Fonsecaea monophora色素毒力性研究

王麗 王薇

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院皮膚科，?？?570208)

著色芽生菌病(chromoblastomycosis，CBM)是一種慢性皮膚和皮下組織肉芽腫性真菌病[1,2]。

該病頑固難治、復(fù)發(fā)率高，通常局限于皮膚和皮下組織，表現(xiàn)為慢性疣狀、結(jié)節(jié)狀或菜花狀肉芽腫性皮膚病變。晚期可經(jīng)淋巴管血管播散，致畸致殘，甚至在慢性潰瘍的基礎(chǔ)上發(fā)生鱗狀細(xì)胞癌，嚴(yán)重威脅人類身心健康[3]。

黑色素是多數(shù)病原真菌的重要毒力因子，例如白念珠菌、隱球菌、孢子絲菌、組織胞漿菌和曲霉等。其具有極強(qiáng)的抵御外來離子輻射、氧化條件變化、極度溫度更替和pH 值改變的作用[4]。此外黑色素還擔(dān)負(fù)著增強(qiáng)致病真菌侵襲毒力和誘生真菌耐藥性的作用,導(dǎo)致人體免疫防御反應(yīng)性降低和抗真菌藥物耐藥性升高[5]。目前關(guān)于F.monophora致病性研究相對缺乏。本研究通過建立不同菌株、細(xì)胞壁色素顆粒與小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系，測定一氧化氮合酶基因、亞硝酸鹽濃度、Th1、Th2細(xì)胞因子的表達(dá)，探討黑色素是否為F.monophora重要毒力因素，是否在巨噬細(xì)胞與F.monophora免疫反應(yīng)中起到相關(guān)作用。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

實(shí)驗(yàn)菌株由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院真菌室提供，分離自81歲男性患者的皮損。該菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)及ITS序列檢測為F.monophora，是1株分生孢子變異株，編號為CBS122845，在SDA培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)種10余次產(chǎn)生其白色突變株(CBS125149)。

1.2 透視電鏡觀察兩株菌

使用無菌接種針從馬鈴薯斜面培養(yǎng)基(PDA)表面，將CBS122845，CBS125149剝離下來，放置存有PBS的試管中，用無菌玻璃吸管反復(fù)輕輕吹打菌落，制備菌懸液。以10000 r/min，離心10 min去上清液，加入3%戊二醛固定，儲存于4℃至廣州市陸軍總醫(yī)院電鏡室制樣、觀察。

1.3 酸堿法提取F.monophora細(xì)胞壁色素顆粒

使用無菌接種針從馬鈴薯斜面培養(yǎng)基(PDA)表面，將CBS122845，CBS125149剝離下來，放入存有0.5 mol/L NaOH的50 mL離心管中，渦旋混勻10 min, 在低溫?fù)u床上震蕩過夜。以10000 g，離心10 min，取上清液。用1 mol/L HCL將上清液的pH值調(diào)至1.5。以5000 g，離心10 min，去沉淀，用雙蒸水反復(fù)沖洗，離心后沉淀3～5遍后。將沉淀重懸于0.1 mol/L HCL溶液中，用0.1 mol/L HCL反復(fù)沖洗，離心后沉淀3～5遍后，直至上清液清亮無色。取沉淀，溶于0.1 mol/L HCL中，用雙蒸水透析，將裝有透析液的離心管放置-80℃冰箱過夜，隔日用冷凍干燥機(jī)將透析液凍干，將凍干粉儲存于-20℃冰箱

將從CBS122845提取的細(xì)胞壁顆粒命名為“F1”，將從CBS125149提取的細(xì)胞壁顆粒命名為“F0”，將上述凍干粉置于0.5 mol/L NaOH溶液中，用1 mol/L HCL中和溶液pH值，至pH值調(diào)至6～7之間，凍干粉完全溶解。再加入PBS緩沖液，將F1/F0濃度調(diào)至5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL。

1.4 共培養(yǎng)的建立

小鼠單核-巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞購自武漢大學(xué)中國典藏物保存中心(CCTCC)。

RAW264.7細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)傳代2～3次狀態(tài)穩(wěn)定后，用含EDTA的0.25%胰酶消化，以6×105/mL密度轉(zhuǎn)至六孔板，每孔板1.8 mL，加用50 U/mL IFN-γ、100 ng/mLLPS預(yù)刺激細(xì)胞，將六孔板置于含5%CO237℃培養(yǎng)箱24 h后。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組在每培養(yǎng)孔加入分生孢子懸液或F1/F0溶液共200 μL (其中分生孢子與巨噬細(xì)胞的數(shù)目比例均為5∶1)輕輕搖勻，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

