初級(jí)感覺神經(jīng)元STING 通過IFN-I 信號(hào)通路控制傷害性感受

傷害性感受在進(jìn)化上高度保守，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為外周傷害性感受器僅是危險(xiǎn)刺激的簡(jiǎn)單傳感器，但現(xiàn)在觀點(diǎn)則認(rèn)為它同時(shí)也是炎癥和免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。傷害性感受器能直接被損傷/病原相關(guān)分子模式(DAMPs/PAMPs)激活，從而引起疼痛、瘙癢或鎮(zhèn)痛。背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元深度測(cè)序的結(jié)果表明：大量本來在免疫細(xì)胞中表達(dá)的宿主防御相關(guān)DAMP或PAMP 受體在傷害性感受器上也有表達(dá)。STING是IFN 基因的刺激因子，也被稱為TMEM173，是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的DNA 傳感器。杜克大學(xué)紀(jì)如榮教授團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，STING 在傷害性感受器中高度表達(dá)，由于多種調(diào)節(jié)因子均通過STING 發(fā)揮功能，本文作者推測(cè)STING 可能參與調(diào)控傷害性感受。

一、STING 的激動(dòng)劑抑制傷害性感受

為了驗(yàn)證STING 是否調(diào)節(jié)傷害性感受，本文作者向正常小鼠鞘內(nèi)注射合成的 (DMXAA 和ADU-S100) 或天然的STING 激動(dòng)劑 (2', 3'-cGAMP 和3', 3'-cGAMP)。結(jié)果顯示激活STING 引起劑量依賴的鎮(zhèn)痛作用和機(jī)械感受閾值的增加，藥效長(zhǎng)達(dá)48 小時(shí)，而全身給藥使小鼠的后爪回縮閾值增加，藥效持續(xù)24 小時(shí)。在紫杉醇引起的化療痛模型中，發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)或全身給藥均能逆轉(zhuǎn)模型小鼠機(jī)械或冷異痛敏，另外神經(jīng)病理性疼痛也被緩解。骨癌痛是一種嚴(yán)重的、尚不能被有效控制的疼痛，鞘內(nèi)注射STING 激動(dòng)劑能快速抑制癌癥引起的機(jī)械和冷異痛敏，且不改變局部的腫瘤負(fù)荷。接下來進(jìn)行了條件性位置偏愛 (CPP) 實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)STING激動(dòng)劑在持續(xù)性疼痛中的作用，結(jié)果顯示STING 激動(dòng)劑不像阿片類物質(zhì)一樣激活大腦成癮及獎(jiǎng)賞系統(tǒng)，但能引起顯著的位置偏好，同時(shí)阿片類受體拮抗劑納洛酮對(duì)DMXAA 和ADU-S100 的鎮(zhèn)痛作用沒有影響。此外，在正常和坐骨神經(jīng)分支損傷 (SNI) 模型小鼠中反復(fù)鞘內(nèi)注射DMXAA 可以減輕SNI 引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，卻不會(huì)引起耐受。

二、STING 調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)傷害性感受

本文作者分析了STING 全敲小鼠的疼痛敏感性，發(fā)現(xiàn)全敲小鼠對(duì)機(jī)械和冷刺激的敏感性增加。利用0.04 g 的纖維絲刺激進(jìn)行條件性位置厭惡(CPA) 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示僅在敲除鼠中會(huì)引起位置厭惡，而野生型卻沒有。膜片鉗記錄顯示 STING 敲除的DRG 神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢辉黾忧一鶑?qiáng)度降低，說明STING 缺失導(dǎo)致DRG 神經(jīng)元興奮性增加。此外，在傷害性感受器中特異性敲除STING 的小鼠（Sting1fl/fl; Nav1.8-Cre 小鼠）具有同樣表型，表明是感覺神經(jīng)元中STING 缺失引起的。此外，在野生型正常小鼠中注射STING 抑制劑，也會(huì)引起短暫的劑量依賴性的痛敏反應(yīng)。STING 全敲小鼠中，STING 激動(dòng)劑不會(huì)引起鎮(zhèn)痛作用，而在條件性敲除鼠中注射后期能緩解機(jī)械痛敏。這表明STING 陽性神經(jīng)元是鎮(zhèn)痛作用起始階段必須的，而長(zhǎng)時(shí)程的鎮(zhèn)痛作用需要其他細(xì)胞類型的參與。用樹膠毒素 (RTX)消融TRPV1+傷害感受器，STING 激動(dòng)劑注射后期具有明顯鎮(zhèn)痛效果。另外，在免疫缺陷的Prkdcscid小鼠中注射STING 激動(dòng)劑，結(jié)果顯示也具有一定的鎮(zhèn)痛效果。因此感覺神經(jīng)元固有的STING 信號(hào)能夠在內(nèi)穩(wěn)態(tài)中穩(wěn)定地調(diào)節(jié)傷害性感受，但是在其他細(xì)胞類型中，STING 信號(hào)可能參與持續(xù)鎮(zhèn)痛。

