螺旋藻多糖對急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的殺傷作用

李巖，張競男，張謹(jǐn)，石文華，葉書梅，鄧秀玲，扈瑞平，薛慧婷

白血病是一類惡性血液病，其中急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是成年人群中最常見的急性白血病，其患病率為3/10萬～5/10萬［1］。目前治療AML的手段主要有干細(xì)胞移植和化療，但治療費(fèi)用昂貴且存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)，治療后患者的5 年生存率低于 50%［2?3］。因此，尋找高效、低毒、經(jīng)濟(jì)的靶向藥物已成為目前的研究熱點(diǎn)之一。螺旋藻屬于藍(lán)藻門、藍(lán)藻綱、顫藻目、顫藻科，是一種絲狀多細(xì)胞螺旋形原核藻類生物，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、維生素、礦物質(zhì)、葉綠素、β?胡蘿卜素等［4］。螺旋藻多糖（spirulina platensis polysaccharides，SPP）作為螺旋藻重要的生物活性物質(zhì)之一，具有降血壓、降血脂、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等多種功效［5?7］。曾波航等［8?9］研究發(fā)現(xiàn)，鈍頂螺旋藻多糖能夠提高白血病患者自然殺傷（NK）細(xì)胞的活性，但不影響正常人NK細(xì)胞的活性；同時(shí)發(fā)現(xiàn)鈍頂螺旋藻多糖能夠增強(qiáng)白血病患者淋巴因子激活的殺傷（LAK）細(xì)胞的活性，進(jìn)而減少白細(xì)胞介素（interleukin，IL）?2的用量。曲顯俊等［10］研究發(fā)現(xiàn) SPP 對白血病細(xì)胞 K562 具有殺傷作用。Flores Hernandez 等［11］亦發(fā)現(xiàn)螺旋藻提取物對急性粒細(xì)胞白血病Kasumin?1細(xì)胞和慢性髓細(xì)胞性白血病K562 細(xì)胞具有殺傷作用。然而，SPP對白血病細(xì)胞殺傷作用的機(jī)制尚未明確，且相關(guān)研究罕見。本研究旨在探討SPP對人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat的殺傷作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種與細(xì)胞系 藻種：鄂爾多斯鈍頂螺旋藻藻粉，購自內(nèi)蒙古蒙加力螺旋藻業(yè)有限責(zé)任公司。細(xì)胞系：人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑與儀器 MTT、十二烷基硫酸鈉（SDS）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，雙抗（青霉素/鏈霉素）購自碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF 膜購自Roche 公司，牛血清白蛋白（BSA）購自 Sigma 公司，caspase?3 抗體、CD45 抗體、CD71 抗體、Phospho?p44/p42 MAPK（p?ERK）抗體、MAPK（Thr202/Tyr204，t?ERK）抗體、Phospho?SAPK/JNK（p?JNK）抗體以及SAPK（Thr183/Tyr185，t?JNK）抗體、β?actin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗均購自Cell Signaling Technology，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。EPOCH 酶標(biāo)儀購自北京伯騰儀器有限公司，BG?verMINI 垂直電泳儀購自北京百晶生物技術(shù)公司，IC1000細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自上海睿鈺生物科技有限公司，CCL?170B?8 二氧化碳培養(yǎng)箱與 ACB?4E1?CN 超凈工作臺均購自美國ESCO 公司，SX?500 全自動高壓滅菌鍋購自TOMY 公司，F(xiàn)D?1A?50+冷凍干燥劑購自北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，5418R高速冷凍離心機(jī)購自美國Eppendorf公司，GelView 6000 plus智能圖像工作站購自廣州博鷺騰生物科技有限公司，Revolve FL 正置倒置一體熒光顯微鏡購自美國Echo Laboratories。

1.2 方法

1.2.1 SPP制備 SPP的制備方法參照杜玲［12］研究。取500 g螺旋藻藻粉，反復(fù)凍融法破壁，乙醇脫脂后，按照1∶20料液比于80 ℃條件下煮提8 h。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮多糖提取液，經(jīng)三氯乙酸除蛋白,無水乙醇沉淀后，減壓凍干得到SPP。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 利用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（含有10%青霉素/鏈霉素雙抗）復(fù)蘇Jurkat細(xì)胞，置于37 ℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞傳至2代以上，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組和1 g/L、2 g/L、5 g/L SPP 組，對照組不進(jìn)行SPP處理，SPP組分別加入1 g/L、2 g/L和5 g/L SPP溶液進(jìn)行處理。