實(shí)驗(yàn)分組 (Ⅰ) RAW264.7與F1共培養(yǎng)；(Ⅱ) RAW264.7與F0共培養(yǎng)；(Ⅲ) RAW264.7與CBS122845共培養(yǎng)；(Ⅳ) RAW264.7與CBS125149共培養(yǎng)；(Ⅴ) RAW264.7與CBS125149及F1共培養(yǎng)。

對照組 培養(yǎng)液中只含有RAW264.7，未添加任何分生孢子及色素顆粒。

1.5 實(shí)時(shí)熒光相對定量PCR檢測i-NOS基因的表達(dá)

主要試劑、儀器 RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix EX TaqTMII 熒光 Real-Time PCR 試劑 盒 都 購 自TaKaRa公司 。 Real time-PCR 儀 (Light Cy-cler480)。引物合成由TaKaRa公司完成：i-NOS的引物：擴(kuò)增產(chǎn)物長度為185bp，上游引物:5’- CAAGCTGAACTTGAGCGAGGA-3’，下游引物: 5’-TTTACTCAGTGCC AGAAGCTGGA -3’；內(nèi)參照β-actin的引物：擴(kuò)增產(chǎn)物長度為171bp，上游引物:5’- CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’，下游引物:5’- ATGGAGCCACC GATCCACA -3’

SYBR Green Real-time PCR法檢測i-NOS基因的表達(dá) ①組織總 RNA 的提取和 c DNA 的合成：各組培養(yǎng)的細(xì)胞棄上清，并以PBS沖洗2遍，每孔加Trizol 1 mL，嚴(yán)格按照說明書操作提取組織總 RNA，用紫外分光光度儀測定其純度，D(260)/D(280)值在 1.8～2.1 之間，之后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，每10 μL反應(yīng)體系中加入500 ng總RNA，反應(yīng)體系為20 μL，反轉(zhuǎn)錄條件：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃。反應(yīng)后 c DNA 置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。②SYBR 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 及數(shù)據(jù)處理：應(yīng)用Light Cy-cler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測i-NOS基因相對表達(dá)量，按照TAKARA熒光定量PCR試劑盒操作說明進(jìn)行，20 μL PCR反應(yīng)體系：其中c DNA含量為2μL，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，95℃ 5 s，60℃ 20 s。循環(huán)結(jié)束后，繪制溶解曲線95℃ 1 min，65℃ 15 s；降溫37℃ 30 s。由Light Cycle Real-Time PCR軟件自動記錄熒光曲線并分析計(jì)算出 Ct 值。采用相對定量2-△△ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，根據(jù)以下公式計(jì)算：△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)未知樣本組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組，以β-actin作為內(nèi)參，以2-△△CT法分析進(jìn)行組間相對定量分析。

1.6 格里斯法檢測一氧化氮(nitric oxide,NO)的表達(dá)

采用格里斯法測定不同培養(yǎng)體系亞硝酸鹽和硝酸鹽(NO2-/NO3-)的總量來計(jì)算一氧化氮的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)方法參照一氧化氮測試盒(Bioassay Systems,D2NO-100,美國)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。MK3全自動酶標(biāo)儀(德國生產(chǎn))在492 nm波長處測定吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和每個(gè)樣本的吸光度值計(jì)算其含量，樣品濃度計(jì)算如下：[Nitriteand nitrate]=(ODSAMPLE-ODBLANK)/Slope (μmol/L )，ODSAMPLE和ODBLANK分別是樣品和水的吸光值。

1.7 ELISA檢測IL-12、TNF-α、IL-10的表達(dá)

ELISA檢測不同培養(yǎng)體系RAW264.7細(xì)胞IL-12、TNF-α、IL-10的表達(dá) 采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),參照ELISA檢測試劑盒(RayBiotech,美國)， 整個(gè)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。MK3全自動酶標(biāo)儀德國生產(chǎn)在450 nm波長處測定吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和每個(gè)樣本的吸光度值計(jì)算其含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以上實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)復(fù)孔，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用方差分析(ANOVA)，多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較的t檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CBS122845、CBS125149大培養(yǎng)、顯微電鏡、透視電鏡下形態(tài)，提取的色素顆粒形態(tài)

