烤雞貨架期優(yōu)勢(shì)菌鑒定及其防腐研究

包桂鳳，錢琦峰，王向陽(yáng)，顧 雙

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018）

散裝烤雞中蛋白質(zhì)和水分含量高[1-3]，在高溫季節(jié)易腐敗變質(zhì)[4-5]。如果進(jìn)行熱滅菌，會(huì)嚴(yán)重影響其口感、風(fēng)味[6]。目前物理的防腐方法還不成熟，難以用于散裝烤雞[7-8]?？墒褂脟?guó)家標(biāo)準(zhǔn)允許的防腐劑，通過復(fù)配來延長(zhǎng)烤雞貨架期。

前人對(duì)新鮮肉和肉制品的防腐有一些研究。如：孟良玉等[9]將蜂膠提取液對(duì)豬肉進(jìn)行涂抹保鮮，在37 ℃下可保鮮貯藏24 h，在0～4 ℃低溫下可保鮮貯藏12 d 以上。何葉子等[10]使用添加殼聚糖和Nisin 的襯墊，顯著抑制了被包裝鮮肉中微生物的生長(zhǎng)，減緩了總揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（TBARS）值和pH 值的增長(zhǎng)速率，降低了蒸煮損失率，可保持較好的硬度和顏色，顯著延長(zhǎng)了保質(zhì)期。康懷彬等[11]將燒雞用Nisin、溶菌酶、乳酸鈉、雙乙酸鈉復(fù)合浸泡，然后真空包裝，其保質(zhì)期達(dá)15～20 d。黃文壘[12]將魚香肉絲用Nisin、茶多酚、納他霉素、丁香桂皮浸提液復(fù)合天然保鮮液處理，室溫下貯藏保質(zhì)期延長(zhǎng)4 倍。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)不允許新鮮肉采用防腐劑處理，而對(duì)調(diào)理肉和肉制品允許使用。由于散裝烤雞等肉制品缺少防腐劑處理研究，因此也缺少實(shí)踐應(yīng)用。

導(dǎo)致烤雞腐敗的微生物種類尚不清楚，本文對(duì)其進(jìn)行了鑒定，并應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)允許的天然和化學(xué)防腐劑，例如乳酸鈉[13]、Nisin[14]、納他霉素[15]、蜂膠[16-17]、水溶性殼聚糖[18-19]處理，模擬夏日條件進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烤雞，購(gòu)自杭州市西湖區(qū)文一路物美大賣場(chǎng)；納他霉素（含50%乳糖），DANISCO 公司；蜂膠（純度80%），河南長(zhǎng)葛市中龍蜂產(chǎn)品加工廠；水溶性殼聚糖（脫乙酰度>85%），寧波市鎮(zhèn)海海鑫生物制品有限公司；Nisin （含水效價(jià)：1.192×106IU/g），浙江銀象生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ECLIPSE TE2000-S 生物顯微鏡，日本Nikon公司；ECLIPSE TE2000-S 生物顯微鏡，日本Nikon 公司；牛津杯（內(nèi)徑6 mm±0.1 mm，外徑7.8 mm±0.1 mm），江蘇三愛思科學(xué)儀器有限公司；CM-14 斬拌機(jī)，西班牙MAINCA 公司；珠江LRH-150-S 培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；拍打均質(zhì)機(jī)，西班牙IUL 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 腐敗菌分離鑒定 取10 g 樣品加90 mL水，拍打1～2 min。吸取1 mL，加9 mL 水，如此制備系列稀釋樣品勻液。接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基平板上，36 ℃下培養(yǎng)2～3 d，統(tǒng)計(jì)不同形態(tài)菌落的絕對(duì)數(shù)和相對(duì)數(shù)。挑取單菌落至新的平板培養(yǎng)基，純化和培養(yǎng)單菌落。

細(xì)菌鑒定[20-22]：在細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d 后，得到3 種細(xì)菌菌株。進(jìn)行革蘭氏染色、細(xì)菌芽孢染色、耐酸染色試驗(yàn)，顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。測(cè)定細(xì)菌生理生化特性，進(jìn)行MR 試驗(yàn)、V.P 試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、需氧厭氧發(fā)酵試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、尿素利用試驗(yàn)、酪蛋白水解試驗(yàn)、石蕊牛奶還原試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵管（蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、甘露醇）試驗(yàn)來測(cè)定其生理生化特征，鑒定菌種。

