柔毛淫羊藿四川主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源的質(zhì)量特征研究

★蔣勇 黃華 李仁清 徐艷琴 曾金祥（.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心 南昌 330004）

藥用植物種質(zhì)資源是中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的源頭和人類健康需求的保障，也是中藥基礎(chǔ)研究及創(chuàng)新體系建設(shè)的物質(zhì)基礎(chǔ)［1-2］，已成為國(guó)家重要的生物戰(zhàn)略性資源［3］。對(duì)于藥用植物，有效成分豐富的種質(zhì)為選擇和利用的首選［3-5］。系統(tǒng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)可有效指導(dǎo)野生資源利用及人工種植種質(zhì)和生境的選擇［6］。

淫羊藿為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，逐漸步入大宗品種行列，在中藥產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，為最具開(kāi)發(fā)潛力和重點(diǎn)研究的藥物之一［7-8］。優(yōu)質(zhì)與充足的淫羊藿資源是相關(guān)醫(yī)藥產(chǎn)品健康可持續(xù)發(fā)展的重要保障與支撐［9］。為保證藥品安全有效和穩(wěn)定可控，藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)成為淫羊藿眾多研究方向中的重點(diǎn)和熱點(diǎn)［10-13］。開(kāi)發(fā)淫羊藿，尤其是藥典收錄種的優(yōu)異種質(zhì)篩選成為迫在眉睫的問(wèn)題。對(duì)保障資源供應(yīng)，促進(jìn)資源合理開(kāi)發(fā)和利用具有重要意義。

柔毛淫羊藿（Epimedium pubescensMaxim.）歷來(lái)為藥典收錄種，是淫羊藿屬分布較廣的物種，盡管陜西省南部、甘肅省東南部和重慶市有少量分布，但主產(chǎn)區(qū)為四川?。?4-16］。柔毛淫羊藿為淫羊藿藥材七大主流品種之一［17］，市場(chǎng)占有量達(dá)到39%［14］，其質(zhì)量一直備受關(guān)注。但不同研究差異較大，樣本合格率從完全不達(dá)標(biāo)0.0 %［18］到46.2 %［19］、52.2 %［20］、57.1 %［21］、66.7 %［12］、68.4 %［22］、83.3 %［23］和85.7 %［24］不等。分析其原因，由于不同研究所采用樣品來(lái)源不同［19-24］，或者為藥店購(gòu)買的樣本［12,18］，采收期信息不詳，而不同采收期淫羊藿含量變化差異大［25］。因此，研究結(jié)果易出現(xiàn)時(shí)高時(shí)低情況，缺乏可比性。推薦淫羊藿質(zhì)量評(píng)價(jià)研究選擇易判斷和易統(tǒng)一的采收期，即花期。此外，以往研究?jī)H憑少數(shù)的樣本對(duì)淫羊藿含量檢測(cè)是不夠的全面的，因?yàn)橐蜣轿镂锓N內(nèi)會(huì)存在含量差異。綜合各方面因素考慮，既要保證有代表性，又要使樣本數(shù)量可操作范圍內(nèi)，建議參考居群遺傳學(xué)的取樣策略［25］。

優(yōu)異種質(zhì)篩選和利用需以系統(tǒng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)為基礎(chǔ)。為剔除采收期對(duì)研究結(jié)果的影響，本研究所有樣本均采自花期。同時(shí)，為保證研究結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，嚴(yán)格按照居群取樣策略，分析樣本覆蓋柔毛淫羊藿四川主產(chǎn)區(qū)。采用高效液相色譜法，測(cè)定其葉片中4種主要活性成分，進(jìn)行系統(tǒng)質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量特征分析，為柔毛淫羊藿優(yōu)異種質(zhì)發(fā)掘、資源合理開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent Technologies Series 1260高效液相色譜儀、Chem Station工作站（Agilent 科技公司）；CP124S 型萬(wàn)分之一電子天平（Sartoriu公司）；KQ-300DE超聲波清洗器（昆山市超聲有限公司）。

甲醇與乙腈（色譜純，美國(guó)ACS公司）；乙醇（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；對(duì)照品朝藿定A（批號(hào)120514）、朝藿定B（批號(hào)120518）、朝藿定C（批號(hào)120601）和淫羊藿苷（批號(hào)120423）購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98 %。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 柔毛淫羊藿分析樣本經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院葛菲教授鑒定為E. pubescens Maxim.。于2015年和2017年花期采自四川省主產(chǎn)區(qū)的9個(gè)代表性產(chǎn)地（表1，圖1），每居群采集20～30個(gè)個(gè)體的成年葉片材料（但SCYA和SCYX居群由于居群過(guò)小或物候期影響，僅采集到9～11份合格樣本）。