三、STING 通過IFN-I 信號(hào)調(diào)節(jié)傷害性感受

激活STING 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子及趨化因子的產(chǎn)生，包括IFN-I 家族的成員IFN-α 和IFN-β。利用STING 激動(dòng)劑治療會(huì)導(dǎo)致血清或DRG 組織中IFN-α和IFN-β 的增加，而在STINGgt/gt小鼠中則無該現(xiàn)象。另外，培養(yǎng)的野生型小鼠的DRG 神經(jīng)元，ADUS100 也能誘導(dǎo)培養(yǎng)基中IFN-α 和IFN-β 增加。接下來，本文作者利用Ifnb1YFP/YFP報(bào)告基因小鼠，驗(yàn)證了DRG 內(nèi)響應(yīng)STING 激動(dòng)劑而產(chǎn)生IFN-I 的細(xì)胞類型。與STING 缺失小鼠類似，Ifnar1-/-小鼠及在感覺神經(jīng)元中特異性缺少Ifnar1的小鼠，都表現(xiàn)出對(duì)機(jī)械和冷刺激的痛敏反應(yīng)，而0.04 g 纖維絲重復(fù)刺激，也能在Ifnar1-/-小鼠中誘導(dǎo)條件位置厭惡，膜片鉗記錄也顯示其動(dòng)作電位發(fā)放頻率增加且基強(qiáng)度降低。在正常小鼠中注射IFN-α 或IFN-β 中和抗體，也會(huì)產(chǎn)生Ifnar1-/-和Ifnar1fl/fl; Nav1.8-Cre 小鼠一致的痛敏現(xiàn)象。正常小鼠鞘內(nèi)注射IFNAR1 信號(hào)受體TYK2 的藥理學(xué)抑制劑，產(chǎn)生劑量依賴的痛敏反應(yīng)。同樣在DRG 中檢測(cè)了IFN-I 的水平及功能， IFN-β 抗體孵育的DRG 神經(jīng)元其動(dòng)作電位增強(qiáng)，從而進(jìn)一步證明在DRG 中IFN-I 信號(hào)能夠調(diào)節(jié)生理性傷害性感受。

值得注意的是，在Ifnar1fl/fl; Nav1.8-Cre 小鼠中，STING 激動(dòng)劑的鎮(zhèn)痛作用全部消失。ADU-S100 僅能誘導(dǎo)野生型小鼠的DRG 神經(jīng)元中IFN-α 及IFN-β表達(dá)量增加，但在敲除鼠中該現(xiàn)象消失。為了驗(yàn)證鞘內(nèi)注射IFN-Is 的鎮(zhèn)痛作用，在正常小鼠中注射重組的IFN-α 和IFN-β 以及IFN-I，結(jié)果顯示這三類干擾素均能夠產(chǎn)生短暫的、劑量依賴的鎮(zhèn)痛作用。一項(xiàng)最近研究表明，腹腔注射高濃度的IFN-α 及IFN-β能夠引起機(jī)械痛覺過敏。研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射300 U的IFN-α 在Ifnar1+/+以及Ifnar1-/-小鼠中導(dǎo)致長(zhǎng)達(dá)3天的急性機(jī)械痛敏，而鞘內(nèi)注射IFN-α 則能夠阻斷這種痛敏反應(yīng)，表明激活DRG 或者脊髓中IFN-I 信號(hào)通路對(duì)于IFNAR 介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用是必須的。

