率占全球癌癥致死率的2.6%，雖然一線R-CHOP化療方案使得DLBCL患者的生存率大大提高，但由于臨床與病理診斷的異質(zhì)性與復(fù)雜性，仍有部分DLBCL患者，存在難治與緩解后復(fù)發(fā)等現(xiàn)象[3]，目前Bcl2，c-Myc，P53突變等遺傳學(xué)異常已被證實與DLBCL的預(yù)后相關(guān)[4-5]，因此，尋找新的預(yù)后生物標志物，對于治療DLBCL具有重要的臨床意義。

Ocomine數(shù)據(jù)庫是目前全球最大的癌癥基因芯片數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫收納整合了全球權(quán)威研究團隊發(fā)表在專業(yè)雜志上的公開數(shù)據(jù)，主要包括腫瘤相關(guān)RNA和DNA等數(shù)據(jù)，是用于挖掘癌癥基因信息的權(quán)威數(shù)據(jù)平臺。癌癥基因圖譜(TCGA)是由美國癌癥基因研究所和美國人類基因組研究所合作啟動的項目計劃，收錄了人類不同癌癥的臨床數(shù)據(jù)，基因組變異數(shù)據(jù)，mRNA表達數(shù)據(jù)，miRNA表達數(shù)據(jù)，甲基化數(shù)據(jù)等，是癌癥研究的重要數(shù)據(jù)來源。目前基于數(shù)據(jù)庫分析，已成功挖掘出肺腺癌的靶基因KRAS[6]，多發(fā)性骨髓瘤的生物靶點CD200[7]，胰腺癌的生物靶點MALAT1[8]等，且均已得到驗證。

ADD3(Adducin 3)屬于Adducins家族，又名adducin γ，位于染色體10q24.2～24.3，是膜蛋白與肌動蛋白連接處的骨架蛋白，參與血紅蛋白中血影蛋白-肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，細胞信號傳導(dǎo)，離子轉(zhuǎn)運，細胞運動與細胞增殖等生命活動[9]。目前關(guān)于ADD3的研究較少，Karrie[10]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)的ADD3在多形膠質(zhì)母細胞瘤中具有致癌作用，并且ADD3喪失功能的多形膠質(zhì)母細胞瘤細胞能夠通過VEGF/VEGFR2信號傳導(dǎo)刺激內(nèi)皮細胞激活，促進體內(nèi)腫瘤生長和血管生成。在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，ADD3的耗竭，加速了非小細胞肺癌細胞的遷移[11]。在膽道閉鎖的研究中顯示，ADD3基因沉默的小鼠與野生型小鼠相比，臟器纖維化程度更高，并通過與NK細胞作用，導(dǎo)致膽道閉鎖的發(fā)生[12]。Fan的研究顯示[13]，通過敲降A(chǔ)DD3的表達，會損害腎傳入小動脈和大腦中動脈的肌源性反應(yīng)，并影響B(tài)K通道活性。高度的侵襲性是DLBCL的主要生物學(xué)特征，常常侵犯淋巴結(jié)組織及周圍器官，使其復(fù)發(fā)率高，預(yù)后效果差，ADD3的耗竭可能是通過減少細胞-細胞之間或細胞-基質(zhì)之間的接觸，解除細胞抑制，促進DLBCL細胞遷移，同時激活血管生長，促進了DLBCL的浸潤轉(zhuǎn)移。

綜上所述，ADD3在DLBCL中低表達，且與預(yù)后呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性，ADD3的功能喪失可能會解除細胞之間的接觸抑制，促進腫瘤的發(fā)生，有望作為DLBCL的獨立預(yù)后標志物，為治療和預(yù)防DLBCL提供參考靶點。