1.2.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)生長期Jurkat 細(xì)胞，以5×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，每孔加入500 μL細(xì)胞，37 ℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。然后每孔加入20 μL MTT（5 g/L），繼續(xù)孵育 4 h。最后每孔加入 100 μL 20%SDS溶解甲臜過夜，利用酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（%）=（A對照組?A實(shí)驗(yàn)組）/A對照組×100%。

1.2.4 Western blot 法檢測 caspase?3 蛋白及 MAPK 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期Jurkat 細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL的密度接種于12孔板中，每孔加入500 μL細(xì)胞，以及500 μL不同劑量的SPP 溶液（1、2 和5 g/L），對照組加入相同體積的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37 ℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h后，以1 500×g離心5 min，得到每組細(xì)胞沉淀，利用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，通過Bradford 法進(jìn)行蛋白定量。取10 μg 蛋白進(jìn)行SDS?PAGE，通過濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，準(zhǔn)備進(jìn)行一抗和二抗孵育。將封閉后的PVDF 膜經(jīng)caspase?3、CD71、CD45、p?ERK、p?JNK、t?ERK 及 t?JNK 抗體（均以 1∶1 000稀釋）室溫條件孵育1 h，經(jīng)PBST洗3次后，利用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗或山羊抗小鼠IgG二抗（1∶1 000稀釋）繼續(xù)孵育1 h。最后進(jìn)行ECL 顯色，通過智能圖像工作站GelView 6000 plus 進(jìn)行成像，采用Image J 1.52a 軟件對Western blot條帶進(jìn)行灰度分析并進(jìn)行定量，檢測多糖處理前后各種分子的表達(dá)量變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnet-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPP 抑制 Jurkat 細(xì)胞增殖 1 g/L SPP 組、2 g/L SPP 組和5 g/L SPP 組細(xì)胞增殖抑制率分別為53.286%±3.112%、80.075%±4.240% 和 86.430%±4.614%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10 518.812，P＜0.05）。與對照組比較，SPP 顯著抑制Jurkat 細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。

2.2 SPP 誘導(dǎo) Jurkat 細(xì)胞凋亡 2 g/L、5 g/L SPP 組cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)水平高于對照組，5 g/L SPP 組高于 1 g/L SPP 組（P＜0.05），1 g/L SPP 組cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)水平與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1、表1。

Fig.1 The effect of SPP on Jurkat cell apoptosis圖1 SPP對Jurkat細(xì)胞凋亡水平的影響

Tab.1 Comprision of protein expression levels of cleaved caspase-3,CD45,CD71,p-ERK,t-ERK,p-JNK and t-JNK between the four groups表1 4組cleaved caspase-3、CD45、CD71、p-ERK、t-ERK、p-JNK和t-JNK蛋白相對表達(dá)水平比較

2.3 SPP 影響 CD45 和 CD71 表達(dá) 1 g/L、2 g/L SPP組CD45 蛋白表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05），CD71蛋白表達(dá)水平與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；5 g/L SPP 組CD45 蛋白表達(dá)水平均高于對照組、1 g/L 和2 g/L SPP 組，CD71 蛋白表達(dá)水平低于對照組（P＜0.05），與1 g/L和2 g/L SPP 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2、表1。

2.4 SPP 影響ERK 磷酸化水平 對照組、1 g/L SPP組、2 g/L SPP組和5 g/L SPP組p?ERK蛋白表達(dá)水平依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組間t?ERK、p?JNK和t?JNK蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3、表1。

3 結(jié)論

Fig.2 The effect of SPP on cell surface receptors of Jurkat cells圖2 SPP對Jurkat細(xì)胞膜受體表達(dá)量的影響

Fig.3 The effect of SPP on signal molecules in Jurkat cells圖3 SPP對Jurkat細(xì)胞內(nèi)部信號分子表達(dá)量的影響