表1 柔毛淫羊藿和采樣信息

圖1 柔毛淫羊藿采樣分布圖以及ABCI含量柱狀圖

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件和方法 色譜條件和方法參照本課題組已發(fā)表論文［10］，該色譜條件下的混合對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析方法 各居群朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和淫羊藿多苷的平均含量及居群內(nèi)個(gè)體間的標(biāo)準(zhǔn)差采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。為考察主要生態(tài)因子對(duì)各成分積累的影響，各含量與經(jīng)度、緯度和海拔高度的相關(guān)性分析使用SPSS 21.0皮爾森系數(shù)法進(jìn)行雙側(cè)顯著性檢驗(yàn)。并運(yùn)用DPS 9.01軟件對(duì)4種含量與生態(tài)因子進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析。居群間差異使用MVSP 3.1軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis,PCA）和聚類分析（cluster analysis）［26］。

圖2 朝藿定A、B、C和淫羊藿苷混合對(duì)照品及柔毛淫羊藿9個(gè)居群的代表性HPLC圖

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿多苷含量分布規(guī)律 從淫羊藿多苷含量在柔毛淫羊藿各居群中的分布來(lái)看，不同成分的含量普遍存在較大差異，一般以淫羊藿苷含量最為豐富，朝藿定C含量其次（表2）。其中，SCZX、SCDY、SCBC和SCYL這4個(gè) 居 群 淫 羊藿苷的含量遠(yuǎn)較朝藿定C豐富，淫羊藿苷含量為朝藿定C含量的1.1（SCZX）～3.2（SCBC）倍。SCLY和SCYX居群淫羊藿苷較朝藿定C的含量稍高。但SCYA和SCDX居群為朝藿定C含量最豐富，其中，SCYA居群朝藿定C的含量為淫羊藿苷含量2.2倍，且其朝藿定C含量在所有居群中最高（2.93 %）。朝藿定A和朝藿定B這兩種成分，除SCTJ居群低于檢測(cè)限外，其余普遍存在，但其含量較朝藿定C和淫羊藿苷偏低，且各居群的含量差異較?。ǔ蕉ˋ：0.14 %～0.47 %，朝藿定B：0.20 %～0.55 %）。

此外，SCYX居群由于淫羊藿苷和朝藿定C含量均偏低，使得4種成分含量相當(dāng)（0.20 %～0.34 %），SCTJ居群則4種成分均低于檢測(cè)限（表2）。

2.2 居群間質(zhì)量差異 以淫羊藿苷含量來(lái)看，依據(jù)2015版藥典淫羊藿苷不得低于0.5 %的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［27］，除SCTJ和SCYX未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，其余居群均達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。其中，SCZX（2.21 %）、SCYL（1.57 %）、SCDY（1.33 %）和SCYA（1.31 %）居群淫羊藿苷含量較高，為藥典標(biāo)準(zhǔn)2.6～4.4倍，SCDX（0.72 %）、SCLY（0.61 %）和SCBC（0.55 %）居群稍高于藥典標(biāo)準(zhǔn)（表2）。

朝藿定C為柔毛淫羊藿中含量較突出的成分，除SCTJ居群外，其余居群均檢測(cè)到朝藿定C，且居群間含量差異非常懸殊，從0.17 %（SCBC）到2.93 %（SCYA），相差17倍。其中，SCYA（2.93 %）和SCZX（1.93 %）含量尤其突出，SCDX（1.2 %）和SCDY（0.97%）居群含量也相對(duì)較高，而SCYL（0.64 %）、SCLY（0.53 %）、SCYX（0.27 %）和SCBC（0.17 %）居群含量則相對(duì)偏低。

以淫羊藿多苷總量來(lái)看，除SCTJ居群外，其余居群含量均超過(guò)1.00 %，含量變異范圍為1.04 %（SCYX）～5.26 %（SCYA）。參照國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂草案淫羊藿多苷高于1.5 %的標(biāo)準(zhǔn)［28］，除SCTJ（低于檢測(cè)限）、SCYX（1.04 %）和SCBC（1.06 %）居群外，其余居群均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。其中，SCYA和SCZX居群淫羊藿多苷含量分別高達(dá)5.26 %和5.06 %，為草案標(biāo)準(zhǔn)的近3.4倍。SCDY（2.86 %）、SCYL（2.80 %）、SCDX（2.50 %）和SCLY（1.81 %）居群為標(biāo)準(zhǔn)的1.2～1.9倍（表2）。

