基于高通量測序技術(shù)分析廣味香腸中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和演替規(guī)律

王新惠，張雅琳，2，孫勁松，潘 攀，劉 洋，田 甜

（1 成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 成都610106 2 宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川宜賓644000 3 成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院 成都611130）

廣味香腸是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，是一種由絞碎的豬肉，再根據(jù)原輔料配比加入鹽、糖等輔料，攪拌均勻后灌入天然腸衣中，經(jīng)由自然環(huán)境中的菌群發(fā)酵制成。廣味香腸因具有獨(dú)特的滋味以及制作工藝簡單等特點(diǎn)，而深受消費(fèi)者的喜愛。

傳統(tǒng)的廣味香腸發(fā)酵和成熟過程是在開放的自然環(huán)境中，采用傳統(tǒng)工藝制作的香腸往往含有組胺、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)，組胺是由能產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物作用于游離的組氨基酸而形成的[1]。研究者發(fā)現(xiàn)組胺主要是由革蘭氏陰性腐敗菌產(chǎn)生的[2]，主要是腸桿菌科[3]；發(fā)酵環(huán)境中的雜菌也會將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽能和胺類物質(zhì)生成亞硝胺，從而誘發(fā)癌癥[4]。乳酸桿菌可以通過降低環(huán)境的pH 值和產(chǎn)生細(xì)菌素來提高香腸的微生物安全性[5]。發(fā)酵環(huán)境中的菌群是引起香腸理化指標(biāo)和安全性指標(biāo)變化的主因，并且香腸的質(zhì)量與風(fēng)味取決于發(fā)酵環(huán)境中菌群的結(jié)構(gòu)和變化。吳麗紅[6]通過純培養(yǎng)方式，秦丹[7]通過RAPDPCR 技術(shù)，郭明亮[8]通過PCR-DGGE 技術(shù)等對香腸內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)和變化進(jìn)行分析。PCR 技術(shù)是基于微生物純培養(yǎng)基礎(chǔ)上，人們無法摸索香腸內(nèi)所有微生物生長條件，并且大部分的微生物是無法培養(yǎng)的。純培養(yǎng)方式能培養(yǎng)的微生物很少，這種分析技術(shù)會對香腸內(nèi)菌群的分析不全面。近幾年，高通量測序技術(shù)的誕生并廣泛應(yīng)用，彌補(bǔ)了PCR 技術(shù)的缺點(diǎn)，其具有處理量大、速度快、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，可對食品菌群多樣性及變化規(guī)律進(jìn)行有效分析[9-10]。

目前，對廣味香腸發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和演變規(guī)律的研究較少。通過高通量測序技術(shù)對香腸內(nèi)細(xì)菌菌群的豐度和多樣性進(jìn)行測量，能全面了解香腸發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群群落的演變規(guī)律。本試驗(yàn)通過高通量測序技術(shù)分析廣味香腸發(fā)酵過程中的細(xì)菌結(jié)構(gòu)和演變規(guī)律，確定廣味香腸發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群，旨在為提高廣味香腸風(fēng)味，控制香腸內(nèi)有害微生物的生長，減少有害物質(zhì)生成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原材料

廣味香腸：衛(wèi)生檢疫合格的豬肉、天然腸衣、食用級鹽、味精和糖等輔料購于成都市龍泉驛區(qū)成都大學(xué)十陵鑫大百貨超市。

1.2 試劑與儀器

脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、溶菌酶、RNase A、蛋白酶K，均購于生工生物工程（上海）股份有限公司；溴化十六烷基三甲胺（CTAB）、瓊脂糖，美國Sigma 公司；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒，上海百塞生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 提取試劑盒，美國OMEGA；乙二胺四乙酸（EDTA）、鹽酸、磷酸三鈉、氯化鈉、氯仿、異戊醇、無水乙醇等，均購于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

ND-2000C 微量紫外分光光度計(jì)，美國Nano Drop 公司；5810R 臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，美國Bio-Rad；DYCZ-21 型電泳槽，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 廣味香腸的制作和樣品的采集 廣味香腸制作工藝流程：原料肉→修整→腌制→絞碎→拌料→灌腸→發(fā)酵（22～25 ℃，相對濕度90%～95%）→成熟（15～18 ℃，相對濕度70%～80%）。

