重金屬鉛多克隆抗體的制備及純化＊

王澤祥，孫曉林

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

鉛是人類最早使用的金屬之一，其用途十分廣泛，包括交通、涂料、農(nóng)藥、包裝材料等諸多領(lǐng)域。鉛是比重高于4.0 的重金屬元素，也是對人體危害最大的幾種重金屬元素之一，其進(jìn)入人體之后，會直接造成神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等器官組織的損害，危害人體健康[1-3]。由于近現(xiàn)代工業(yè)的迅猛發(fā)展和廢物處理不當(dāng)，近些年重金屬的濫用和排放時有發(fā)生，尤其是對人體危害嚴(yán)重的鉛[1]。因此根據(jù)國家法律和法規(guī)的規(guī)定，檢查環(huán)境中重金屬鉛污染狀況和監(jiān)督食品中鉛殘留情況，對保障人民身體健康和食品安全是十分必要的。

傳統(tǒng)的檢測食品中重金屬離子殘留的方法主要有原子吸收光譜法（atomic absorption spectrometry）、氣相色譜分析法（gas phase chromatography）、比色法（colorimetry）、電感耦合等離子體光譜法（inductively coupled plasma spectrometry）、電感耦合等離子體質(zhì)譜分析（inductively coupled plasma-mass spectrometry）法、電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry）法等，這些方法雖然有精確測量樣品中單種重金屬總量等優(yōu)點，但是也有所需儀器昂貴，相對費力、費時，需要專業(yè)人員操作等缺點，因此難以應(yīng)用到現(xiàn)場檢測中[4-7]。隨著免疫學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，重金屬免疫學(xué)檢測方法顯現(xiàn)出其檢測快速、陳本低廉、操作簡單、選擇性強(qiáng)的優(yōu)點，如ELISA、免疫層析法、電化學(xué)發(fā)光檢測法等[8-12]。這些方法是基于特異性抗體識別重金屬離子的免疫分析方法，其中重金屬完全抗原的制備與其抗體的制備及純化是關(guān)鍵[13-15]。目前國外已有多種重金屬ELISA 檢測方法的報道[16-17]，而國內(nèi)關(guān)于重金屬免疫學(xué)檢測方法的相關(guān)研究卻很少。本研究利用兔多克隆抗體制備技術(shù)，采用制備的重金屬鉛鰲合抗原免疫新西蘭大耳白兔，制備了抗重金屬鉛離子的特異性抗體，并運(yùn)用凝膠過濾層析技術(shù)純化制備的多克隆抗體，為建立快速、靈敏、特異的鉛離子ELISA 檢測技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DTPA 螯合劑、二甲基亞砜（DMSO）和葡聚糖凝膠Sephadex G200 均購自索萊寶科技有限公司；1mol/L Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液、HEPES 緩沖液、三乙胺、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自西格瑪奧德里奇（上海）有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；。

1.2 儀器與設(shè)備

pH（瑞士梅特勒-托利多公司）；超純水儀（美國Millipore 公司）；磁力攪拌器（金壇市恒豐儀器廠）；冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；紫外分光光度計（美國Plextech 公司）；脫色搖床（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠），超濾離心管購自美國Millipore 公司。

1.3 實驗動物

健康新西蘭大耳白兔（2.0 kg 左右）購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物廠。

1.4 方法

1.4.1 金屬鉛離子完全抗原的制備

重金屬鉛離子免疫抗原的制備參考Blake、Zhu等報道的抗原合成方法[18-20]，首先稱取50 mg 的DTPA 溶于15 mL DMSO 中，在磁力攪拌器中緩慢溶解20 min，制備成金屬螯合劑溶液;稱取100 牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）,溶于HEPES 緩沖溶液（10 mmol/L,pH 7.5）;將溶解的牛血清白蛋白溶液緩慢逐滴加入金屬螯合劑溶液中，然后加入500 μL 三乙胺溶液，在磁力攪拌器中緩慢攪拌均勻后反應(yīng)24h；使用預(yù)處理的超濾管（100 mmol/L EDTA 和0.1mol/L、pH 7.4 HEPES 緩沖液）4℃、6000rpm 離心超濾15 min去除未偶聯(lián)的DTPA；應(yīng)用pH 7.4 的HEPES 緩沖液將截留物洗取，然后將1mol/L 的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL 逐滴加入，反應(yīng)4h 后，4℃、6000rpm 離心超濾30 min 除去未鰲合的Pb2+，再用pH 7.4 的HEPES 緩沖液稀釋截留物，-80 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 抗原的鑒定

完全抗原應(yīng)用SDS-PAGE 電泳鑒定，取BSA、DTPA-BSA、Pb-DTPA-BSA 分別用三蒸水稀釋到適當(dāng)濃度，煮沸10 min,灌制12%濃縮膠和5%分離膠，加入電極緩沖液，每控上樣量10μL,Marker 按說明書處理，設(shè)定電壓為60V,進(jìn)行垂直SDS-PAGE電泳，電泳至溴酚藍(lán)指示劑離底線1cm 時停止，考馬斯亮藍(lán)染色20～30min,脫色至透明。

1.4.3 完全抗原蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

運(yùn)用紫外分光光度計測定重金屬鉛離子完全抗原中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.4.4 多克隆抗體的制備

