UCP3 基因調(diào)控C2C12 細胞增殖的研究

何志強，黑偉，張萬鋒，張燕偉，吳怡琦，蔡春波，楊陽，高鵬飛，李步高，郭曉紅

（山西農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，山西 太谷030801）

骨骼肌是哺乳動物機體的重要組成部分，與哺乳動物的運動能力、代謝能力具有密切的聯(lián)系［1］。骨骼肌細胞生長發(fā)育是一個復雜的生理過程，主要包括骨骼肌干細胞增殖、遷移和分化，成肌細胞的增殖、分化和肌管融合等環(huán)節(jié)［2］。其中，骨骼肌成肌細胞的增殖是維持骨骼肌功能的基礎。當骨骼肌受到損傷時，機體可以通過成肌細胞的增殖和分化進行損傷修復，維持骨骼肌的功能。骨骼肌急性損傷后，可以激活骨骼肌中的MAPK/MEK 信號通路，誘導骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖，并促進成肌分化，完成骨骼肌的損傷修復［3］。電刺激可以促進肌萎縮大鼠的骨骼肌中胰島素樣生長因子1（IGF-1）表達，抑制Myostatin基因表達，促進骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖，緩解骨骼肌的萎縮程度［4］。C2C12 細胞是小鼠骨骼肌的成肌細胞系，具有很強的增殖和成肌分化能力，是研究骨骼肌發(fā)育的模式細胞系。

解偶聯(lián)蛋白3（Uncoupling protein 3，UCP3）主要在骨骼肌和棕色脂肪（BAT）中表達，是一種位于線粒體內(nèi)膜上的載體蛋白［5］。UCP3 可以通過質(zhì)子漏的方式，消散線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子電化學梯度差，解偶聯(lián)線粒體的氧化與磷酸化過程，使能量以熱能的方式消耗。目前，關于UCP3 的研究主要集中在脂質(zhì)氧化代謝與產(chǎn)熱調(diào)節(jié)等方面，寒冷條件刺激下，豬可以通過上調(diào)UCP3 基因的表達，促進皮下白色脂肪棕色化，增加脂肪產(chǎn)熱，維持體溫平衡［6］。UCP3 還可以增強脂質(zhì)的氧化代謝作用［7～9］，減少線粒體中活性氧（reactive oxygen specices，ROS）的產(chǎn)生［10］，使線粒體免受氧化應激造成的損傷［11］。Lin 等［12］發(fā)現(xiàn)，90 日齡的莆田黑豬骨骼肌中UCP3 的表達量顯著高于其它日齡（P＜0.01）。目前，關于UCP3 對骨骼肌的調(diào)控作用的報道較少，功能仍不清楚。本研究以C2C12細胞為研究對象，在有效轉(zhuǎn)染UCP3 過表達與干擾慢病毒載體的基礎上，收集不同處理組細胞的RNA 及蛋白，利用qRT-PCR 技術(shù)檢測增殖相關基因PCNA、Ki67 與凋亡相關基因Bax、caspase3 mRNA 表達量的變化，運用Western Blot 技術(shù)檢測PCNA 蛋白表達量的變化；通 過CCK-8、EDU 染色探究過表達與干擾UCP3 基因?qū)2C12 細胞增殖速率的影響，闡明UCP3 基因?qū)2C12 成肌細胞增殖的調(diào)控作用，為骨骼肌中UCP3 的功能研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

C2C12 細胞購自上海蓋寧生物有限公司；胎牛血清（FBS）、高糖DMEM、0.25%胰酶購自Gibco 公司；青鏈霉素混合液、PBS 緩沖液、4%多聚甲醛、Triton X-100、DAPI 染 液 購 自Solaibio 公 司；SDS-PAGE 快速凝膠制備試劑盒、彩虹預染蛋白marker 購自武漢博士得生物工程有限公司；TRNzol Universal RNA Reagent、總RNA 提 取 試 劑 盒購自北京天根生化科技有限公司；Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 和SYBR Premix Ex Taq II 購 自TaKaRa 公 司；CCK-8 試 劑盒、PCNA 單 克隆抗體 購 自Abcam 公 司；β-actin 單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；熒光二抗購自美國LI-COR 公司；EDU 增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；qRT-PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成；慢病毒載體由上海吉瑪公司構(gòu)建并包裝。

