老年細菌性肺炎纖維支氣管鏡吸痰樣本的菌群分布特征

胡江，穆匯，周奇興，鄒盈，陳茹艷，趙虎

1.上海普陀區(qū)利群醫(yī)院檢驗科，上海200333；2.上海普陀區(qū)利群醫(yī)院呼吸科，上海200333；3.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗科，上海200040

肺部感染在各類感染疾病中的比例較高，尤其以老年患者更容易發(fā)生呼吸道感染。據(jù)推測，下呼吸道感染與呼吸道菌群變化之間可能存在密切關(guān)系。以往人們認為健康人肺部是無菌的，并且對呼吸道菌群的研究也主要是依賴傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)技術(shù)。在過去的十多年間，高通量DNA 測序技術(shù)經(jīng)過不斷完善，已經(jīng)發(fā)展成為一個高效而精準的強有力的工具，大大促進了基礎(chǔ)和臨床各方面研究的突飛猛進。近年來，將該技術(shù)應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)的微生物學(xué)研究之后，發(fā)現(xiàn)健康人肺部存在復(fù)雜的微生物群。但是，采用該技術(shù)深入研究疾病狀態(tài)下呼吸道菌群的變化，目前國內(nèi)外尚未見有報道。

本研究比較了高通量DNA 測序技術(shù)與傳統(tǒng)的痰涂片和培養(yǎng)方法，檢測老年肺炎患者痰樣本中的菌群分布，發(fā)現(xiàn)這些患者的下呼吸道都具有豐富的細菌種類；并且16s rDNA 高通量測序方法相較傳統(tǒng)的檢測技術(shù)更為快速、精準、靈敏度高。本研究發(fā)現(xiàn)有可能為開發(fā)臨床老年人肺炎患者的檢測方法提供新的思路。

1 對象和方法

1.1 一般資料 隨機選取2018年7月-2019年12月上海普陀區(qū)利群醫(yī)院院就診的38 例未經(jīng)治的老年肺炎患者?；颊呒{入標準：年齡≥65 歲，診斷為細菌性肺炎的患者，男女性別不限?；颊吲懦龢藴剩禾蒂|(zhì)量不合格者和非感染原因如肺栓塞等所致的下呼吸道胸片的改變。細菌性肺炎感染診斷標準參照《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南（2016年版）》[1]。

1.2 檢測方法

1.2.1 痰液樣本的采集 在患者用藥前，使用纖維支氣管鏡置入患者支氣管中吸取其中的分泌物。將收集到的患者的吸痰分成2 份分別置于無菌容器內(nèi)。其中一份于2 h 內(nèi)涂片行革蘭染色，顯微鏡下計數(shù)鱗狀上皮細胞和白細胞數(shù)量及其比值，痰質(zhì)量檢測合格后觀察菌體形態(tài)特征，進行初步鑒定，照相記錄。另外一份密封后于-80℃保存，后續(xù)送合作公司進行測序并分析。

1.2.2 MiSeq 測序 將-80℃低溫保存的38 例份纖維支氣管鏡吸痰樣本統(tǒng)一送公司進行測序?；蚪MDNA抽提完成后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提質(zhì)量、PCR 擴增、熒光定量、Miseq 文庫構(gòu)建及測序，最后進行生物信息學(xué)分析。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 經(jīng)Miseq測序得到的PE reads，首先根據(jù)overlap 關(guān)系進行拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進行OTU 聚類分析和物種分類學(xué)分析?；贠TU 聚類分析結(jié)果，可以對OTU進行多種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度的檢測；基于分類學(xué)信息，可以在多個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 OTU， 多樣性及稀釋曲線分析 對高通量測序所得序列進行聚類，為了得到每個OTU 對應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序列進行分類學(xué)分析。本實驗中，16 s 細菌的比對數(shù)據(jù)庫為Silva，38 個樣本的總有效測序數(shù)目為4385 637 條，總有效堿基數(shù)目為1 839 833 969 bp，每條序列的平均長度為422 bp?？偒@得15 805 個OTU、3 690 種細菌。樣本稀釋曲線最終趨于平緩，且測序深度均值為0.99，說明此次測序數(shù)量大，測序深度廣，可以較全面地分析呼吸道菌群信息。 多樣性可以反應(yīng)微生物群落的豐富度（Chao 指數(shù)）、均勻度（Simpson 指數(shù)）、多樣性（Shannon 指數(shù)）、和覆蓋度（Coverage 指數(shù)）。本實驗Chao 指數(shù)標準差較大，Simpsoneven 指數(shù)和Shannon 指數(shù)的標準差較小，標本的菌群豐富度比較大，樣本之間存在個體差異。