白血病是我國十大高發(fā)惡性腫瘤之一，臨床上治療白血病主要以多藥物聯(lián)合化療的方式為主，但受到藥物耐受以及嚴(yán)重不良反應(yīng)等因素影響，白血病的整體預(yù)后并不理想［1?3］。多糖是一種天然高分子聚合物，具有抗腫瘤活性和不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，是潛在的新型抗腫瘤藥物［13］。目前已發(fā)現(xiàn)多種多糖對白血病細(xì)胞具有明顯的抑制作用，如枸杞多糖［14］、香菇多糖［15］、肉蓯蓉多糖［16］、姬松茸多糖［17］、杏鮑菇多糖［18］。SPP 是螺旋藻的重要活性成分之一，近年來研究表明，SPP對白血病細(xì)胞具有一定的殺傷作用，但具體作用機(jī)制尚未明確［8?11］。本文首先通過MTT法研究不同劑量SPP對人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPP能夠顯著抑制Jurkat細(xì)胞增殖，并推測利用較高劑量SPP處理Jurkat細(xì)胞時(shí)，可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞凋亡，又稱細(xì)胞程序性死亡，是由基因控制的細(xì)胞程序性死亡過程［19］。細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持動態(tài)平衡的關(guān)鍵因素之一，腫瘤細(xì)胞往往是由于細(xì)胞凋亡機(jī)制失衡而導(dǎo)致的不斷增殖、逃離凋亡的過程。因此，特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前臨床腫瘤治療的熱門研究領(lǐng)域［20］。為了進(jìn)一步證實(shí)SPP能否誘導(dǎo)Jurkat 細(xì)胞凋亡，本研究采用Western blot 法檢測 SPP 是否誘導(dǎo) caspase?3 活化。Caspase?3 是細(xì)胞凋亡通路的關(guān)鍵分子之一，正常以酶原（pro?casp?3，分子質(zhì)量32 ku）形式存在，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡后，會激活caspase?3 水解為 cleaved caspase?3（分子質(zhì)量為17 ku和19 ku），最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21］。本研究結(jié)果顯示，SPP在低劑量下主要抑制細(xì)胞增殖，而高劑量下能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。林祥偉等［17］研究姬松茸多糖對白血病細(xì)胞K562 增殖、凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)低劑量（2 g/L）姬松茸多糖處理細(xì)胞48 h后能夠抑制細(xì)胞增殖，而高劑量（10 g/L）多糖能夠顯著誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，與本研究結(jié)果一致，說明不同劑量多糖對細(xì)胞的影響有所不同，可能是由于不同劑量的多糖作用細(xì)胞膜表面的受體數(shù)量、作用方式等不同導(dǎo)致的。

SPP 屬于生物活性多糖大分子，不能夠自由通過細(xì)胞膜，主要通過影響Jurkat 細(xì)胞膜表面受體的表達(dá)和分布，進(jìn)而將凋亡信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部［22］。CD45 是T 細(xì)胞膜表面重要受體之一，參與T 細(xì)胞發(fā)育、分化、活化以及凋亡等多個(gè)過程［23?24］。Xue等［25］研究發(fā)現(xiàn)CD45是腫瘤相關(guān)因子galectin?3誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡過程的關(guān)鍵凋亡受體，沉默CD45基因可顯著降低galectin?3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平。CD71與白血病細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)，已經(jīng)成為腫瘤靶向治療的潛在靶點(diǎn)之一［26?27］。本研究中5 g/L SPP誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的同時(shí)，顯著促進(jìn)CD45表達(dá)，并且抑制CD71的表達(dá)水平，提示CD45 和CD71 可能是SPP 誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的受體之一。

多糖的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，不同種類多糖由于結(jié)構(gòu)差異，結(jié)合細(xì)胞膜表面受體種類及數(shù)量各異，因此不同多糖對于細(xì)胞生長和凋亡的作用及機(jī)制不盡相同［13］。馬莉等［15］研究發(fā)現(xiàn)香菇多糖通過抑制PI3K/AKT信號分子，最終活化caspase?3誘導(dǎo)白血病HL?60 細(xì)胞凋亡。張濤等［16］研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉多糖通過引起白血病K562 細(xì)胞周期阻滯而達(dá)到抑制細(xì)胞生長、增殖的目的，但并未發(fā)現(xiàn)該多糖能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡。朱紅等［28］研究顯示硒酸軟骨素多糖通過降低細(xì)胞線粒體膜電位最終激活caspase?9，誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。ERK、JNK與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程密切相關(guān)，是細(xì)胞內(nèi)的重要信號分子［29?31］。本研究發(fā)現(xiàn)各劑量SPP 均能夠顯著誘導(dǎo)ERK 磷酸化，由于低劑量（1 g/L 和2 g/L）SPP 以抑制Jurkat 細(xì)胞增殖為主，高劑量（5 g/L）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主，提示ERK磷酸化同時(shí)參與SPP抑制細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程。此外，JNK不參與SPP抑制Jurkat細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡全過程。

綜上所述，SPP能夠抑制T細(xì)胞增殖并且在高劑量（5 g/L）條件誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。高劑量SPP主要通過上調(diào)細(xì)胞膜表面受體CD45和下調(diào)CD71將凋亡信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，通過活化ERK，最終激活caspase?3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。