脈沖射頻對(duì)髓核組織中磷脂酶A2 活性的影響*

劉 炎 劉 娜 宋永光 宮小文 吳大勝

（吉林省人民醫(yī)院疼痛科，長(zhǎng)春130021）

椎間盤(pán)源性腰痛是在腰椎退變基礎(chǔ)上椎間盤(pán)內(nèi)疼痛感受器受炎癥刺激所引起的腰痛[1]。近年來(lái)，脈沖射頻治療椎間盤(pán)源性腰痛取得了良好的臨床療效[2,3]。但脈沖射頻在治療腰椎間盤(pán)源性腰痛時(shí)取得療效的相關(guān)機(jī)制目前尚未完全清楚。本研究采用成年比格犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將其制作成腰椎退變動(dòng)物模型，以此作為反映局部組織中炎癥程度高低的指標(biāo)，測(cè)量脈沖射頻治療前后椎間盤(pán)髓核組織中PLA2(phospholipase A2) 的活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，確定其對(duì)動(dòng)物腰椎退變模型椎間盤(pán)髓核組織中PLA2活性的影響，旨在為臨床上脈沖射頻治療椎間盤(pán)源性腰痛提供確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查和審批，并嚴(yán)格遵守國(guó)家衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和管理的相關(guān)指南。選取1～2 歲健康成年比格犬20 只（吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重16.5～21.3 kg，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組10 只。

2.方法

（1）動(dòng)物模型的制作：參考彭俊等[4]研究造模方法，用2% (1 ml/kg) 戊巴比妥靜脈注射麻醉兩組實(shí)驗(yàn)犬。麻醉成功后取俯臥位，固定四肢，消毒鋪巾，在L5-6平面從棘突中線(xiàn)向右旁開(kāi)12 cm 為入針點(diǎn)，用穿刺針 (16G) 在C 形臂X 線(xiàn)機(jī)透視引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺L5-6椎間盤(pán)，深度控制在透視下正側(cè)位均提示穿過(guò)對(duì)側(cè)纖維環(huán)，時(shí)間持續(xù)60 s。分別于造模前1 天、造模后7 天用戊巴比妥靜脈麻醉后，取俯臥位，行腰椎MRI 檢查（GE 公司磁共振掃描儀1.5T）。

（2）動(dòng)物脈沖射頻調(diào)節(jié)術(shù)：動(dòng)物模型制作成功3 個(gè)月后，A 組實(shí)驗(yàn)犬行L5-6間盤(pán)脈沖射頻調(diào)節(jié)術(shù)。C 形臂X 線(xiàn)機(jī)下定位L5-6椎間盤(pán)位置，克氏針定位在L5-6上關(guān)節(jié)突外側(cè)緣為穿刺點(diǎn)。采用后外側(cè)徑路將射頻治療套管針穿刺進(jìn)入椎間盤(pán)，確認(rèn)穿刺針尖的位置于椎間盤(pán)的中心或中后l/3 交界處。確認(rèn)針尖位置無(wú)誤后，退出針芯，連接射頻電極（型號(hào)PMKl8-145，加拿大Baylis 公司）及疼痛治療發(fā)生器（型號(hào)PMG-230，加拿大Baylis 公司）。設(shè)定疼痛治療發(fā)生器的治療模式為自動(dòng)脈沖模式，進(jìn)行42℃、2 Hz、600 s 的標(biāo)準(zhǔn)脈沖射頻治療2 次。B 組實(shí)驗(yàn)犬行L5-6椎間盤(pán)穿刺，但不進(jìn)行脈沖射頻調(diào)節(jié)術(shù)。