樣品的采集：在發(fā)酵的第0，10，20 和30 天采樣。

1.3.2 DNA 的提取 取一段廣味香腸，參照E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 提取試劑盒中的方法提取廣味香腸樣品宏基因組DNA，然后使用乙醇將DNA 進(jìn)行沉淀，最后采用微量紫外分光光度計(jì)對提取的DNA 純度和濃度進(jìn)行測定，在260 nm 和280 nm 的波長下測定DNA 的吸光度。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增和測序 采用引物515F 5’-GT GCCAGCMGCCGCGGTAA-3’ 和805R 5’-GACTG GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGACTACH VGGGTATCTAATCC-3’ 對細(xì)菌16S rRNA 的V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)用15 μL 高保真酶（Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix），0.2 μmol/L 引物和大約10 ng 模板DNA 進(jìn)行。為了減少與引物延伸相關(guān)的可能偏差，進(jìn)行兩步分析PCR 技術(shù)，其中第1 個(gè)PCR 步驟使用未標(biāo)記的引物進(jìn)行25 個(gè)循環(huán)；第2 個(gè)PCR 步驟用標(biāo)記的引物進(jìn)行5 個(gè)循環(huán)，第一步的產(chǎn)物用作模板。第1個(gè)PCR 步驟：在94 ℃下預(yù)變性3 min，在94 ℃下變性30 min，在45 ℃下退火20 min，在65 ℃下延伸30 min，重復(fù)進(jìn)行25 個(gè)循環(huán)，在72 ℃下保持5 min。第2 個(gè)PCR 步驟：在95 ℃下預(yù)變性3 min，在94 ℃變性20 s，在55 ℃退火20 s，在72 ℃下伸長30 s，最后在72 ℃下拉伸5 min，重復(fù)進(jìn)行5 個(gè)循環(huán)。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 通過匹配特定的條形碼將高通量測序數(shù)據(jù)分類到不同的樣品中。然后，使用FASTX-Toolkits 的收集命令行工具（http：//hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）修剪引物，條形碼和適配器[11-13]，對序列數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，多路復(fù)用并準(zhǔn)備用于統(tǒng)計(jì)分析。剩下的序列稱為有效序列。為有效序列分析進(jìn)行了操作分類單元（OTU）和基于分類法的方法。通過使用Mothur v1.30.0[14]將有效序列聚集到截止水平為3%的OTU 中，而分類法矩陣則以固定的置信度獲得使用Rv 3.0.0[1]與Vegan package[15]的閾值為80%。用QIIME 評估α 多樣性以代表單個(gè)樣品中的細(xì)菌生物多樣性。計(jì)算稀釋曲線，Shannon 多樣性指數(shù)，Chao 1 豐富度和Good’s 覆蓋度以評估α 多樣性[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣味香腸中細(xì)菌群落α-多樣性分析

