外周血LTA4H基因多態(tài)性rs7971150位點(diǎn)檢測在老年慢性阻塞性肺疾病患者中的臨床意義

程煒煒，魯曉怡，周曉莉，劉明，張青，夏娟，趙云峰

1.上海楊思醫(yī)院呼吸科，上海200126 2.上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院呼吸科，上海200125

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是呼吸內(nèi)科常見病，是一種多種炎癥細(xì)胞浸潤的呼吸道慢性炎癥性疾病[1]，多見于中老年人，中國40 歲以上人群患病率為13.7%[2]。白三烯是白細(xì)胞活化物質(zhì)，白三烯A4 水解酶（leukotriene A4 hydrolase,LTA4H）是肺部發(fā)生慢性炎癥的一個關(guān)鍵酶，能夠催化產(chǎn)生白三烯B4（leukotriene B4，LTB4），而LTB4 通過與靶細(xì)胞膜上的G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合引起氣道炎癥[3-4]。近年來，LTA4H 作為白三烯產(chǎn)成過程中一種重要的限速酶，在有些呼吸系統(tǒng)疾病中對其基因多態(tài)性進(jìn)行了相關(guān)的研究[5-6]。LTA4H 上游啟動子的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs7971150 影響LTA4H mRNA 在體內(nèi)的表達(dá)[4]，而香煙煙霧可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞LTA4H 的表達(dá)[7]。本研究旨在探討LTA4H基因多態(tài)性rs7971150 檢測在老年慢性阻塞性肺疾病患者中的臨床意義,以及其與吸煙的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年9月—2020年1月在上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院呼吸科病房和上海楊思醫(yī)院呼吸科病房住院的COPD 急性加重（觀察組）患者150 例和非COPD 患者150 例（對照組）。AECOPD 患者均符合2017年GOLD 指南制定的AECOPD 標(biāo)準(zhǔn)，納入標(biāo)準(zhǔn)：COPD 患者主訴癥狀突然變化超過日常變異范圍[8]，具體表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、呼吸困難比平時加重，或痰量增多、或咳黃痰，需要改變用藥方案；排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重腎功能、肝功能、心功能不全，血液惡性腫瘤及其他系統(tǒng)腫瘤患者；（2）肺間質(zhì)性疾病、炎癥性疾??；（3）支氣管哮喘或支氣管擴(kuò)張癥，遺傳性疾病史；（4）心肌梗死史、心胸及腹部外科大手術(shù)史、腦卒中等；（5）傳染性疾病恢復(fù)期；（6）孕婦或預(yù)計(jì)生育的女性；（7）研究者認(rèn)為不宜納入本項(xiàng)研究的特殊人群。具備上述任1 項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的病例不納入本研究。

觀察組中男性104 例，女性46 例，年齡在61～75歲(中位62.5 歲)。對照組中男性96 例，女性54 例，年齡在60～77 歲(中位64.8 歲)，包括支氣管擴(kuò)張急性加重患者80 例、社區(qū)獲得性肺炎患者70 例，支氣管擴(kuò)張急性加重及肺炎標(biāo)準(zhǔn)均符合支氣管擴(kuò)張及肺炎的有關(guān)專家共識及指南[9-10]。根據(jù)患者是否吸煙，觀察組患者及對照組患者各自分為吸煙組（吸煙煙齡在10年以上，平均每天20 支）及不吸煙組兩個亞組。觀察組患者吸煙組110 例，不吸煙組40 例；支氣管擴(kuò)張吸煙組43 例，不吸煙組37 例；肺炎吸煙組40例，不吸煙組30 例。性別、年齡以及是否吸煙在觀察組與對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。入組所有研究對象均簽署知情同意書，本研究已通過上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（編號為20170704）。

采用imLDR 多重連接酶SNP 分型檢測技術(shù)[11]，檢測所有入選患者外周血TA4Hrs7971150 基因多態(tài)性，并測定每位患者動脈血?dú)猓╬H 值、PaO2、PaCO2）、肺功能FEV1、FEV1%以及6 分鐘步行距離。

1.2 研究方法

1.2.1 基因位點(diǎn)測定 清晨采集患者空腹外周靜脈血4 mL于EDTA抗凝管中，用試劑盒抽提DNA，置于-20℃冰箱里保存。采用上海天昊生物科技有限公司遺傳分析中心的imLDRTM 多重SNP 分型試劑盒對樣本進(jìn)行SNP 位點(diǎn)分型[12]。

rs7971150 位點(diǎn)的上游引物序列為5'-GACTCCTGGTCTCAGTTGGGTGA-3'；下游引物序列為 5'-TCCCTTGGATTGTATGCCAAAAA-3'；連接引物序列分 別 為 rs7971150RG: 5'TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTTGAAGGATTTTAAGCAGGGGAGTGACAC-3'；rs7971150RA: 5'-TGTTCGTGGGCCGGATTAGTTGAAGGATTTTAAGCAGGGGAGTGACAT-3'；rs7971150RP: 5'-GATTACATTAGAAAGAATGCTCTAGCAGATAACA-3'。