2.2 群落組成分析 老年下呼吸道感染人群中含有豐富的細菌種類。本項研究對38 例老年肺炎患者，平均年齡（72.5±7.3 歲）的支氣管鏡吸痰樣本進行測序，共獲得50 個門和1 562 個屬的細菌。在門分類水平上，38 個樣本中豐度從高到低依次為變形桿菌門（Proteobacteria），厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、髕骨細菌門（Patescibact eria）、藍藻門（Cyanobacteria）和梭桿菌門(Fusobacteria)等；在屬水平上，豐度從高到低依次為假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）、普雷沃菌屬（Prevotella）、韋榮氏球菌屬（Veillonella）、霉?jié){菌屬（Mycoplasma）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和棒桿菌屬（Corynebacterium）等。本研究結(jié)果表明：下呼吸道患者可能都具有豐富的細菌種類，并且以變形桿菌門的一系列未知分類單元的菌屬占據(jù)優(yōu)勢。

2.3 痰培養(yǎng)分析 將另外38 個配對的痰標本進行涂片鏡檢，按照標準程序[2]分別接種到血平板、巧克力平板和麥康凱平板上，置35℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育18～24 h 后，觀察菌落形態(tài)；進一步將培養(yǎng)陽性的樣本在梅里埃Vitek 2 Compact 全自動細菌分析儀進行細菌鑒定及藥敏實驗。本實驗的38 個樣本，平均每低倍視野鱗狀上皮細胞數(shù)<10 個，平均每低倍視野白細胞數(shù)>25 個，表明均為合格痰標本。其中有23 株分離出咽部正常菌群，陽性率為39.5%。具體革蘭染色和痰培養(yǎng)結(jié)果見表1。

2.4 痰培養(yǎng)與16s rDNA 高通量測序結(jié)果 比較分析比較傳統(tǒng)痰培養(yǎng)結(jié)果和16s rDNA 高通量測序結(jié)果，如表1，如果高通量測序所占豐度最大的菌種與痰培養(yǎng)結(jié)果相同，本研究視兩者具有一致性；由于與本次測序尚未考慮真菌、病毒等致病微生物，如果高通量測序所占豐度最大或較大的菌種為非致病菌，本研究視高通量測序結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果“分離出咽部正常菌群”和“曲霉菌某種屬生長”具有一致性。由此，高通量測序結(jié)果與傳統(tǒng)痰培養(yǎng)結(jié)果的一致性為50%。

表1 樣本的革蘭染色、痰培養(yǎng)和16srDNA 測序結(jié)果

3 討論

肺部感染在各類感染疾病中的比例較高，有研究顯示醫(yī)院下呼吸道感染患者占26.75%，尤其以老年患者更容易發(fā)生呼吸道感染[3]。臨床上常根據(jù)患者的臨床癥狀、影像學(xué)檢查（胸片或CT）和實驗室指標進行診斷；采用經(jīng)驗性抗生素治療，同時送檢痰培養(yǎng)查找病原體，再依據(jù)痰培養(yǎng)病原體檢查結(jié)果及體外藥敏結(jié)果調(diào)整使用有效抗生素。目前，痰標本革蘭染色涂片鏡檢仍然是呼吸道感染性疾病診斷的最經(jīng)濟、有效的方式，可以在半小時內(nèi)出結(jié)果。合格痰標本的涂片結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果的符合率為72.78%[4]，痰涂片鏡檢質(zhì)量直接反應(yīng)痰培養(yǎng)檢出致病菌的可能性[5]。痰液中培養(yǎng)出的病原菌種類及藥敏試驗結(jié)果對疾病的診斷和指導(dǎo)用藥有著重要的意義[6]。但是，痰涂片和痰培養(yǎng)這兩種方法僅能檢測部分可染色、可體外培養(yǎng)的優(yōu)勢細菌，對痕量的、難以染色和培養(yǎng)的微生物卻束手無策，且檢測靈敏度較低，呼吸道感染患者痰及咽部菌群的真實種類和占比未有明確參照[7]。這個特點反映在臨床工作中就是：即使當(dāng)患者有明顯的感染癥狀和體征時，痰培養(yǎng)的結(jié)果卻常為陰性。如本次研究中，標本“PXL-XT”和“WJ-XT”高通量測序在種水平上所占豐度最大的為銅綠假單胞菌，但是傳統(tǒng)培養(yǎng)并沒有檢出致病菌。因而，許多臨床醫(yī)師認為，痰培養(yǎng)結(jié)果對臨床診治的參考價值不大，一般還是經(jīng)驗性的選用抗菌藥物。盡管現(xiàn)已有大量人體定植菌種可經(jīng)培養(yǎng)技術(shù)得到，但據(jù)估計超過70%的人體表菌種尚未獲得成功培養(yǎng)[8]。本項研究對38 例臨床診斷為肺炎的患者進行傳統(tǒng)培養(yǎng)，其中有15 例培養(yǎng)為陽性，陽性率與之前報道的較一致[9]。這表明傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢出陽性率較低；并且與高通量測序技術(shù)相比，它不能分析微生物群落整體。如表1，韋榮氏球菌屬是厭氧性微小球菌，需厭氧培養(yǎng)；結(jié)核分支桿菌專性需氧，常用羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)2～4 周可見菌落生長；霉?jié){菌又稱支原體，無細胞壁，人工培養(yǎng)營養(yǎng)要求較高。所以這些標本的兩種培養(yǎng)結(jié)果具有一致性。但是奴卡菌繁殖速度慢，一般樣本5～7 d 可見菌落，樣本“YMZ-XT”傳統(tǒng)培養(yǎng)并沒有檢出，屬于漏檢。綜上，38 個樣本結(jié)果一致性僅為68.4%，傳統(tǒng)培養(yǎng)與高通量測序結(jié)果相差較大，鑒于此，傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)可能不再是臨床檢測病原微生物的金標準方法[10]。

