大鼠激素性股骨頭壞死模型的建立和評價

黃立毅 趙友

激素性股骨頭壞死是骨科常見的非創(chuàng)傷性骨壞死疾病，臨床普遍認為其病因主要為大劑量外源性激素的使用，造成骨壞死并發(fā)癥發(fā)生［1］。近年來，隨著糖皮質(zhì)激素廣泛應用于自身免疫性疾病的治療中，激素性股骨頭壞死的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢［2］。但其發(fā)病機制尚不明確，建立科學有效的激素性股骨頭壞死動物模型，對其病理研究具有重要意義［3］。目前激素性股骨頭壞死動物模型種類較多，而其建模方式及評價方法尚未統(tǒng)一［4］。本研究擬通過注射脂多糖及大劑量甲基強的松建立大鼠激素性股骨頭壞死模型，并進行組織形態(tài)學觀察，分析其有效性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 選擇清潔級SD大鼠50只，雌雄各半，均由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，按照標準飼養(yǎng)條件在浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心飼養(yǎng)，溫度22℃～26℃，濕度37%～42%，光照按12 h晝夜交替，自由攝食飲水，每籠2只，適應性喂養(yǎng)1周。后按隨機數(shù)表法將大鼠均分為實驗組和對照組各25只，兩組大鼠年齡均為12周；體重400～450 g，平均（421.64±10.54）g。

1.2 主要儀器、試劑及方法 光學顯微鏡（上海巴拓科技，型號：BMM-230BD DIC）；脂多糖注射液（國藥準字S12020001，天津市生物化學制藥廠）、甲基強的松（國藥準字H20130303，天津金耀藥業(yè)有限公司）、氯化鈉注射液（國藥準字H20044024，北京天壇生物制品股份有限公司）；睪酮（T）、促甲狀腺激素（TSH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）試劑盒均購自合肥萊爾生物科技有限公司，環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）試劑盒均購自上海紀寧生物科技有限公司。實驗組給予脂多糖（20 μg/kg）腹腔注射，每間隔24 h注射1次，共注射2次；肌肉注射大劑量甲基強的松（40 mg/kg），每間隔24 h注射1次，共注射3次。對照組同時間給予等量生理鹽水注射。共觀察6周后處死。

1.3 觀察指標 （1）比較兩組大鼠活動情況。在進行6周的行為學觀察后進行相關(guān)行為學試驗，評估大鼠活動情況，開場試驗：準備內(nèi)壁為黑色的試驗箱，底面用白線劃分為面積相等的25塊正方形，將大鼠置于中心方格內(nèi)，記錄大鼠活動的平均速度和活動總距離；自主活動次數(shù)測定：將大鼠置于自主活動儀上，預適應10 min后，記錄大鼠3 min內(nèi)自主活動次數(shù)；抓力測試：抓持大鼠尾根處，待大鼠用力抓住抓力板時及時向后加力，測得最大抓力，測定3次/只，取平均值記錄；（2）比較兩組大鼠生化指標。采用10%水合氯醛麻醉大鼠，后心臟穿刺抽取動脈血12 ml，分別加入含有肝素的抗凝管和不含肝素的試管，于37℃恒溫水浴30 min后，以3200 r/min離心5 min，分別提取血漿和上清液保存于-20 ℃冰箱待檢。采用放射免疫法檢測血清T、TSH、ACTH及cAMP、cGMP水平；（3）組織病理學觀察。觀察6周后處死大鼠，沿大鼠股骨頭冠狀面剖開，盡量剔除股骨頭周圍軟組織，后置入10%中性甲醛固定液，固定24 h，采用30%甲酸脫鈣3 d后，流水沖凈，后常規(guī)行脫水、透明處理、石蠟包埋，制成厚約3～4 μm的切片，經(jīng)HE染色，光學顯微鏡下觀察兩組大鼠組織形態(tài)學變化情況，并采用顯微鏡圖像分析軟件測量骨小梁寬度、股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積占比、每視野下骨空泡陷窩數(shù)量及單位面積骨小梁內(nèi)膠原含量。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較行t檢驗；計數(shù)資料以（%）表示，組間比較行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠活動情況比較 實驗組大鼠開場試驗中活動平均速度、活動總距離及3 min內(nèi)自主活動次數(shù)、最大抓力均低于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組治療療效比較（±s）

活動總距離（cm）組別 n 活動平均速度（cm/s）3 min內(nèi)自主活動次數(shù)（次）最大抓力（N）實驗組 25 34.56±12.41 1523.46±451.34 48.64±12.42 610.54±42.12對照組 25 50.46±14.13 2041.46±641.51 63.54±13.74 731.12±39.46 t值 4.227 3.302 4.022 10.446 P值 ＜0.001 0.002 ＜0.001 ＜0.001

2.2 兩組大鼠T、TSH、ACTH、cAMP、cGMP水平比較 實驗組大鼠T、TSH、ACTH、cAMP水平均低于對照組（P＜0.05），cGMP水平高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組大鼠T、TSH、ACTH、cAMP、cGMP水平比較（±s）