接下來，檢測(cè)了STING 或IFN-I 信號(hào)通路在脊髓背角不同類型的細(xì)胞中的作用。首先，檢測(cè)接受C 型纖維傳入的外二層投射神經(jīng)元mEPSCs 的頻率和幅度，發(fā)現(xiàn)與同窩對(duì)照相比，Ifnar1-/-小鼠的mEPSC 頻率和幅度均增加，而Ifnar1fl/fl; Nav1.8-Cre小鼠則無顯著性差異。STING 在脊髓背角主要定位于IBA1+小膠質(zhì)細(xì)胞中，STING 激動(dòng)劑能夠增加野生型小鼠脊髓背角中IFN-α 的含量，而在STINGgt/gt小鼠中則無該現(xiàn)象。用ADU-S100 孵育脊髓切片后，脊髓背角IIo 層神經(jīng)元 sEPSCs 的頻率和幅度都降低，表明STING 激動(dòng)劑能夠減弱脊髓內(nèi)的突觸傳遞。另外，rIFN-I 的急性灌注也會(huì)降低野生型小鼠脊髓切片中mEPSCs 的頻率和幅度，而在Ifnar1-/-小鼠中不引起該現(xiàn)象。因此，脊髓中STING 介導(dǎo)的IFN-I信號(hào)傳導(dǎo)也具有減弱傷害性神經(jīng)傳遞的作用。

由于缺乏STING 的小鼠在DRG 及脊髓背角組織中IFN-α 及IFN-β 的基礎(chǔ)水平較低，本文作者檢測(cè)了IFN-I 配體是否使STINGgt/gt小鼠的痛敏有所恢復(fù)，結(jié)果顯示鞘內(nèi)注射IFN-α 及IFN-β 使其機(jī)械痛敏反應(yīng)短暫恢復(fù)。由于STING 能被雙鏈DNA(dsDNA) 激活，其主要通過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的DNA 傳感器cGAS 產(chǎn)生2', 3'-cGAMP 來響應(yīng)dsDNA 的刺激，因此推測(cè)細(xì)胞內(nèi)部的dsDNA 也能通過激活cGASSTING 途徑產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。此外， DNA 傳感器也是RNA 傳感器（如RIG-I）都有誘導(dǎo)IFN-I 的特征，因此同樣推測(cè)細(xì)胞內(nèi)的RNA 可能通過非STING 依賴，但依賴于RIG-I 及IFN-I 的機(jī)制而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。進(jìn)一步，本文作者在Ifnar1+/+,Ifnar1fl/fl; Nav1.8-Cre,STINGgt/gt,Cgas-/-或RIG-I-/-（RIG-I 由Ddx58 基 因編輯）正常小鼠中，通過鞘內(nèi)注射激活了細(xì)胞內(nèi)的dsDNA 和dsRNA，發(fā)現(xiàn)只有dsDNA 依賴的鎮(zhèn)痛作用需要cGAS-STING 途徑。

為了解IFN 鎮(zhèn)痛機(jī)理，本文作者對(duì)DRG 神經(jīng)元進(jìn)行了膜片鉗記錄，rIFN-I 急性灌注抑制了動(dòng)作電位的發(fā)放頻率，并且使其基強(qiáng)度增加，但在Ifnar1-/-小鼠中該現(xiàn)象消失?？紤]到鈉通道對(duì)于產(chǎn)生動(dòng)作電位以及生理和病理性疼痛至關(guān)重要，本研究認(rèn)為IFN-I 引起的鎮(zhèn)痛效果是由于其調(diào)節(jié)鈉電流引起的。值得注意的是，IFN-I 灌注導(dǎo)致的鈉電流顯著降低及基強(qiáng)度增強(qiáng)現(xiàn)象在Ifnar1-/-小鼠中缺失。為了驗(yàn)證rIFN-I 是否可以調(diào)節(jié)生理和病理性傷害性感受的關(guān)鍵鈉通道Nav1.7 的活性，本文作者記錄了在rIFN-I 急性灌注后Nav1.7 的HEK-293 穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞的鈉電流，這導(dǎo)致Nav1.7 電流減少約20%。同樣也記錄了離體的DRG神經(jīng)元中的鈣電流，觀察到rIFN-I 灌注后鈣電流顯著降低，而在Ifnar1-/-小鼠中，其基礎(chǔ)鈣電流無變化，因此IFN-I 信號(hào)途徑可能通過多方面抑制鈉通道和鈣通道的活性來對(duì)傷害性感受器的興奮性產(chǎn)生直接抑制。