1.2.2 動脈血?dú)鉁y定 采用美國Nova Stat Profile M 型血?dú)馍治鰞x(電極法) 測定患者動脈血?dú)狻?/p>

1.2.3 肺功能測定 應(yīng)用意大利生產(chǎn)的COSMED 肺功能儀測定肺功能，記錄患者FEV1、FEV1%等結(jié)果。

1.2.4 6 分鐘步行距離的測定 在病房內(nèi)用米尺事先測定30 米距離，標(biāo)明起始點(diǎn)位置，每5 米標(biāo)注數(shù)字，記錄患者6 分鐘所行走的距離。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以Hardy-Weinberg 平衡定律評估樣本的群體代表性（值>0.05 有意義）。應(yīng)用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因頻率（%），基因型頻率、等位基因頻率的對比采用檢驗(yàn)。用logistic 回歸方法計(jì)算優(yōu)勢比（odds ratio，OR）及其95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）。<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 本研究共納入AECOPD 患者150 例，非COPD 患者150 例（包括支氣管擴(kuò)張急性加重患者80例、社區(qū)獲得性肺炎患者70 例）。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，rs7971150 位點(diǎn)的基因型在2 組間分布符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群體代表性（P 值為0.696，>0.05 有意義）。本研究rs7971150 位點(diǎn)的基因型分為野生型（AA）、變異雜合子（GA）、變異純合子（GG）。

2.2 2 組rs7971150 位點(diǎn)基因型頻率分析2 組rs7971150位點(diǎn)基因型頻率分布的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05);與AA 基因型相比較，GG 基因型顯著增加了患病風(fēng)險（OR=2.52，=0.0076）。見表1。

表1 2 組rs7971150 位點(diǎn)基因型頻率分析

2.3 2 組rs7971150 位點(diǎn)基因型的亞組分析 在吸煙亞組和不吸煙亞組中，rs7971150 位點(diǎn)基因型頻率在觀察組與對照組之間分布的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，且在吸煙亞組中，與AA 基因型相比較，GA、GG 基因型都顯著增加了患病風(fēng)險（OR=2.16,=0.027；OR=3.21，=0.009）。見表2。

表2 2 組rs7971150 位點(diǎn)基因型的亞組分析

2.4 2 組有關(guān)指標(biāo)的比較 如表3所示，與對照組不吸煙患者pH 值、PaO2、PaCO2、FEV1、FEV1%、6 分鐘步行距離等有關(guān)數(shù)據(jù)相比，對照組吸煙患者上述指標(biāo)之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均>0.05）。

表3 2 組有關(guān)指標(biāo)的比較

與觀察組不吸煙患者pH 值、PaO2、PaCO2、FEV1、FEV1%、6 分鐘步行距離等有關(guān)數(shù)據(jù)相比，觀察組吸煙患者pH 值、PaO2、PaCO2之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均>0.05)，而觀察組吸煙患者FEV1、FEV1%、6 分鐘步行距離之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均<0.05)。

與對照組（不吸煙、吸煙）患者相比，觀察組患者pH 值、PaO2之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均>0.05)；而PaCO2、FEV1、FEV1%、6 分鐘步行距離之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均<0.05)。

3 討論

測定基因多態(tài)性在闡明人體對疾病的易感性與耐受性、疾病表現(xiàn)的多樣性起著非常重要的作用。研究提示COPD 人群易感性與基因多態(tài)性之間存在某種聯(lián)系[4]。白三烯刺激白細(xì)胞趨化、聚集、釋放氧自由基及溶酶體酶，可增加血管壁通透性，刺激支氣管平滑肌細(xì)胞分泌粘液，從而引起支氣管平滑肌收縮，與COPD 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[3]。在COPD 發(fā)病和疾病進(jìn)展中，LTA4H 存在高表達(dá)。香煙煙霧可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞LTA4H 的表達(dá)[7]，因此LTA4H 基因多態(tài)性與香煙煙霧暴露之間存在基因與環(huán)境之間的相互作用。長期香煙煙霧刺激不僅引起氣道的慢性炎癥，還能導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞增生與凋亡失衡[13]。

本研究顯示：在觀察組與對照組之間，rs7971150位點(diǎn)基因型頻率分布的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與AA 基因型相比較，GG 基因型顯著增加了患病風(fēng)險。在吸煙亞組和不吸煙亞組中，rs7971150 位點(diǎn)基因型頻率在觀察組與對照組之間分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在吸煙亞組中，與AA 基因型相比較，GA、GG 基因型顯著增加了患病風(fēng)險。與觀察組不吸煙患者相比，觀察組吸煙患者pH 值、PaO2、PaCO2之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而FEV1、FEV1%、6 分鐘步行距離之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組（不吸煙、吸煙）患者相比，觀察組患者pH 值、PaO2之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而PaCO2、FEV1、FEV1%、6 分鐘步行距離之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上研究結(jié)果說明：通過LTA4H 基因多態(tài)性rs7971150 位點(diǎn)測定，GA 基因型、GG 基因型顯著增加了COPD 患病風(fēng)險，GA基因型、GG 基因型突變與COPD 患者發(fā)病有關(guān)。吸煙的COPD 患者存在明顯的GA、GG 突變基因型，吸煙是導(dǎo)致吸煙者發(fā)生COPD 的重要原因，與不吸煙的COPD 患者相比，吸煙的COPD 患者存在更差的肺功能、更短的6 分鐘步行距離。

綜上所述，通過LTA4H 基因多態(tài)性rs7971150 位點(diǎn)測定，GA 基因型、GG 基因型顯著增加了COPD患病風(fēng)險。吸煙的COPD 患者存在明顯的GA、GG突變基因型，以及較差的肺功能、較短的6 分鐘步行距離。本研究不足之處是小樣本、單中心研究，以后要進(jìn)行大樣本、多中心的臨床研究，為以后在臨床上從基因?qū)用鏈y定患者外周血rs7971150 位點(diǎn)基因多態(tài)性，配合肺功能早期篩查、早期確診COPD 提供科學(xué)依據(jù)。