廣味香腸發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群的多樣性如表1所示，可以看出，廣味香腸內(nèi)細(xì)菌群落的豐度和多樣性都是隨著時(shí)間先升高后降低，最后再升高的一個(gè)過程。在第20 天時(shí)，細(xì)菌群落的多樣性最低，而在第0 天時(shí)，細(xì)菌的豐度最低，在第30 天時(shí)，細(xì)菌群落的豐度和多樣性最高。在發(fā)酵的第0天時(shí)，細(xì)菌菌群多樣性較高，菌群主要來源于豬肉、天然腸衣以及輔料等。在發(fā)酵的前10 天，細(xì)菌菌群豐度和多樣性呈上升趨勢，首先是原材料中菌群增長，其次是自然環(huán)境中的微生物進(jìn)入香腸內(nèi)開始增長。在第20 天時(shí)，細(xì)菌菌群豐度和多樣性降低，可能是大部分的細(xì)菌無法適應(yīng)低pH 的環(huán)境，導(dǎo)致生長受到抑制[17]，或者是因?yàn)橐恍┘?xì)菌能產(chǎn)生細(xì)菌素等抑制了腐敗致病菌的生長。在第30 天時(shí)，細(xì)菌菌群的豐度和多樣性有所增加，可能的原因是：第一，因?yàn)榘l(fā)酵環(huán)境的pH 值過低，不僅會影響發(fā)酵環(huán)境中雜菌等的生長，也會影響乳酸菌自身的增長和代謝，所以乳酸菌的代謝被抑制，雜菌開始生長；第二，蛋白質(zhì)、糖類等大分子物質(zhì)被分解后產(chǎn)生的小分子物質(zhì)刺激了某些只能代謝氨基酸、葡萄糖等的菌群的生長；第三，由于發(fā)酵環(huán)境中乳酸菌被抑制，因此外界環(huán)境中的其它菌群進(jìn)入香腸內(nèi)增長。廣味香腸發(fā)酵過程中發(fā)酵環(huán)境中的菌群處于動(dòng)態(tài)變化，發(fā)酵環(huán)境和自然環(huán)境中的微生物也可以動(dòng)態(tài)交替，這是廣味香腸獨(dú)特風(fēng)味的來源，但也會造成自然環(huán)境中的致病腐敗菌進(jìn)入發(fā)酵環(huán)境中，在香腸內(nèi)產(chǎn)生有害物質(zhì)。

表1 廣味香腸發(fā)酵過程中細(xì)菌群落豐度和多樣性Table 1 Bacterial community abundance and diversity during fermentation of cantonese sausage

2.2 廣味香腸中細(xì)菌群落多樣性曲線和韋恩圖（Venn）分析

Shannon-Wiener 曲線可以比較廣味香腸內(nèi)因?yàn)闇y序數(shù)據(jù)量不同時(shí)菌群的多樣性和豐度，也可以對樣品的測序量是否合理作出判斷[9]。從圖1a中看出，每個(gè)時(shí)期的Shannon-Wiener 曲線最終都趨于平衡，這說明測序的合理性，再繼續(xù)添加測序量，也不會產(chǎn)生較多的OTU。

廣味香腸每個(gè)發(fā)酵階段的OTU 數(shù)目如表1所示，可以從圖1b 中看出，在發(fā)酵剛開始時(shí)有252 個(gè)OTUs，在發(fā)酵第10 天時(shí)，有290 個(gè)OTUs，在發(fā)酵第20 天時(shí)，有207 個(gè)OTUs，在發(fā)酵第30天時(shí)，有453 個(gè)OTUs。但是僅有42 個(gè)OTUs 存在于廣味香腸發(fā)酵的整個(gè)過程中，這表明在廣味香腸發(fā)酵過程中，香腸內(nèi)的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化很大。

圖1 廣味香腸細(xì)菌多樣性曲線和韋恩圖Fig.1 Bacterial Shannon-Wiener curve of flora and Venn diagram of cantonese sausage

2.3 廣味香腸發(fā)酵過程中細(xì)菌群落在門水平的結(jié)構(gòu)分布以及動(dòng)態(tài)變化

廣味香腸在不同的發(fā)酵時(shí)間細(xì)菌菌落在門水平上的結(jié)構(gòu)分布如圖2所示，在廣味香腸中檢測出17 個(gè)門，其中最主要的門是厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門 （Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）。其中，厚壁菌門和變形菌門在整個(gè)發(fā)酵過程中占優(yōu)勢地位。厚壁菌門從最初發(fā)酵時(shí)的19.44%，隨著發(fā)酵時(shí)間先增加，在第20 天時(shí)，厚壁菌門占比95.4%，隨后在發(fā)酵結(jié)束時(shí)減小到87.46%，而變形菌門則隨著時(shí)間從最初的77.66%，到第20 天時(shí)，減少到0.09%，但是在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，增加到11%，擬桿菌門在最初發(fā)酵時(shí)和發(fā)酵最后階段時(shí)占比變化不大，分別為2.89%和1.44%。而放線菌門在整個(gè)發(fā)酵過程中的占比一直處于較低的狀況，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，放線菌門達(dá)到最大的占比是0.08%。

圖2 廣味香腸發(fā)酵過程中細(xì)菌群落在門水平的分布Fig.2 Relative abundance of bacteria community proportions at phylum in cantonese sausage