微生物多樣性測序，是利用新一代高通量測序技術(shù)（NGS）對樣品中微生物的16S rDNA（或18S rDNA、Internal Transcribed Spacer、功能基因等）高變區(qū)序列進行大規(guī)模、高通量測序，分析特定樣品中微生物群體的構(gòu)成情況或基因的組成以及功能。借助不同樣品中或不同環(huán)境下微生物群落的構(gòu)成差異分析，本研究不僅可以揭示微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)組成，還可以分析微生物與環(huán)境因素或宿主之間的關(guān)聯(lián)，尋找標志性菌群或特定功能的基因，為疾病的診療和微生物資源的開發(fā)提供基礎(chǔ)。本研究NGS 測序得到15 805 個OTU，3 690 個菌種，50 個菌門，測序快速，結(jié)果精準，靈敏度高，檢出率高，檢出范圍廣，檢測菌種大大增多，信息量更加豐富。但是該方法檢測費用相對較高，一般實驗室尚未被普及，尚不能完全取代傳統(tǒng)的痰涂片和痰培養(yǎng)技術(shù)。本研究38 個病例中有5 例治療無效死亡，其中病例“XXD-XT”傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果與高通量測序結(jié)果完全不一致，原因有待挖掘。拋開復(fù)雜的臨床因素，單從技術(shù)層面，本研究認為痰培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)該被新技術(shù)取代。

本研究是在纖維支氣管鏡下直接獲取痰標本。纖維支氣管鏡是指將內(nèi)窺鏡導(dǎo)入氣管及支氣管內(nèi)，可以直接到達病灶位置，具有直視下逐級吸盡氣道內(nèi)的分泌物，沖洗痰痂，有效提高血氧飽和度，改善組織缺氧[11]，損傷小等優(yōu)點，作為預(yù)防肺部感染及痰液藥敏試驗不可或缺的手段[12]。這里需要說明的是，本研究選取上海本地西北部具有代表性的老年肺炎患者的吸痰進行了高通量測序，分析的樣本總量較少，尚未考慮更加復(fù)雜細致的臨床情形，例如：患者的不同性別、是否具有吸煙史等等。下一步將增加樣本量，同時與未發(fā)生下呼吸道感染的人群作比較，進一步探尋老年下呼吸道菌譜特征，深入探討這些菌種分布和構(gòu)成情況與下呼吸道感染發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)等。另外，本研究中尚未考察肺炎患者的真菌和病毒等致病微生物。弄清這些病原體在疾病狀態(tài)下的種類、分布和組成結(jié)構(gòu)，甚至與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)、在疾病診治中的價值等，將是十分有意義的。這也將是未來研究的努力方向。

綜上，本研究通過比較痰涂片和培養(yǎng)與高通量測序的檢測方法，展示了這兩種方法的檢測特點，說明了高通量測序法的優(yōu)越性，指出了老年患者肺炎病例檢測方法的發(fā)展趨勢,有可能為將來進一步開發(fā)檢測老年肺炎的新方法提供思路；同時，發(fā)現(xiàn)老年肺炎患者的纖維支氣管鏡吸痰樣本中存在豐富的細菌種類，從而加深了人們對疾病狀態(tài)下呼吸道菌群的認識。