1.1.2 主要儀器

多功能酶標（BioTekSynergy-2，美國）；核酸蛋白測定儀（ND-1 000 Nanodrop，美國）；倒置熒光顯微鏡（DMi8 Leica，德國）；CO2細胞培養(yǎng)箱（STE-CYCLE Thermo，美國）；實時熒光定量PCR 儀（ABI 7 500，美國）；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（PowePac BIO-RAD，美國）；遠紅外光掃描系統(tǒng)（Odyssey CLX LI-COR，美國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 C2C12 細胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出C2C12 細胞，37 ℃水浴鍋快速融化，離心棄上清后用完全培養(yǎng)基（10%FBS+1%青鏈霉素+高糖DMEM）重懸細胞，接種于培養(yǎng)皿中。待細胞匯合度達到80%～90%時，進行傳代，每2 d 更換細胞培養(yǎng)液一次。

1.2.2 C2C12 細胞轉(zhuǎn)染及效率檢測

取生長狀態(tài)良好的C2C12 細胞接種到6 孔板中，待細胞匯合度達到50%左右時加入適量慢病毒載體進行轉(zhuǎn)染。本試驗分為4 個組，分別為：慢病毒包被過表達對照載體組（OE-NC）、慢病毒包被UCP3 過表達載體組（OE-UCP3）、慢病毒包被干擾對照載體組（Sh-NC）和慢病毒包被UCP3 干擾載體組（Sh-UCP3），每組設置3 個重復。轉(zhuǎn)染72 h 后收集各組細胞，提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，運用qRT-PCR 方法檢測各組細胞UCP3基因轉(zhuǎn)染效率。qRT-PCR 引物序列如表1 所示。

1.2.3 EDU 檢測細胞增殖

將成功轉(zhuǎn)染不同慢病毒載體的細胞每孔5 000個細胞的密度接種于24 孔板中，每組3 個重復。細胞培養(yǎng)12 h 后，更換為50 μmol·L-1的EDU 培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h；倒掉EDU 培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定30 min，然后加入200 μL 2 mg·mL-1甘氨酸，室溫搖床孵育5 min，PBS 清洗3 次，每次5 min；加入300 μL 0.5% Triton X-100，室溫孵育30 min；加入200 μL Apollo 染色液，室溫避光孵育30 min；加入0.5% Triton X-100 清洗3 次，每次10 min；加入DAPI 染色液，進行細胞核染色。熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，并使用ImageJ 軟件統(tǒng)計EDU 陽性細胞數(shù)。

1.2.4 CCK-8 檢測細胞增殖

將不同處理組的細胞接種到5 個96 孔板中，每個處理組設置3 個孔重復，每孔大約1 000 個細胞。分別在0 h、12 h、24 h、36 h 和48 h 時加入10 μL CCK-8 溶液，混勻，37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標儀檢測450 nm 處的OD 值，并繪制細胞增殖曲線。

1.2.5 細胞總RNA 提取和cDNA 合成

將不同處理組的細胞接種于12 孔板中，每個處理組設置3 個孔重復，待細胞匯合度達到90%左右時，收集細胞并提取總RNA，然后利用TaKa-Ra 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序按照試劑盒說明書進行，合成的cDNA 放入?20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 qRT-PCR

將合成的cDNA 原液稀釋10 倍用于qRTPCR 檢測。qRT-PCR 反應的總體積為20 μL：上下游引物各0.35 μL，cDNA2 μL，2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，RNAase Free ddH2O 補齊至20 μL。反應程序依照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ說明書進行：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45 個循環(huán)；95 ℃15 s，65 ℃30 s，95 ℃30 s 制作熔解曲線。內(nèi)參基因為18S rRNA。qRT-PCR 反應的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.2.7 Western Blot

收集不同處理組細胞，充分裂解后提取總蛋白，使用核酸蛋白測定儀測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，100 ℃變性10 min，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，程序為：80 V 30 min；100 V 80 min。進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜程序為：100 V 90 min；轉(zhuǎn)膜后放入5%脫脂奶粉中，室溫搖床封閉1 h；分別加入β-actin 抗體（1∶2 000）和PCNA 抗體（1∶1 000），4 ℃過夜；加入二抗（1∶20 000），室溫孵育1 h；洗膜后利用遠紅外光掃描系統(tǒng)觀察試驗結(jié)果并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 22 軟件進行統(tǒng)計學分析，采用獨立樣本t檢驗進行差異顯著性檢驗，運用GraphPad Prism 5 軟件繪制柱狀圖。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 UCP3 過表達與干擾轉(zhuǎn)染效率檢測

通過慢病毒轉(zhuǎn)染UCP3 過表達與干擾載體到C2C12 細胞中，培養(yǎng)72 h 后采用qRT-PCR 技術(shù)檢測UCP3 基因表達量的變化，結(jié)果顯示，過表達與干擾UCP3 組較對照組均有極顯著差異（P＜0.01）（圖1A 和1B）。轉(zhuǎn)染后細胞可用于后續(xù)試驗。