真菌鑒定[23-24]：在PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d 后，分離得到1 種霉菌菌株。根據(jù)孢子梗和孢子的形態(tài)和大小等鑒定。

1.3.2 抑菌圈試驗(yàn) 根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[25]選擇5 種防腐劑的系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對(duì)3 種分離得到的細(xì)菌和1 種霉菌，進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)，見表1。抑制圈直徑=無菌區(qū)直徑-牛津杯外部直徑。

防腐劑的配制：納他霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)不包括50%的乳糖，其添加乙醇，并加2 滴吐溫80，再加水。蜂膠溶于30%乙醇，再加水配制。其最終乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對(duì)照相同。殼聚糖用水配制，用1%醋酸調(diào)pH 5。另外設(shè)置pH 5 醋酸為殼聚糖的對(duì)照。乳酸鈉和Nisin 用水配制。每個(gè)平板加6.0 mL 培養(yǎng)基，加細(xì)菌0.1 mL 1×107菌液，霉菌用1×107孢子懸浮液。放入牛津杯，在杯內(nèi)分別加入0.2 mL上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑，納他霉素添加于霉菌培養(yǎng)基，其它4 種添加于細(xì)菌培養(yǎng)基。細(xì)菌36 ℃培養(yǎng)2～3 d，霉菌28 ℃培養(yǎng)4～5 d，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.3 烤雞微生物抑制試驗(yàn) 將100 g 烤雞在各種防腐液中浸泡30 s，取出后瀝干5 min。置于36℃貯藏0，24，48，72 h 進(jìn)行菌落總數(shù)及霉菌總數(shù)測(cè)定。

1.3.4 復(fù)合保鮮劑正交配比試驗(yàn) 根據(jù)四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交表如表3所示。對(duì)正交結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 測(cè)定方法

菌落總數(shù)按照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[26]，霉菌總數(shù)按照GB 4789.15-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[27]方法測(cè)定。

表1 防腐劑及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）Table 1 Preservatives and their mass percent （%）

表2 防腐劑及添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）Table 2 Preservatives and added mass percent （%）

表3 復(fù)合防腐劑正交表Table 3 Orthogonal table of composite preservative

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每個(gè)數(shù)據(jù)測(cè)定3 個(gè)平行，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行初步整理與計(jì)算，試驗(yàn)圖用Origin 8.0 繪制，試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 17.0 進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平設(shè)置為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢(shì)菌分離鑒定

3 種菌均為芽孢桿菌屬。對(duì)照伯杰氏手冊(cè)，1號(hào)菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），2、3 號(hào)菌株為短小芽孢桿菌 （Bacillus pumilus）不同菌株?？倦u中1 號(hào)菌株所占比例達(dá)到68%，2 號(hào)菌株為15%，3 號(hào)菌株為14%。

4 號(hào)菌株的菌落開始為乳白色，近似圓形，中間向上略有突起，邊緣凹凸不平，表面有褶皺。顯微鏡下觀察，菌絲發(fā)達(dá)，分支較多，菌體有隔斷，孢子梗頭部可以確定是曲霉屬，再根據(jù)孢子著生形態(tài)、層數(shù)，孢子大小和形狀。確定4 號(hào)菌株為亮白曲霉（Aspergillus candidus）。

表4 3 種細(xì)菌菌株的形態(tài)學(xué)特征Table 4 The morphological characteristics of 3 bacterial strains

表5 3 種細(xì)菌菌株的生理生化特性Table 5 Physiological and biochemical characteristics of 3 bacterial strains

2.2 防腐劑對(duì)優(yōu)勢(shì)菌抑制效果

蜂膠抑制枯草芽孢桿菌效果最好，其次是Nisin。同時(shí)，蜂膠抑制短小芽孢桿菌的效果也最好。Nisin 和殼聚糖抑制短小芽孢桿菌（2 號(hào)、3 號(hào)菌）效果類似。納他霉素能夠很好地抑制4 號(hào)菌亮白曲霉生長(zhǎng)，抑菌直徑大。乳酸鈉和乙醇對(duì)照組的抑菌效果類似，有一定抑菌作用，但效果不明顯。乳酸鈉對(duì)優(yōu)勢(shì)菌的抑制效果較差。0.4%蜂膠、0.015%納他霉素、0.025% Nisin、0.5%殼聚糖均有較好的抑菌效果。