制備多克隆抗體的免疫動物為5 只體重2 kg的雄性新西蘭大耳白兔，免疫前，抽取新西蘭大耳白兔血清作為陰性對照。將制備好的免疫抗原0.5 mg與等體積的完全弗氏佐劑混合后制備成乳劑，以皮下多點注射的方式進(jìn)行初次免疫。四周之后，取0.5 mg 免疫抗原與等體積不完全弗氏佐劑混合均勻，以多點皮下注射的方式進(jìn)行第二次免疫，此后每14d運(yùn)用0.5 mg 免疫抗原與等體積不完全弗氏混合均勻后免疫一次，在第5 次免疫后7d，以心臟采血方式采集兔血液，分離血清，血清于4℃保存。

1.4.5 多克隆抗體的純化

取抗體血清運(yùn)用Sephadex G-200 凝膠柱層析法純化多克隆抗體。具體步驟：（1）Sephadex G-200凝膠沸水浴5h，冷卻至室溫后裝柱，保證柱內(nèi)無氣泡且顆粒均勻。（2）用pH 7.4 PBS 緩沖液平衡、洗脫。（3）收集不同峰時的抗體，裝入透析袋，周圍堆積PEG6000 濃縮。濃縮后的多克隆抗體運(yùn)用SDSPAGE 電泳（同1.4.2）檢測純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬鉛完全抗原Pb-DTPA-BSA 的SDSPAGE 鑒定

通過蛋白質(zhì)在SDS-PAGE 中的遷移率以判定各抗原的相對分子質(zhì)量的改變。與BSA 相比，合成的DTPA-BSA 和Pb-DTPA-BSA 均存在滯后現(xiàn)象，說明相對于BSA，DTPA-BSA 和Pb-DTPA-BSA 的分子質(zhì)量都有增大；況且，與DTPA-BSA 相比，Pb-DTPA-BSA 也存在滯后現(xiàn)象，說明Pb-DTPA-BSA比DTPA-BSA 分子質(zhì)量增大更多，這些結(jié)果說明抗原合成成功(如圖1 所示)。

圖1 重金屬鉛完全抗原Pb-DTPA-BSA 的SDS-PAGE 鑒定

2.2 免疫抗原的蛋白質(zhì)濃度

運(yùn)用紫外分光光度計法測定的蛋白質(zhì)濃度為3.4 mg/mL（見表1）

表1 抗重金屬鉛免疫抗原濃度

2.3 SDS-PAGE 電泳鑒定抗體的純度

運(yùn)用凝膠柱層析法對制備的重金屬鉛多克隆抗體進(jìn)行純化，根據(jù)蛋白分子Marker 標(biāo)記，純化后的抗重金屬鉛多克隆抗體純度達(dá)到80%以上（如圖2 所示）。

圖2 重金屬鉛多克隆抗體純化的SDS-PAGE 鑒定

3 討論

重金屬免疫學(xué)檢測方法具有靈敏度高、檢測速度快、選擇性好、所需設(shè)備價格低廉等優(yōu)勢，十分符合對動物性食品中重金屬鉛的檢測需求。重金屬ELISA 檢測方法以抗體技術(shù)為基礎(chǔ)，運(yùn)用過量螯合物與樣品中的重金屬離子制備成復(fù)合物，在酶標(biāo)板上包被金屬-螯合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物抗原，二者競爭性結(jié)合抗體位點，應(yīng)用二抗顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比得出重金屬離子的含量。因為重金屬鉛離子的分子量小、無法形成抗原表位，所以它只是半抗原，缺乏免疫原性[21-22]。因此，重金屬鉛完全抗原的合成和重金屬鉛抗體的制備是ELISA 檢測方法成功建立的關(guān)鍵點，常用的抗原制備技術(shù)有戊二醛法、重氮化法、異硫氰脂法等[23-26]。目前，雙功能螯合劑法制備重金屬完全抗原的報道很少，而且重金屬鉛抗體的制備方法仍以使用實驗動物小鼠的少量制備為主[27]，未見使用實驗動物兔的大量制備并純化的相關(guān)研究。本實驗應(yīng)用雙功能螯合劑DTPA 制備重金屬鉛的完全抗原，運(yùn)用紫外分光光度計法測定完全抗原的濃度，通過SDS-PAGE 對完全抗原的合成進(jìn)行了鑒定，隨后使用完全抗原免疫實驗動物新西蘭大耳白兔，制備多克隆抗體，并應(yīng)用凝膠過濾層析技術(shù)純化多克隆抗體，SDS-PAGE 檢測顯示出重金屬鉛多克隆抗體的純化成功。該研究系國內(nèi)首次制備和純化重金屬鉛兔多克隆抗體，將為下一步動物性食品中重金屬鉛ELISA 檢測方法的建立提供準(zhǔn)備。

4 結(jié)論

本研究成功制備重金屬鉛的完全抗原Pb-DTPA-BSA,紫外分光光度計法測定其濃度為3.4mg/mL，應(yīng)用免疫抗原Pb-DTPA-BSA 免疫家兔，成功制備抗重金屬鉛多克隆抗體，凝膠柱層析法純化獲得高純度抗重金屬鉛多克隆抗體。