四、STING 激動(dòng)劑能夠?qū)镒赢a(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用

為了驗(yàn)證研究結(jié)果的轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛力，本文作者在非人類靈長(zhǎng)類中檢測(cè)激活STING 是否能夠抑制傷害性感受，在恒河猴中使用薄荷醇凝膠誘導(dǎo)冷異常性疼痛實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示ADU-S100 可以產(chǎn)生持久且劑量依賴性的鎮(zhèn)痛作用，并且腦脊液中IFN-β 的含量也大幅增加。引起該類效應(yīng)的劑量遠(yuǎn)低于在小鼠模型中的用量，這表明ADU-S100 對(duì)于靈長(zhǎng)類動(dòng)物以及人類STING 的選擇性更高。接下來，記錄了離體的猴DRG 神經(jīng)元的動(dòng)作電位，結(jié)果顯示rIFN-I 急性灌注強(qiáng)烈抑制了其動(dòng)作電位的發(fā)放頻率并且使其基強(qiáng)度增加。最后，測(cè)試了rIFN-I 處理是否可以改變?nèi)说腄RG 神經(jīng)元的興奮性，盡管未記錄到動(dòng)作電位，但rIFN-I 灌注能夠引起小直徑的人類DRG 神經(jīng)元超級(jí)化。這些數(shù)據(jù)表明STING 途徑的激活在猴子中誘導(dǎo)了長(zhǎng)期的鎮(zhèn)痛作用，并且IFN-I配體能夠通過調(diào)節(jié)鈉和鈣通道的功能直接抑制小鼠、猴以及人類傷害性感受器的活性。

五、討論

本研究將STING-IFN-I 信號(hào)軸確定為主要的調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)疼痛敏感性及幾種病理?xiàng)l件下慢性疼痛的傷害性感受調(diào)節(jié)因素。從進(jìn)化的角度看，因?yàn)閷?dǎo)致IFN-I 通路激活的刺激往往是痛苦的（如輻射、癌癥或感染），所以使用能激活免疫反應(yīng)STING-IFN-I 信號(hào)通路鎮(zhèn)痛是對(duì)機(jī)體的很大挑戰(zhàn)。感覺神經(jīng)元中IFN-I 途徑的激活可能是在機(jī)體受到挑戰(zhàn)時(shí)抑制疼痛的固有機(jī)制。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明STING 介導(dǎo)的IFN-I 信號(hào)途徑通過旁分泌和自分泌途徑作用于外周的感覺神經(jīng)元，通過非經(jīng)典的IFN-I-IFNAR1 信號(hào)導(dǎo)致鈉通道和鈣通道的快速抑制。與嗎啡相比，猴子鞘內(nèi)注射STING 激動(dòng)劑產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的劑量低，鎮(zhèn)痛時(shí)間長(zhǎng)，并且重復(fù)注射并不會(huì)引發(fā)耐受性，因此低濃度的STING 激動(dòng)劑在藥物治療方面也有更大的優(yōu)越性。盡管這些結(jié)果具有廣闊前景，但現(xiàn)在要考慮的是哪種慢性疼痛嚴(yán)重到機(jī)體不惜引起免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)生的不良反應(yīng)也要調(diào)動(dòng)這種鎮(zhèn)痛機(jī)制。大多數(shù)晚期癌癥病人會(huì)經(jīng)歷嚴(yán)重的疼痛，但這些病人中只有不到一半的病人表示疼痛能夠得到有效控制。在異常疼痛的骨癌痛模型中，STING 激動(dòng)劑能夠產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛作用，表明在骨癌痛條件這種鎮(zhèn)痛機(jī)制的作用值得盡早探索。臨床研究表明STING 激動(dòng)劑已成為癌癥免疫治療的輔劑，能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。本研究則提出這些依賴于STING 的功能，可以通過作用于免疫細(xì)胞以及外周的傷害性感受器來協(xié)同完成。