2.4 廣味香腸發(fā)酵過程中細(xì)菌群落在屬水平的結(jié)構(gòu)分布及動(dòng)態(tài)變化

廣味香腸發(fā)酵過程中細(xì)菌群落在屬水平的結(jié)構(gòu)如圖3所示，在屬水平上，廣味香腸中較多的是弧菌屬 （Vibrio spp.）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus spp.）、魏斯氏菌屬（Weissella spp.）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter spp.）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix spp.）、腸桿菌屬（Enterobacter spp.）、耶爾森氏菌屬（Yersinia spp.）。其中弧菌屬、不動(dòng)桿菌屬、環(huán)絲菌屬、腸桿菌屬和耶爾森氏菌屬是腐敗致病菌，可以看出在第0 天時(shí)，弧菌屬占比54.13%，不動(dòng)桿菌屬占比10.01%，腸桿菌屬占比6.94%，耶爾森氏菌屬占比5.35%，環(huán)絲菌屬占比3.09%，而在第20天時(shí)，這些菌群的占比降低到最低值，弧菌屬占比1.25%，不動(dòng)桿菌屬占比0.19%、腸桿菌屬占比1.07%、耶爾森氏菌屬占比1.74%、環(huán)絲菌屬占比0.17%。從表1和圖3共同得出，在第20 天時(shí)，香腸內(nèi)的細(xì)菌群落的多樣性最低，是因?yàn)槿樗釛U菌屬成為優(yōu)勢菌屬，抑制了發(fā)酵環(huán)境中的腐敗致病菌。

弧菌是食品中的致病菌，弧菌嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的健康，會引發(fā)急性胃腸炎、腹瀉、頭痛、嘔吐等[18]。在第10 天時(shí)，弧菌屬是優(yōu)勢菌屬，占比50.23%，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，弧菌屬占比降到了1.66%，弧菌屬的生長受到了抑制。弧菌屬能代謝葡萄糖[19]，在發(fā)酵前期，乳酸桿菌屬增長較慢，發(fā)酵環(huán)境中的pH變化不大，所以沒有很大程度的抑制弧菌屬的增長，但在第20 天時(shí)，環(huán)境的pH 下降，乳酸桿菌屬成為優(yōu)勢菌屬，抑制了弧菌屬的增長[19]。不動(dòng)桿菌屬是肉制品中常見的腐敗菌之一，不耐酸，是非葡萄糖發(fā)酵菌屬[20]，所以不動(dòng)桿菌屬一直被抑制。魏斯氏菌屬有利于香腸的風(fēng)味和安全。在發(fā)酵的前10 天，隨著發(fā)酵時(shí)間在增長，但在第20 天時(shí)，魏斯氏菌屬在發(fā)酵環(huán)境中占比降到了8.2%。在第30天時(shí)，魏斯氏菌屬成為優(yōu)勢菌屬，占比是37.96%。因?yàn)槲核故暇鷮倏梢源x碳水化合物，所以在前期呈增長趨勢，此外魏斯氏菌屬和乳酸桿菌屬是競爭關(guān)系。但是魏斯氏菌屬可以合成葡萄聚糖、異麥芽低聚糖等低聚糖來促進(jìn)乳酸桿菌屬中益生菌的增長[21]，導(dǎo)致乳酸桿菌屬的增長速度遠(yuǎn)高于魏斯氏菌屬，所以在第20 天時(shí)，魏斯氏菌屬的占比降低；但在第30 天時(shí)，乳酸桿菌屬減少，魏斯菌屬增加。片球菌屬（Pediococcus spp.）和葡萄球菌屬（Staphyococcus spp.）可以提升香腸的風(fēng)味和降低發(fā)酵環(huán)境中組胺的含量[22]，在發(fā)酵初期，兩個(gè)菌屬的總占比低于0.26%，在第10 天時(shí)，片球菌屬和葡萄球菌屬占比達(dá)到最高，分別是3.19%和0.28%，在第20 天降低也有可能是因?yàn)槿樗釛U菌屬的增加而導(dǎo)致。乳酸桿菌屬可以發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸，降低發(fā)酵環(huán)境的pH，抑制有害菌群和酶的活性，也可以產(chǎn)生細(xì)菌素來抑制致病腐敗菌。乳酸桿菌屬隨著時(shí)間先增加后降低，在第20 天時(shí)，乳酸桿菌屬成為優(yōu)勢菌屬，占比達(dá)84.61%，但是在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，乳酸桿菌屬的占比降到29.88%，可能是因?yàn)槿樗釛U菌屬處于低pH 的發(fā)酵環(huán)境，增長會受到抑制，亦或是因?yàn)槿樗釛U菌屬的菌群開始進(jìn)入衰亡期，增長速度和代謝速度減慢，導(dǎo)致其它競爭菌群增加，所以在第30 天時(shí)，廣味香腸內(nèi)的乳酸桿菌屬的占比降低。

