PAS染色及真菌熒光染色在皮下真菌病診斷中的應(yīng)用

徐艷 張戀 鐘白玉 張靜 翟志芳

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，重慶 400039)

皮下真菌病(subcutaneous mycoses)是指侵犯真皮、皮下組織和骨骼的真菌感染[1]，部分可播及周邊組織，如足菌腫等，有些則沿淋巴管擴(kuò)散，如孢子絲菌病、著色芽生菌病，對(duì)人體造成較大危害。這類疾病病程緩慢，早期臨床表現(xiàn)不典型，為疾病的早期診斷帶來一定困難。真菌培養(yǎng)是其診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而，真菌培養(yǎng)陽性率偏低，重要的是部分早期病例不容易考慮到真菌感染，多在組織病理提示后才考慮到深部真菌感染的可能性。病理學(xué)檢查中，特殊染色，如PAS染色對(duì)真菌感染的診斷具有重要意義。近年來，隨著真菌熒光染色方法的逐步推廣，為了解真菌熒光染色方法在組織病理學(xué)中的應(yīng)用，我們比較了經(jīng)真菌培養(yǎng)確診的皮下真菌病的組織病理檢查中PAS染色及真菌熒光染色的檢測效果，探討兩種染色方法在組織病理檢查過程中，對(duì)皮下真菌病的診斷價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

選擇2013年1月至2018年2月就診于我科，經(jīng)真菌培養(yǎng)確診同時(shí)行皮膚病理檢查的皮下真菌病病例共42例，其中孢子絲菌病36例，著色芽生菌病6例，男23例，女19例，年齡5～88歲。

1.2 方法

所有蠟塊重新切片，同時(shí)進(jìn)行PAS染色和真菌熒光染色，比較兩種染色方法診斷皮下真菌病的

實(shí)驗(yàn)室價(jià)值。

1.3 染色原理

過碘酸雪夫染色液(PAS)：PAS染色是組織病理學(xué)中最常用的真菌特殊染色法，以亮綠或蘇木素復(fù)染，真菌著紅色，組織中細(xì)胞核著綠色或藍(lán)色。真菌熒光染色液：采用貝索真菌熒光染色液，常規(guī)石蠟切片脫蠟至水，滴1滴熒光染色液，加蓋玻片，通過250～400 nm濾鏡的熒光顯微鏡下觀察，判斷真菌的存在。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)，以α=0.05為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

42例病例中，孢子絲菌病36例，著色芽生菌病6例。PAS染色陽性19例，其中6例著色芽生菌病PAS染色均找見硬殼細(xì)胞(100%)，孢子絲菌病中僅13例陽性(36.11%)。真菌熒光染色陽性21例，著色芽生菌病陽性僅2例(33.33%)，孢子絲菌病19例陽性(52.78%)，見表1。見圖1、2。對(duì)PAS染色及真菌熒光染色陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，χ2=0.191，P>0.05，兩種方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

皮下真菌病是指侵犯真皮、皮下組織和骨骼的真菌感染，主要包括孢子絲菌病、著色芽生菌病、暗色絲孢霉病及足菌腫。不同真菌引起的皮膚真菌病需要相互鑒別，還需要與其他感染性皮膚病相鑒別，如皮膚結(jié)核、非結(jié)核分支桿菌感染、麻風(fēng)、梅毒、利什曼病等鑒別，也需要與非感染性皮膚病相鑒別，因此，當(dāng)臨床懷疑皮膚真菌時(shí)，需要進(jìn)行直接鏡檢、真菌培養(yǎng)或組織病理檢查，必要時(shí)進(jìn)行分子生物學(xué)檢查，獲得明確診斷[1]。

表1 42例皮下真菌病PAS染色與真菌熒光染色結(jié)果分析

圖1 真菌熒光染色×400 圖2 PAS染色 ×400Fig.1 Fungal fluorescence stain ×400Fig.2 PAS stain ×400

皮下真菌病的診斷可以通過直接鏡檢、真菌培養(yǎng)及組織病理學(xué)檢查來明確診斷。病理學(xué)檢查中，特殊染色，如PAS染色對(duì)真菌感染的診斷具有重要意義。一般用組織標(biāo)本進(jìn)行直接鏡檢相對(duì)淺部真菌較為繁瑣困難，另外真菌培養(yǎng)物需排除污染菌的可能性。近年來，真菌熒光染色在臨床的應(yīng)用逐步推廣，在組織病理檢查中對(duì)真菌感染檢測的應(yīng)用也越來越廣泛。真菌熒光染色試劑可用于人體組織或樣本的染色處理，包括皮屑、甲屑、毛發(fā)、尿液、體液及陰道分泌物等，在熒光顯微鏡下定性檢測真菌。主要原因是熒光增白劑與組織中可能存在的真菌細(xì)胞壁β-多糖結(jié)合，如幾丁質(zhì)和纖維素等，在紫外光的激活下，可使真菌顯示出熒光。目前關(guān)于真菌熒光染色的應(yīng)用，更多用于皮屑、甲屑、毛發(fā)等標(biāo)本，關(guān)于其敏感性和特異性，已有不少文獻(xiàn)肯定[2-3]，在組織病理中的應(yīng)用，還需要更多的臨床佐證。

本次回顧性分析可見對(duì)于著色芽生菌病PAS染色敏感性高于真菌熒光染色，可能是由于著色芽生菌病的組織病理表現(xiàn)多是硬殼細(xì)胞，熒光增白劑與細(xì)胞壁β-多糖結(jié)合無法完全結(jié)合顯示熒光。而對(duì)于孢子絲菌病，PAS染色不及真菌熒光染色?？赡苁怯捎阪咦咏z菌孢子比較小，如果在組織分布較少，不容易著色。另有一個(gè)原因是孢子在組織內(nèi)分布不在一個(gè)層次，如果未連續(xù)切片可能造成有些切片有真菌孢子，有些沒有。PAS染色一直作為組織病理檢查中一種經(jīng)典的染色方法，相較于革蘭染色、硝酸銀染色等，PAS染色有對(duì)真菌特異性強(qiáng)、著色鮮艷等優(yōu)點(diǎn)[4]，還能根據(jù)一些特征性結(jié)構(gòu)，簡便鑒別菌屬，比如硬殼細(xì)胞、星狀體等，因此對(duì)于真菌病的診斷有著決定性的意義。

因本次分析樣本量有限，兩種方法陽性率之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PAS染色與真菌熒光染色對(duì)皮下真菌病的診斷價(jià)值差異不大，但臨床實(shí)踐中可兩種方法互補(bǔ)，以提高組織病理真菌檢驗(yàn)結(jié)果的陽性率。