表2 柔毛淫羊藿多苷的含量比較 %

從9個(gè)居群各成分的平均含量來(lái)看，淫羊藿苷和朝藿定C均為0.96 %，淫羊藿苷平均含量為藥典標(biāo)準(zhǔn)的1.9倍，淫羊藿多苷平均含量為2.50 %，為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂草案標(biāo)準(zhǔn)的1.7倍，表明柔毛淫羊藿整體質(zhì)量?jī)?yōu)異。

整體來(lái)看，SCYA、SCZX和SCDY居群的朝藿定C、淫羊藿苷和淫羊藿多苷含量都在平均值以上，質(zhì)量?jī)?yōu)異。SCYL居群淫羊藿和淫羊藿多苷含量均在平均值以上，且淫羊藿苷含量（1.57 %）僅次于最高的SCZX，居群整體質(zhì)量也較為突出。SCDX居群淫羊藿苷（0.72 %）和淫羊藿多苷（2.50 %）含量均為中等，但朝藿定C（1.20 %）含量突出。SCLY居群淫羊藿苷（0.61 %）和淫羊藿多苷（1.81 %）含量均稍高于標(biāo)準(zhǔn)。SCBC居群淫羊藿苷（0.55 %）含量稍高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，但淫羊藿多苷（1.06 %）含量低于標(biāo)準(zhǔn)。SCYX居群則淫羊藿苷（0.34 %）和淫羊藿多苷（1.04 %）含量均低于標(biāo)準(zhǔn)。SCTJ居群最為特殊，沒(méi)有檢測(cè)到任何一種成分。

2.3 PCA分析和聚類分析 PCA顯示第1主成分和第2主成分的貢獻(xiàn)率分別為84.89 %和14.55 %（圖3），其中第1主成分朝霍定C值最大（0.832），其次是淫羊藿苷（0.524）；第2主成分中淫羊藿苷為（0.845），說(shuō)明柔毛淫羊藿以朝藿定C和淫羊藿苷含量為主成分。對(duì)不同居群綜合得分評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)SCYA和SCZX居群品質(zhì)明顯優(yōu)于其他居群，而SCDY、SCYL和SCDX居群得分大于0，擁有較高的朝藿定C和淫羊藿苷含量。SCTJ居群則得分最低（表3）。

表3 柔毛淫羊藿各個(gè)居群主成分值

將9個(gè)居群進(jìn)行PCA主成分分析發(fā)現(xiàn)，各居群的分布說(shuō)明居群間質(zhì)量存在明顯差異。9個(gè)居群分為4 類（圖3）。SCYA居群為第1類，朝藿定C含量為居群間最高，淫羊藿苷含量也較高，但朝藿定C含量顯著高于淫羊藿苷。居群SCZX為第2類，朝藿定C含量非常突出，但淫羊藿苷含量更高，為居群間最高。居群SCYL、SCDY和SCDX為第3類，各成分含量及淫羊藿多苷含量均居中，其中SCYL和SCDY居群淫羊藿苷含量大于朝藿定C，而SCDX居群朝藿定C含量大于淫羊藿苷。居群SCBC、SCYX、SCLY和SCTJ為第4類，各成分含量及淫羊藿多苷含量均偏低，淫羊藿苷含量高于朝藿定C。其中，SCTJ居群因4種待測(cè)成分均未檢測(cè)到而得分最低。

圖3 基于朝藿定A、B、C和淫羊藿苷量的柔毛淫羊藿9居群PCA分析

聚類分析結(jié)果與PCA結(jié)果一致，將9個(gè)居群分為A、B、C和D四大類（圖4）。其中，A類居群淫羊藿多苷和淫羊藿苷含量普遍偏低，繼而分為A1和A2亞類。A1包括SCBC、SCYX和SCLY居群，整體淫羊藿苷含量偏低，A2包括SCTJ居群，未檢測(cè)到任何成分。B類居群淫羊藿苷與淫羊藿多苷含量中等，細(xì)分為B1和B2亞類。其中，B1包括SCDY和SCYL居群，淫羊藿多苷含量較高且淫羊藿苷含量高于朝藿定C含量，B2包括SCDX居群，淫羊藿多苷含量較高但朝藿定C含量高于淫羊藿苷含量。C類和D類淫羊藿多苷含量明顯高于其他7個(gè)居群。C類為SCYA居群，朝藿定C含量為居群間最高。D類為SCZX居群，淫羊藿苷含量為居群間最高。