表2 兩組大鼠T、TSH、ACTH、cAMP、cGMP水平比較（±s）

組別 n T（ng/ml）TSH（ng/ml）ACTH（pg/ml）cAMP（nmol/l）cGMP（nmol/l）實驗組 25 7.56±1.68 2.82±0.69 17.24±4.03 112.05±11.46 28.46±4.13對照組 25 11.42±2.05 3.54±0.67 44.81±11.06 161.02±20.41 17.42±3.05 t值 7.282 3.743 11.711 10.460 10.752 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 兩組大鼠股骨頭骨小梁寬度、骨小梁面積占比、空泡陷窩數(shù)量、骨小梁內(nèi)膠原含量比較 實驗組大鼠骨小梁寬度、股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積占比、骨小梁內(nèi)膠原含量均低于對照組（P＜0.05），空泡陷窩數(shù)量高于對照組（P＜0.05），見表3。

表3 兩組大鼠股骨頭骨小梁寬度、骨小梁面積占比、空泡陷窩數(shù)量、骨小梁內(nèi)膠原含量比較（±s）

表3 兩組大鼠股骨頭骨小梁寬度、骨小梁面積占比、空泡陷窩數(shù)量、骨小梁內(nèi)膠原含量比較（±s）

骨小梁內(nèi)膠原含量（%）實驗組 25 63.15±8.46 55.16±6.12 6.15±1.05 47.86±3.45對照組 25 93.16±8.54 68.97±6.15 0.63±0.41 55.15±6.12 t值 12.482 7.959 22.540 5.188 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001組別 n 骨小梁寬度（μm）骨小梁面積占比（%）空泡陷窩數(shù)量（個）

2.4 兩組大鼠股骨頭病理組織觀察 觀察組中股骨頭部骨小梁變細，間距增大，結(jié)構(gòu)紊亂，可見部分骨小梁斷裂，骨髓中脂肪細胞增多，空泡陷窩數(shù)量較多；對照組中骨小梁較粗，排列規(guī)則，骨髓腔中造血細胞較多，無明顯空泡陷窩（見圖1～2）。

圖1 觀察組大鼠股骨頭病理組織圖

圖2 對照組大鼠股骨頭病理組織圖

3 討論

調(diào)查顯示，激素性股骨頭壞死約占股骨頭壞死的3%～38%，是繼外傷后造成股骨頭壞死的第二大原因［5］。而長期、大量使用激素是造成激素性股骨頭壞死的首要原因，疾病常引起患者疼痛、活動障礙，目前對其尚無特效治療方案［6］。但其發(fā)病機制目前尚不明確，建立科學有效的動物模型對疾病研究具有重要意義，以往常用雞、兔建立激素性股骨頭壞死動物模型，而研究顯示其方便性、適合性等稍欠缺［7-8］。

本研究顯示，實驗組大鼠開場試驗中活動平均速度、活動總距離及3 min內(nèi)自主活動次數(shù)、最大抓力均低于對照組，提示造模使用的脂多糖及大劑量甲基強的松對大鼠活動能力造成一定損害。開場試驗是較為經(jīng)典的大鼠行為學測試方法，可有效反映大鼠的活動能力［9］。LI等［10］研究也顯示，應用激素后大鼠活動總距離和活動平均速度與正常大鼠比較差異有統(tǒng)計學意義。激素性股骨頭壞死可引起自主活動抑制、肢力減弱等現(xiàn)象，與臨床激素性股骨頭壞死患者所表現(xiàn)的主動性活動減少、生活被動等類似，實驗組大鼠自主活動次數(shù)減少、抓力減小提示出現(xiàn)激素性股骨頭壞死行為學改變。

實驗室相關(guān)指標可反映疾病生理或病理的變化，研究顯示，激素性股骨頭壞死患者垂體ACTH細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體空化，ACTH合成分泌受抑［11］。T是雄性動物體內(nèi)最重要的一種雄激索，在促進精子發(fā)育、維持第二性征等方面起重要作用，臨床研究提示激素性股骨頭壞死患者存在嚴重的性激索紊亂，主要表現(xiàn)為T含量降低［12-13］。本研究顯示，實驗組大鼠T、TSH、ACTH、cAMP水平均低于對照組，而cGMP水平高于對照組，與汪軒等［14］報道相似。表明注射脂多糖及大劑量甲基強的松誘導的大鼠模型可出現(xiàn)與激素性股骨頭壞死患者相似的生化指標改變。

股骨頭壞死是指股骨頭內(nèi)的活性成份，如骨細胞、骨髓造血細胞及脂肪細胞減少所引起的病理過程，在股骨頭內(nèi)出現(xiàn)不同程度的骨小梁及骨髓組織壞死，是股骨頭壞死的本質(zhì)待征［15］。骨小梁壞死在病理學上表現(xiàn)為骨小梁的骨陷窩內(nèi)原有的骨細胞消失，形成空泡陷窩［16］。王繼濤等［17］根據(jù)股骨頭壞死的病理演變過程，將骨壞死的組織學特征歸納為骨髓造血成分消失；骨髓脂肪呈網(wǎng)狀壞死；骨髓及骨小梁壞死；壞死骨髓及骨小梁周圍，有纖維組織或新骨形成。本研究中，病理學觀察顯示實驗組大鼠出現(xiàn)骨小梁寬度、股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積占比、骨小梁內(nèi)膠原含量降低，空泡陷窩數(shù)量明顯上升，提示大鼠模型出現(xiàn)典型的股骨頭壞死病理學征象，激素誘導的股骨頭壞死模型構(gòu)建成功。

綜上，采用注射脂多糖及大劑量甲基強的松誘導的大鼠激素性股骨頭壞死模型可形成與激素性股骨頭壞死患者相似的行為學、生化指標及生理學改變，是研究激素性股骨頭壞死的良好動物模型。