（3）椎間盤(pán)髓核組織采集和PLA2活性測(cè)定：兩組于造模前、術(shù)前2 天及術(shù)后7、14、28 天采用空氣栓塞法分別處死2 只動(dòng)物，取出動(dòng)物的L5-6椎間盤(pán)髓核組織，放入干燥、消毒容器內(nèi)，-70℃ 保存。采用微量酸滴定法[6]測(cè)定兩組椎間盤(pán)髓核組織中PLA2的活性。椎間盤(pán)組織剪碎稱(chēng)重，每克組織加PLA2稀釋液4 ml，加入冰凍組織勻漿機(jī)中，以4000 rpm 速度勻漿5 min 至細(xì)胞完全破碎為止。取上清液4℃下保存。樣本與底物緩沖液在60℃水浴30 min，4℃下保存?zhèn)溆?。?duì)照管中各加入底物緩沖液8 ml，15 mmol/L EDTA 1.1 ml，樣本0.4 ml，0.5%氯化鈣0.2 ml。測(cè)定管中各加入底物緩沖液8 ml，0.5%氯化鈣0.2 ml，樣本0.4 ml，15 mmol/L EDTA 1.1 ml。用高靈敏度pH 計(jì)分別測(cè)定兩管的pH 值，用新標(biāo)定的稀鹽酸(0.005 mol/L)將對(duì)照管的pH 值滴定到測(cè)試管的pH 值，以所消耗的鹽酸量計(jì)算測(cè)定管中酶的活力。PLA2活性 = N×V×108×2.5 ÷t（V、N 分別為所消耗的鹽酸體積與濃度，t為反應(yīng)時(shí)間）。

3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1. MRI 檢查椎間盤(pán)退變情況

經(jīng)皮椎間盤(pán)穿刺造模后7 天 L5-6椎間盤(pán)髓核MRI 圖像對(duì)比見(jiàn)圖1。

2. 兩組椎間盤(pán)組織不同時(shí)間點(diǎn)PLA2 活性測(cè)定比較

造模前實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組椎間盤(pán)髓核組織中PLA2活性分別為13.38±0.43 nmol/(min·mg)和13.57±0.78 nmol/(min·mg)，術(shù)前2 天實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組椎間盤(pán)髓核組織中PLA2的活性分別為81.73±0.17 nmol/(min·mg)和86.25±1.05 nmol/(min·mg)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)前2天椎間盤(pán)髓核組織中PLA2的活性均顯著高于兩組造模前椎間盤(pán)髓核組織 (P＜ 0.05)。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7、14及28 天PLA2活性值分別為23.61±1.06 nmol/(min·mg)、21.72±0.38 nmol/(min·mg)和27.33±1.03 nmol/(min·mg)，對(duì) 照 組 術(shù) 后7、14 及28 天PLA2活 性 值 分 別 為91.37±2.06 nmol/(min·mg)、86.57±0.87nmol/(min·mg)和89.39±1.17 nmol/(min·mg)。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7、14、28天椎間盤(pán)髓核組織中PLA2的活性明顯低于術(shù)前2 天椎間盤(pán)髓核組織 (P＜ 0.05)；對(duì)照組術(shù)后7、14、28天椎間盤(pán)髓核組織中PLA2的活性較術(shù)前2 天椎間盤(pán)髓核組織無(wú)顯著性差異 (P＞ 0.05)；實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7、14、28 天椎間盤(pán)髓核組織中PLA2的活性明顯低于對(duì)照組椎間盤(pán)髓核組織（P＜ 0.05，見(jiàn)表1）。

圖1 經(jīng)皮椎間盤(pán)穿刺造模前后L5-6 椎間盤(pán)MRI 圖像對(duì)比

術(shù)前實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組PLA2的活性無(wú)顯著性差異 (P＞ 0.05)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組7、14、28 天PLA2的活性無(wú)顯著性差異 (P＞ 0.05)。造模后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組椎間盤(pán)髓核組織中PLA2的活性顯著高于造模前椎間盤(pán)髓核組織 (P＜ 0.05)，術(shù)后實(shí)驗(yàn)組7、14、28 天椎間盤(pán)髓核組織中PLA2的活性明顯低于對(duì)照組 (P＜ 0.05)。

討 論

腰椎間盤(pán)退行性變發(fā)生后，與免疫系統(tǒng)相隔絕的髓核組織通過(guò)破裂的纖維環(huán)漏出產(chǎn)生化學(xué)炎癥反應(yīng)，刺激神經(jīng)末梢處于超敏狀態(tài)可產(chǎn)生椎間盤(pán)源性腰痛[5,6]。Lam 等[7]發(fā)現(xiàn)在退變椎間盤(pán)的髓核中多種炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 及PLA2活性異常升高，這些促炎癥介質(zhì)接觸纖維環(huán)外1/3 部分神經(jīng)末稍，是腰痛產(chǎn)生的重要原因。其中的PLA2是局部組織炎癥啟動(dòng)物質(zhì)，能引起強(qiáng)烈致炎和致痛[8]。因此，滅活這些炎癥介質(zhì)和調(diào)節(jié)神經(jīng)末梢是治療椎間盤(pán)源性腰痛的根本。