圖4 柔毛淫羊藿基于ABCI含量的聚類分析圖

2.4 主要生態(tài)因子對(duì)含量的影響

2.4.1 相關(guān)性分析 柔毛淫羊藿9個(gè)居群的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量和ABCI總量與經(jīng)度、緯度和海拔高度等主要生態(tài)因子的相關(guān)性分析結(jié)果表明，朝藿定A（r=-0.753,P=0.019）、朝藿定B（r=-0.794，P=0.011）、淫羊藿苷（r=-0.757，P=0.018）和ABCI總量（r=-0.762,P=0.017）與經(jīng)度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。朝藿定A（r=-0.722，P=0.028）、朝藿定B（r=-0.796,P=0.010）、朝藿定C（r=-0.719，P=0.029）含量和ABCI總量（r=-0.692，P=0.039）與緯度也呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。朝藿定C（r=-0.629，P=0.070）與經(jīng)度，淫羊藿苷（r=-0.458，P=0.215）與緯度間缺乏顯著相關(guān)性。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量和ABCI總量與海拔高度不存在顯著相關(guān)性。

2.4.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析 對(duì)柔毛淫羊藿不同居群主要活性成分與生態(tài)因子灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果表明，不同生態(tài)因子對(duì)4種活性成分以及ABCI的影響各不同（表4）。對(duì)朝霍定A、朝霍定B和朝霍定C含量影響程度均為東經(jīng)＞北緯＞海拔。對(duì)淫羊藿多苷含量影響程度為北緯＞東經(jīng)＞海拔。對(duì)淫羊藿苷含量影響程度為海拔＞東經(jīng)＞北緯。

總體上來(lái)看，柔毛淫羊藿主成分含量與生態(tài)因子之間的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)（ri）為0.566 4～0.652 9，表明生態(tài)因子與主成分含量關(guān)系較為密切。朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C和淫羊藿多苷對(duì)經(jīng)緯度關(guān)聯(lián)性均高于海拔。而淫羊藿苷對(duì)于海拔關(guān)聯(lián)度高于經(jīng)緯度?？傮w上來(lái)看，經(jīng)度和緯度對(duì)于柔毛淫羊藿主要成分關(guān)聯(lián)程度大于海拔。

表4 柔毛淫羊藿主要活性成分與生態(tài)因子的灰色關(guān)聯(lián)度

基于以上生態(tài)因子對(duì)含量影響的分析結(jié)果，表明兩者間存在密切相關(guān)性。就淫羊藿苷及生態(tài)因子相關(guān)性而言，不同分析軟件結(jié)果存在一定差異。SPSS 21.0分析結(jié)果顯示，淫羊藿苷含量?jī)H與經(jīng)度存在顯著負(fù)相關(guān)性。而DPS9.01分析結(jié)果顯示，淫羊藿苷含量與海拔關(guān)系更密切。對(duì)比本研究SCYL和SCBC兩個(gè)經(jīng)緯度相近的居群發(fā)現(xiàn)，高海拔SCYL居群的淫羊藿苷和朝藿定C含量分別為低海拔SCBC居群的2.9倍和3.8倍（表2）。說(shuō)明剔除經(jīng)度和緯度影響后，海拔因子對(duì)柔毛淫羊藿主要成分實(shí)際上存在影響。

3 討論

3.1 柔毛淫羊藿質(zhì)量評(píng)述 通過(guò)本研究，四川主產(chǎn)區(qū)柔毛淫羊藿的質(zhì)量具有以下特證和結(jié)論。

（1）柔毛淫羊藿四川主產(chǎn)區(qū)整體質(zhì)量?jī)?yōu)異。77.8 %和66.7 %的居群其淫羊藿苷和淫羊藿多苷含量分別達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂草案標(biāo)準(zhǔn)，與以往研究結(jié)果趨勢(shì)一致［21-24］。區(qū)別于藥典種箭葉淫羊藿（E. sagittatum (Sieb. et Zucc.)Maxim.）和巫山淫羊藿（E. wushanense T. S. Ying）大部分都達(dá)不到藥典標(biāo)準(zhǔn)［10,12］。