將CBS122845、CBS125149接種于PDA培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)13～15 d后，CBS122845生長成黑色菌落，CBS125149生長成白色菌落。兩株菌菌落均表現(xiàn)為干燥、堆積、質(zhì)脆。CBS122845菌落表面較為粗糙，CBS125149較為光滑(見圖1a、b)。CBS122845生長較CBS125149較慢。倒置顯微鏡下觀察，CBS122845分生孢子相對于CBS125149分生孢子個(gè)體較大，排列較緊密(見圖1c、d)。透視電鏡下觀察，CBS122845細(xì)胞壁表面存在致密顆粒，但CBS125149缺乏這類顆粒，表面光滑(見圖1e、f)。通過酸堿法，我們提取了CBS122845分生孢子細(xì)胞壁成分“F1”，提取CBS125149分生孢子細(xì)胞壁成分“F0”。“F1”呈黑色，“F0”呈白色(見圖1g、h)。

2.2 實(shí)時(shí)熒光相對定量PCR檢測i-NOS基因的表達(dá)結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線分析見圖2a，RAW264.7細(xì)胞中目的基因i-NOS的表達(dá)結(jié)果見圖2b、c。

以RAW264.7細(xì)胞(50 U/mL IFN-γ、100 ng/mL LPS預(yù)刺激24 h后)i-NOS mRNA表達(dá)為基點(diǎn)，設(shè)為1。不同濃度細(xì)胞壁色素顆粒F1/F0與激活狀態(tài)的RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，F(xiàn)1組(10 μg/mL、20 μg/mL)與F0組(10 μg/mL、20 μg/mL)相比，“F1”能顯著降低RAW264.7細(xì)胞一氧化氮合酶基因的表達(dá)。同一濃度下，兩組之間進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且當(dāng)“F1”濃度調(diào)整為10 μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞一氧化氮合酶基因的表達(dá)量受抑制程度達(dá)到最低。白色突變株CBS125149與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，i-NOS基因相對值為9.64±0.99，在該共培養(yǎng)體系中，添加不同濃度色素顆粒F1，隨著F1濃度從5 μg/mL逐漸升至50μg/mL，RAW264.7細(xì)胞i-NOS基因的表達(dá)量逐步下降。

圖1 a. CBS122845大培養(yǎng)形態(tài)； b. CBS125149大培養(yǎng)形態(tài)； c. CBS122845倒置顯微鏡下形態(tài)； d. CBS125149倒置顯微鏡下形態(tài)； e. CBS122845透視電鏡下形態(tài)； f. CBS125149透視電鏡下形態(tài)； g. “F1”凍干粉； h. “F0”凍干粉 圖2 a.目的基因i-NOS、內(nèi)參基因β-actin real-time PCR產(chǎn)物的溶解曲線圖; b. 不同濃度細(xì)胞壁色素顆粒F0/F1與激活狀態(tài)的RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，RAW264.7細(xì)胞中目的基因i-NOS的表達(dá); c. CBS125149及不同濃度 F1與激活狀態(tài)的RAW264.7細(xì)胞三者共培養(yǎng)。RAW264.7細(xì)胞中目的基因i-NOS的表達(dá)

2.3 格里斯法檢測一氧化氮的表達(dá)結(jié)果

由于NO化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，本次實(shí)驗(yàn)通過測量NO2-/NO3-總濃度以評估NO釋放量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對比于白色突變株CBS125149，色素株CBS122845與RAW264.7細(xì)胞反應(yīng)，能顯著抑制RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO(P<0.05)。對比于“10 μg/mL F0”，10 μg/mL色素顆?！癋1”能顯著抑制RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO(P<0.05)。在白色突變株與RAW264.7細(xì)胞反應(yīng)體系中，加入10 μg/mL色素顆?！癋1”后，RAW264.7細(xì)胞NO的釋放量出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.05)(見表1)。

2.4 ELISA檢測IL-12、TNF-α、IL-10的表達(dá)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，對比白色突變株CBS125149、色素株CBS122845與RAW264.7細(xì)胞反應(yīng)，能顯著抑制RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生IL-12、TNF-α，上調(diào)其產(chǎn)生IL-10(P<0.05)。對比10 μg/mL細(xì)胞壁顆?！癋0”，10 μg/mL細(xì)胞壁色素顆粒“F1” 能抑制RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生IL-12，上調(diào)其產(chǎn)生IL-10(P<0.05)。在白色突變株與RAW264.7細(xì)胞反應(yīng)體系中，加入10 μg/mL色素顆?！癋1”后，RAW264.7細(xì)胞的IL-12、TNF-α釋放量出現(xiàn)明顯下調(diào)，IL-10釋放量出現(xiàn)明顯上調(diào)(P<0.05)。