從圖3中可以在屬的水平上分析廣味香腸內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，乳酸桿菌屬是香腸發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬，在發(fā)酵第20 天時(shí)，占比是84.61%，發(fā)酵環(huán)境中細(xì)菌的多樣性和豐富最低，抑制了廣味香腸中的致病腐敗菌。廣味香腸發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化大，是因?yàn)槿樗釛U菌屬的動(dòng)態(tài)變化和發(fā)酵環(huán)境的開放性。

圖3 廣味香腸發(fā)酵過程中細(xì)菌群落在屬水平的分布Fig.3 Relative abundance of bacteria community proportions at genus in cantonese sausage

2.5 廣味香腸中細(xì)菌功能豐度熱圖

廣味香腸中細(xì)菌功能豐度熱圖如圖4所示，顏色塊代表功能的豐度值，顏色越紅代表豐度越高，相反則表示豐度越低。從圖4中看出，主要有膜運(yùn)輸（Membrane Transport）、糖代謝（Carbohydrate Metabolism）和氨基酸代謝 （Amino Acid Metabolism）這3 個(gè)功能。膜運(yùn)輸功能豐度最大，菌群的增長需要營養(yǎng)物質(zhì)，只有營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被利用才能保證菌群的正常生長和繁殖；而糖代謝和氨基酸代謝都是香腸風(fēng)味形成的主要反應(yīng)[22]。在第20 天時(shí)，膜運(yùn)輸、糖代謝和氨基酸代謝功能較其它時(shí)間段稍低，說明這些功能在第20天時(shí)被抑制，原因可能是發(fā)酵環(huán)境的pH 值降低，導(dǎo)致菌群自身的代謝減慢，pH 也會影響某些代謝物質(zhì)跨膜的能力。廣味香腸內(nèi)的細(xì)菌菌群的動(dòng)態(tài)變化，不僅會影響發(fā)酵產(chǎn)品的安全性，也會影響產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)等的生成。

3 結(jié)論

圖4 廣味香腸中細(xì)菌的功能豐度熱圖Fig.4 Bacterial function abundance heatmap of cantonese sausage

對廣味香腸自然發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和演變進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)廣味香腸內(nèi)細(xì)菌的多樣性和豐度隨著發(fā)酵時(shí)間先增加后降低，最后再增加的過程，在門的水平上對廣味香腸中細(xì)菌群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)主要有厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門 （Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）這4 個(gè)門，并且厚壁菌門是優(yōu)勢菌門；在屬的水平上對廣味香腸中細(xì)菌群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)主要有弧菌屬（Vibrio spp.）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus spp.）、魏斯氏菌屬（Weissella spp.）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter spp.）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix spp.）、腸桿菌屬（Enterobacter spp.）、耶爾森氏菌屬（Yersinia spp.），乳酸菌屬是優(yōu)勢菌屬，在第20 天時(shí)，發(fā)酵環(huán)境中占比是84.61%。

結(jié)果表明，通過高通量測序?qū)V味香腸自然發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和演變進(jìn)行研究，發(fā)酵環(huán)境中的菌群結(jié)構(gòu)和多樣性變化較大，發(fā)酵環(huán)境中的優(yōu)勢菌屬乳酸桿菌屬不僅會影響細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化，并且會影響香腸風(fēng)味物質(zhì)等的生成。