（2）本研究表明，柔毛淫羊藿6個(gè)居群以淫羊藿苷含量為最高，SCYA和SCDX居群以朝藿定C為主導(dǎo)。說(shuō)明柔毛淫羊藿多數(shù)居群活性成分主要以淫羊藿苷為主導(dǎo)，與朝鮮淫羊藿（E. koreanum Nakai）類 似［12］，不同 于淫 羊藿（E. brevicornu Maxim.）以朝藿定B含量最豐富［6］，巫山淫羊藿［27］、箭葉淫羊藿［10］和粗毛淫羊藿（E. acuminatum Franch.）［29］普遍以朝藿定C含量最豐富。淫羊藿苷為淫羊藿藥材最重要的活性成分，但有報(bào)道表明，淫羊藿藥材經(jīng)高溫加熱后，朝藿定C可轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷［30］，暗示無(wú)論是淫羊藿苷主導(dǎo)，還是朝藿定C 主導(dǎo)，均為優(yōu)異種質(zhì)，但利用時(shí)需區(qū)別對(duì)待。

（3）本研究中，SCTJ居群最為特殊，所有個(gè)體均未檢測(cè)到任何一種成分。本研究多次核查實(shí)驗(yàn)材料，確定實(shí)驗(yàn)材料無(wú)誤，且對(duì)SCTJ居群30個(gè)個(gè)體樣本進(jìn)行了多次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)有含量個(gè)體?？膳懦龑?shí)驗(yàn)材料和操作誤差。SCTJ居群位于四川省與陜西省交界處，為其物種分布邊緣，可能是由于地理環(huán)境因素導(dǎo)致，其特殊性有待進(jìn)一步研究。

3.2 生境的討論 經(jīng)度、緯度和海拔是影響藥用植物分布及生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子［5,31］。研究這些因子與藥用植物中有效成分含量的相關(guān)性，不僅有利于探索藥材質(zhì)量形成規(guī)律，而且，可為藥用植物的栽培和規(guī)范化種植提供理論依據(jù)。

本研究表明，柔毛淫羊藿四川主產(chǎn)區(qū)的居群，除朝藿定C與經(jīng)度，淫羊藿苷與緯度缺乏顯著相關(guān)性外，其余含量與經(jīng)度和緯度均呈顯著負(fù)相關(guān)。未來(lái)研究可以考慮進(jìn)一步開(kāi)展氣候、溫度和水分等因素對(duì)柔毛淫羊藿活性成分積累影響的研究。

此外，本研究各成分含量與海拔高度均不存在顯著相關(guān)性，似乎說(shuō)明海拔高度對(duì)質(zhì)量缺乏影響。但事實(shí)是否如此？本研究發(fā)現(xiàn)，SCBC和SCYL居群的地理位置相鄰，其經(jīng)度和緯度極為接近，但SCYL居群的海拔高度（1 377 m）遠(yuǎn)高于SCBC居群（877 m）。質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明，SCYL居群的含有目標(biāo)成分均遠(yuǎn)高于SCBC居群（表2）。提示海拔高度對(duì)柔毛淫羊藿成分的積累可能也具有重要影響。因此，關(guān)于海拔對(duì)藥效成分積累的影響還需要在同一地區(qū)不同海拔的多個(gè)居群開(kāi)展研究，即剔除經(jīng)度和緯度的影響，才能獲到較可靠的結(jié)論。

3.3 對(duì)種質(zhì)利用的啟示 從淫羊藿苷和淫羊藿多苷的含量來(lái)看，位于四川省西南部或中部的居群質(zhì)量均較理想，尤其以西南部的SCYA和SCZX居群最為優(yōu)異。這與付亮等雅安市上里鎮(zhèn)和都江堰市產(chǎn)柔毛淫羊藿質(zhì)量較優(yōu)的結(jié)果吻合［32］。這些種質(zhì)應(yīng)是開(kāi)發(fā)利用的重點(diǎn)，可作為藥材規(guī)范化栽培優(yōu)異的候選種質(zhì)，其生境也可為栽培基地的選擇提供參考。SCTJ居群雖不宜作為藥用種質(zhì)。但其特殊性對(duì)開(kāi)展次生代謝產(chǎn)物積累和淫羊藿藥材質(zhì)量形成機(jī)制研究或許是非常理想的對(duì)照材料。