2.2 過表達UCP3 抑制C2C12 細胞的增殖

通過慢病毒轉(zhuǎn)染UCP3 過表達載體到C2C12細胞中，通過EDU 染色和CCK-8 試驗檢測細胞的增殖效果。EDU 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與OE-NC 組相比，OE-UCP3 組中EDU 陽性細胞的數(shù)量明顯減少（圖2A 和圖2B）。CCK-8 試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞培 養(yǎng)12 h 和24 h 時，OE-NC 和OE-UCP3 組 的 細胞數(shù)目并沒有明顯的差異；當細胞培養(yǎng)36 h 和48 h時，OE-UCP3 組的細胞數(shù)目明顯低于OE-NC 組（圖2C）。EDU 染色和CCK-8 試驗結(jié)果說明，過表達UCP3 可以顯著抑制C2C12 細胞的增殖。

2.3 過表達UCP3 對細胞增殖及凋亡相關基因表達量的影響

圖1 UCP3 過表達與干擾效率檢測Fig.1 The relative expression of UCP3 gene in different groups

圖2 OE-UCP3 和OE-NC 組C2C12 細胞的增殖速率Fig.2 Proliferation rate of C2C12 cells in OE-UCP3 and OE-NC groups

通過慢病毒轉(zhuǎn)染UCP3 過表達載體到C2C12細胞中，細胞培養(yǎng)36 h 后通過qRT-PCR 檢測增殖和凋亡基因的表達量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與OE-NC組相比，OE-UCP3 組細胞的增殖基因PCNA和Ki67 的表達量極顯著降低，而凋亡基因caspase3 和Bax的表達量極顯著升高（P＜0.01）（圖3A）。Western Blot 的 試 驗 結(jié) 果 也 發(fā) 現(xiàn)，OE-UCP3 組 細胞中PCNA 蛋白的含量也極顯著低于OE-NC 組（P＜0.01）（圖3B 和3C）。qRT-PCR 和Western Blot 的試驗結(jié)果說明，過表達UCP3 可以抑制增殖基因PCNA和Ki67 的表達，促進凋亡基因cas-pase3 和Bax的表達，從而抑制細胞增殖。

圖3 OE-UCP3 和OE-NC 組細胞中增殖和凋亡基因的表達量Fig.3 The expression of proliferation and apoptosis genes in OE-UCP3 and OE-NC groups

2.4 干擾UCP3 促進C2C12 細胞增殖

通過慢病毒轉(zhuǎn)染UCP3 干擾載體到C2C12 細胞中，然后分別通過EDU 染色和CCK-8 試驗檢測細胞的增殖效果。EDU 染色試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sh-NC 組 相 比，Sh-UCP3 組 中EDU 陽 性 細 胞 的數(shù)量明顯增多（圖4A 和4B）。CCK-8 試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細 胞 培 養(yǎng)12 h 時，Sh-NC 和Sh-UCP3 組的細胞數(shù)目并沒有明顯的差異；當細胞培養(yǎng)24 h、36 h和48 h 時，Sh-UCP3 組的細胞數(shù)目明顯高于Sh-NC 組（圖4C）。EDU 染色和CCK-8 試驗結(jié)果均說明干擾UCP3 可以顯著促進C2C12 細胞增殖。

2.5 干擾UCP3 對細胞增殖及凋亡相關基因表達量的影響

通過慢病毒轉(zhuǎn)染UCP3 干擾載體到C2C12 細胞中，細胞培養(yǎng)36 h 后通過qRT-PCR 試驗檢測增殖和凋亡基因的表達量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sh-NC 組相比，Sh-UCP3 組細胞的增殖基因PCNA和Ki67 的表達量極顯著升高（P＜0.01），而凋亡基因caspase3 和Bax的表達量顯著降低（P＜0.05）（圖5A）。Western Blot 的試驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，Sh-UCP3 組細胞中PCNA 蛋白的含量也顯著高于Sh-NC 組（P＜0.05）（圖5B 和圖5C）。qRT-PCR和Western Blot 的試驗結(jié)果說明，干擾UCP3 可以促進增殖基因PCNA和Ki67 的表達，抑制凋亡基因caspase3 和Bax的表達，從而促進細胞增殖。