表1 各組RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)體系上清液中，亞硝酸鹽和硝酸鹽濃度的總表達(dá)量

3 討 論

F.monophora屬于著色霉屬的真菌，是近年從裴氏著色霉中分出的新種，是中國南方著色真菌病的主要病原體。其臨床表現(xiàn)多樣，如化膿、結(jié)節(jié)、斑塊、疣狀及腫瘤樣損害。慢性病程可持續(xù)數(shù)年或數(shù)十年。可因疤痕形成而致殘，甚至喪失勞動能力，久治不愈可發(fā)展為鱗癌[6]，甚至可引起其他類型感染(如顱內(nèi)感染[7，8]。F.monophora的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。

細(xì)胞壁成分是著色芽生菌病中真菌持續(xù)和增殖的關(guān)鍵因素，也是肉芽腫病變發(fā)展的重要刺激因素[9，10]。Fonsecaea的細(xì)胞壁成分主要由β-1-3-葡聚糖、幾丁質(zhì)、α-1-3-葡聚糖、半乳甘露聚糖、大部分蛋白質(zhì)和黑色素[11]組成。

黑色素是一類常見于微生物和動植物體內(nèi)的高分子量、非均質(zhì)、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的聚合體，通常分為細(xì)胞壁和細(xì)胞外黑色素兩種[12，13]。依據(jù)合成途徑不同，黑色素又分為DHN-黑色素和DOPA-黑色素兩種。DHN-黑色素由前體物質(zhì)1, 8-二羥基萘(DHN)經(jīng)過氧化聚合而成，多見于子囊菌綱和半知菌綱真菌，如構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、煙曲霉、卡氏枝孢霉、甄氏外瓶霉、緊密著色霉、裴氏著色霉、圓酵母樣亨德遜霉、孢子絲菌等。DOPA-黑色素以酪氨酸為底物，經(jīng)漆酶(酚氧化酶)的氧化作用，最后聚合形成DOPA-黑色素，見于白念珠菌、組織胞漿菌、新生隱球菌等[14，15]。Romero-Martinez等[16]對DHN-黑色素合成途徑中PKS缺陷的孢子絲菌mel14的研究認(rèn)為，黑色素在抵抗紫外線、亞硝酸鹽和過氧化氫等應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用。此外許多研究表明，黑色素可以阻礙機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)性氧族(ROS)的生成并抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬作用，與病原真菌的致病力關(guān)系密切[17-19]。瓜類炭疽病菌、稻瘟病病菌的黑色素能促使附著胞膨脹壓的產(chǎn)生，有利于真菌滲透進(jìn)入植物的葉從而感染[17,18]。對巴西副球孢子菌的研究也表明黑色素有利于菌體抗巨噬細(xì)胞的吞噬并增強(qiáng)其對藥物的抵抗性[22]。Garcia-Rivera等[23]對新生隱球菌的研究表明，黑色素能改變隱球菌細(xì)胞表面電荷而抵制宿主細(xì)胞對隱球菌的吞噬。這些研究均提示黑色素是多數(shù)病原真菌的毒力因子。但對于著色霉，黑色素的致病性研究較缺乏。

圖3 a. 不同菌株、細(xì)胞壁色素顆粒與激活狀態(tài)的RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，上清液中IL-12的表達(dá)量; b. 不同菌株、細(xì)胞壁色素顆粒與激活狀態(tài)的RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，上清液中TNF-α的表達(dá)量; c. 不同菌株、細(xì)胞壁色素顆粒與激活狀態(tài)的RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，上清液中IL-10的表達(dá)量

巨噬細(xì)胞作為一種極其重要的固有免疫細(xì)胞，在抵抗著色霉屬真菌感染中發(fā)揮著重要作用。以往研究認(rèn)為巨噬細(xì)胞不能直接殺滅著色真菌菌體，但可通過氧化應(yīng)激氧化應(yīng)激對菌體生長起抑制作用，抑制出芽管及菌絲的形成[24]。NO及活性氮媒介與金屬離子結(jié)合、與芳香殘基的親核中心結(jié)合，硝基化反應(yīng)及亞硝基化反應(yīng)，從而對一系列蛋白進(jìn)行修飾來完成復(fù)雜的調(diào)節(jié)功能[25]。使cGMP增加，從而影響細(xì)胞的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)[26,27]；調(diào)節(jié)氧耗量和ATP的產(chǎn)量，影響線粒體功能，控制細(xì)胞的凋亡[28,29]；調(diào)節(jié)通道蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、激酶及許多代謝相關(guān)的酶的表達(dá)[30,31]。目前，在真菌學(xué)方面，RNI研究相對缺乏。相關(guān)研究認(rèn)為NO可延遲真菌分生孢子的出芽過程[32]。