近年來(lái)，脈沖射頻技術(shù)以其微創(chuàng)、安全、無(wú)不良反應(yīng)及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)已成為理想的椎間盤(pán)源性腰痛治療手段。Sluijter 等[9]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥介質(zhì)在脈沖射頻電場(chǎng)的作用下明顯減少，但脈沖射頻能否抑制退變椎間盤(pán)髓核中重要的疼痛因子PLA2活性尚無(wú)報(bào)道，本研究將PLA2作為主要檢測(cè)指標(biāo)也是基于以上原理。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后實(shí)驗(yàn)組7、14、28 天椎間盤(pán)髓核組織中PLA2的活性明顯低于術(shù)前，術(shù)后實(shí)驗(yàn)組7、14、28 天椎間盤(pán)髓核組織中PLA2的活性明顯低于對(duì)照組。

葉君健等[8]通過(guò)采集腰椎間盤(pán)突出癥病人術(shù)中標(biāo)本進(jìn)行冰凍切片，應(yīng)用SP 法行免疫組織化學(xué)檢測(cè)PLA2在髓核組織中的表達(dá)，指出PLA2在腰椎間盤(pán)突出癥誘發(fā)腰腿痛中發(fā)揮著重要的病理作用，且其表達(dá)與退變髓核可能存在一定關(guān)系。張文煜等[10]采用微量酸滴定法研究發(fā)現(xiàn)腰椎間盤(pán)突出癥病人髓核組織中的PLA2活性顯著高于正常腰椎間盤(pán)髓核組織，得出PLA2化學(xué)性炎癥機(jī)制在腰椎間盤(pán)突出癥根性疼痛中發(fā)揮著可能比機(jī)械壓迫更重要的作用的結(jié)論。腰椎間盤(pán)突出癥是在腰椎退行性變基礎(chǔ)上發(fā)病的，所以腰椎間盤(pán)突出癥髓核組織中PLA2活性的變化對(duì)本研究具有一定的參考價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前2 天實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組椎間盤(pán)髓核組織中PLA2的活性顯著高于造模前椎間盤(pán)髓核組織，證實(shí)腰椎間盤(pán)退變后髓核組織中PLA2表達(dá)量明顯增高，這一結(jié)果與葉君健等[8]及張文煜等[10]的研究基本一致。

表1 兩組椎間盤(pán)髓核組織不同時(shí)間點(diǎn)PLA2 活性測(cè)定比較[nmol/(min·mg),±SD]

表1 兩組椎間盤(pán)髓核組織不同時(shí)間點(diǎn)PLA2 活性測(cè)定比較[nmol/(min·mg),±SD]

#P ＜ 0.05，與造模前相比；bP ＜ 0.05，與術(shù)前2 天相比； aP ＞ 0.05，與術(shù)前2 天相比；*P ＜ 0.05，與對(duì)照組相比

組別 造模前 術(shù)前2 天 術(shù)后7 天 術(shù)后14 天 術(shù)后28 天實(shí)驗(yàn)組(n = 10) 13.38±0.43 81.73±0.17# 23.61±1.06b* 21.72±0.38b* 27.33±1.03b*對(duì)照組(n = 10) 13.57±0.78 86.25±1.05# 91.37±2.06a 86.57±0.87a 89.39±1.17a

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型嚴(yán)格遵照彭俊等[4]在X 線(xiàn)透視下經(jīng)皮穿刺比格犬腰椎間隙建立腰椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型方法，具備簡(jiǎn)單有效、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。證實(shí)脈沖射頻能夠顯著抑制犬腰椎退變模型椎間盤(pán)髓核組織中PLA2的活性。為疼痛科臨床上治療椎間盤(pán)源性腰痛提供確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而本研究存在觀察指標(biāo)有限，且因缺少腰椎退變模型動(dòng)物行為學(xué)方面檢查經(jīng)驗(yàn)參考，還需繼續(xù)拓展思維、進(jìn)一步深入研究。