3 討論

解偶聯(lián)蛋白（UCP）家族包含5 個成員，分別是UCP1、UCP2、UCP3、UCP4 和UCP5。UCP 家族成員調(diào)控細胞增殖的研究報道較少，而且在不同細胞中的結(jié)果并不一致。Elorza 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，UCP2 可以降低小鼠紅細胞線粒體中ROS 的含量，進而激活MAPK/ERK 信號通路，促進紅細胞的增殖。Pauline 等［14］研 究發(fā)現(xiàn)，UCP2 可以通過降低己糖激酶2（HK2）的活性，抑制小鼠黑色素瘤細胞（B16F10）的糖酵解水平，抑制細胞的增殖。劉穎［15］等研究發(fā)現(xiàn)，干擾UCP2 基因表達后，G1/S期的細胞數(shù)目明顯增加，下咽癌細胞系（FADU）的增殖能力顯著降低。安建多等［16，17］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝臟再生過程中，UCP2 可以通過促進星形細胞的增殖，加速肝臟組織的再生。然而，Zhang等［18］研究發(fā)現(xiàn)，敲除UCP2 可以促進人類主動脈平滑肌細胞系（HA-SMC）增殖，而過表達UCP2可以抑制HA-SMC 增殖。張敏等［19］研究發(fā)現(xiàn)，過表達UCP4 后，處于S 期的3T3-L1 細胞數(shù)目明顯增多，促進細胞增殖。Zhang 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，過表達UCP4 可以促進大鼠網(wǎng)膜組織前體脂肪細胞的增殖，并抑制其凋亡。目前，關于UCP3 對細胞增殖的研究還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，UCP3 可以通過抑制增殖基因PCNA和Ki67 的表達，促進凋亡基因Caspase3 與Bax的表達，進而抑制C2C12 細胞的增殖。

圖4 Sh-UCP3 和Sh-NC 組C2C12 細胞的增殖速率Fig.4 Proliferation rate of C2C12 cells in Sh-UCP3 and Sh-NC groups

圖5 Sh-UCP3 和Sh-NC 組細胞中增殖和凋亡基因的表達量Fig.5 The expression of proliferation and apoptosis genes in Sh-UCP3 and Sh-NC group

細胞的增殖過程非常復雜，有很多基因參與調(diào)控細胞的增殖和凋亡。增殖細胞核抗原（PCNA）在DNA 的復制過程中發(fā)揮著重要的作用，可以促進細胞增殖［21，22］。Kong 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，抑制lncLUCAT1 的表達，可以降低PCNA的表達量，從而抑制人類口腔鱗狀細胞癌（OSCC）的增殖。He 等［24］研 究 發(fā) 現(xiàn)，lncAK027294 可 以 通 過 促 進PCNA的表達而促進人胃癌細胞（GC）的增殖。Lee 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝臟再生過程中，松針提取物可以通過促進PCNA和Ki67 的表達，從而促進肝臟細胞的增殖，加速肝臟再生。本研究也發(fā)現(xiàn)，過表達UCP3 基因，可以通過降低PCNA的表達量抑制C2C12 細胞的增殖。Caspase3 與Bax是重要的凋亡基因，其表達量與細胞增殖具有明顯的負相關。抑制人類泛素化因子E4B（UCE4B）的表達，可以促進caspase3 的表達，進而抑制人鼻咽癌細胞的增殖［26］。Wang 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，百合提取物通過上調(diào)caspase3 的表達，明顯增加G2/M 期的細胞數(shù)量，抑制人胃癌細胞系SGC-7901 的增殖，并促進其凋亡。熊去氧膽酸（UDCA）可以通過抑制P53/Bax 信號通路降低Bax 蛋白的含量，進而抑制大鼠肝細胞凋亡［28］。Pan 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加氟化物，可以促進C2C12 細胞中Bax的表達，抑制細胞增殖，加速細胞凋亡。韓宇等［30］研究發(fā)現(xiàn)，miR-19b 可以通過抑制Bax的表達，促進P19CL6 細胞的增殖，抑制其凋亡。本研究也發(fā)現(xiàn)，UCP3 可以促進caspase3 與Bax基因的表達，進而抑制C2C12 細胞的增殖。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)過表達UCP3 基因可以顯著降低C2C12 細胞增殖速率并顯著減少EDU 陽性細胞數(shù)，通過抑制細胞增殖基因PCNA和Ki67 的表達，促進細胞凋亡基因Bax和caspase3 的表達進而抑制C2C12 細胞的增殖。干擾UCP3 基因可以提高降低C2C12 細胞增殖速率并顯著增加EDU 陽性細胞數(shù)，通過促進細胞增殖基因PCNA和Ki67的表達，抑制細胞凋亡基因Bax和caspase3 的表達進而促進C2C12 細胞的增殖。