本研究通過Real-time PCR方法對不同實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞中i-NOS基因表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。結(jié)果顯示，10 μg/mL、20 μg/mL “F1”能顯著降低RAW264.7細(xì)胞i-NOS基因的表達(dá)，當(dāng)“F1”濃度調(diào)整為10 μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞i-NOS基因的表達(dá)量最低。在白色突變株CBS125149與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)體系中添加不同濃度色素顆粒F1，隨著F1濃度從5 μg/mL逐漸升至50 μg/mL，RAW264.7細(xì)胞i-NOS基因的表達(dá)逐步下降。上述結(jié)果均表明色素顆?？梢种芌AW264.7細(xì)胞i-NOS基因的表達(dá)。此外，本研究通過格里斯法檢測NO表達(dá)，發(fā)現(xiàn)色素株及細(xì)胞壁色素顆粒能抑制RAW264.7細(xì)胞NO的生成。在白色突變株CBS125149與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)體系中添加10 μg/mL色素顆粒F1，RAW264.7細(xì)胞NO的釋放量出現(xiàn)明顯下調(diào)。我們的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)F.monophora入侵機(jī)體時(shí)，細(xì)胞壁色素顆?？蓪w產(chǎn)生保護(hù)作用，在與巨噬細(xì)胞相互作用過程中，能下調(diào)i-NOS基因、抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，從而抵御巨噬細(xì)胞對F.monophora氧化應(yīng)激作用，使F.monophora逃逸巨噬細(xì)胞氧化殺傷作用。黑色素能夠抵抗NO的免疫破壞。這一過程有利于真菌在組織中的持續(xù)存在，并負(fù)向調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)。

此外，著色芽生菌病的皮損內(nèi)常見的免疫細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞和許多巨噬細(xì)胞[33]。研究顯示,在CBM病情嚴(yán)重的患者中可觀察到IL-10水平升高而IFN-γ水平降低，同時(shí)體外刺激并不出現(xiàn)T細(xì)胞增殖，反之，在病情輕的患者產(chǎn)生高水平IFN-γ和低水平IL-10，同時(shí)體外刺激可見T細(xì)胞增殖反應(yīng)[34,35]。著色芽生菌病的嚴(yán)重程度與機(jī)體內(nèi)Th1、Th2免疫反應(yīng)的平衡程度有密切關(guān)系，機(jī)體對菌體的殺傷作用依賴于加強(qiáng)Th1、抑制Th2免疫反應(yīng)，反之，菌體的生長與增殖依賴于抑制Th1、加強(qiáng)Th2免疫反應(yīng)。

LSP、IFN-γ就可刺激巨噬細(xì)胞合成細(xì)胞因子如IL-10、TNF-α、IL-12等，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞對微生物的殺傷作用。研究認(rèn)為宿主細(xì)胞對真菌的殺傷抑制效應(yīng)，依賴于Th1細(xì)胞免疫。在抵御多數(shù)真菌，如組織胞漿菌[36]、新生隱球菌[37]、白念珠菌[38]的免疫反應(yīng)中，Th1細(xì)胞因子被認(rèn)為是抑制菌體生長、協(xié)同氧化殺傷菌體的調(diào)節(jié)因子。本實(shí)驗(yàn)測定了Th1細(xì)胞因子TNF-α、IL-12以及Th2細(xì)胞因子IL-10。結(jié)果發(fā)現(xiàn)色素株及色素顆粒能下調(diào)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IL-12，上調(diào)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)IL-10細(xì)胞因子。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能揭示了F.monophora色素能下調(diào)機(jī)體Th1細(xì)胞免疫，上調(diào)Th2細(xì)胞免疫。這些數(shù)據(jù)表明，黑色素在體外抑制Th1反應(yīng)，加重Th2反應(yīng)。這一過程表明，CBM的嚴(yán)重程度可能與黑色素密切相關(guān)。

綜上所述，黑色素是F.monophora的重要致病因子。黑色素是F.monophora逃脫巨噬細(xì)胞氧化爆發(fā)的重要成分。黑色素抑制Th1反應(yīng)和加劇Th2反應(yīng)，有利于真菌的持續(xù)感染。