表6 防腐劑對(duì)枯草芽孢桿菌（1 號(hào)細(xì)菌）的抑菌圈直徑（mm）Table 6 Inhibitory diameter of preservatives on Bacillus subtilis （bacteria No.1）（mm）

表7 防腐劑對(duì)短小芽孢桿菌（2 號(hào)細(xì)菌）的抑菌圈直徑（mm）Table 7 Inhibitory diameter of preservatives on Bacillus pumilus （bacteria No.2）（mm）

表8 防腐劑對(duì)短小芽孢桿菌（3 號(hào)細(xì)菌）的抑菌直徑（mm）Table 8 Inhibitory diameter of preservative on Bacillus pumilus （bacteria No.3）（mm）

表9 防腐劑對(duì)亮白曲霉（4 號(hào)霉菌）的抑菌直徑（mm）Table 9 Inhibitory diameter of preservative to Aspergillus candidus （fungi No.4）（mm）

2.3 不同防腐劑對(duì)烤雞菌落總數(shù)的抑制

對(duì)照組放置1 d，其菌落總數(shù)達(dá)到了（6.08±0.07）lg （CFU/g），已超過國(guó)標(biāo)要求的菌落總數(shù)≤50 000 CFU/g，即4.70 lg （CFU/g）。添加Nisin、蜂膠的試驗(yàn)組放置2 d 依然符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，放置3 d時(shí)超標(biāo)。殼聚糖處理放置2 d 已超標(biāo)。所有試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，均有極顯著性差異（P＜0.001）。添加Nisin 的試驗(yàn)組1、2 的抑菌能力與試驗(yàn)組3、4、5 有顯著性差異（P＜0.05）。Nisin 質(zhì)量分?jǐn)?shù)需≥0.035%。添加蜂膠的試驗(yàn)組1 的抑菌能力與試驗(yàn)組4、5 有顯著性差異（P＜0.05）。蜂膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)需≥0.3%。添加殼聚糖的試驗(yàn)組1 的抑菌能力與試驗(yàn)組3、4、5 之間有顯著性差異（P＜0.05）。水溶性殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)需≥0.4%。對(duì)照組放置1 d，其霉菌、酵母菌菌落總數(shù)為2.82 lg （CFU/g）。試驗(yàn)組放置3 d 才接近2.82 lg （CFU/g）。所有試驗(yàn)組與對(duì)照組有極顯著性差異（P＜0.001）。試驗(yàn)組1、2 與試驗(yàn)組3、4、5 之間有顯著性差異（P＜0.05）。納他霉素≥0.015%后抑制霉菌效果較好，該添加量在國(guó)標(biāo)規(guī)定的范圍內(nèi)。

圖1 Nisin 對(duì)烤雞菌落總數(shù)的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of Nisin on total number of colonies of roast chicken

圖2 蜂膠對(duì)烤雞菌落總數(shù)的抑菌效果Fig.2 Inhibitory effect of propolis on total number of colonies of roast chicken

圖3 水溶性殼聚糖對(duì)烤雞菌落總數(shù)的抑菌效果Fig.3 Antibacterial effect of water-soluble chitosan on total number of colonies of roast chicken

圖4 納他霉素對(duì)烤雞霉菌的抑菌效果Fig.4 Inhibitory effect of natamycin on fungi of roast chicken

2.4 復(fù)合防腐劑對(duì)菌落總數(shù)和真菌的抑制

貯藏前期菌落總數(shù)增加緩慢，36 h 后菌落總數(shù)增加變快。從組1 至組9，菌落總數(shù)依次降低，組9 菌落總數(shù)最低。組1 菌落總數(shù)與組7、8、9 差異顯著（P＜0.05）；組9 菌落總數(shù)與組1～6 差異顯著（P＜0.05）；組7 菌落總數(shù)與組1～5 差異顯著（P＜0.05）。組7～9 試驗(yàn)組對(duì)細(xì)菌的抑制作用較好，且蜂膠添加量最大。

蜂膠對(duì)菌落總數(shù)的抑制作用較大。納他霉素抑菌效果最差，因其只能抑制真菌，而對(duì)細(xì)菌幾乎沒有抑制作用。根據(jù)極差R，各防腐劑抑制的主次順序?yàn)椋悍淠z＞水溶性殼聚糖＞Nisin＞納他霉素。最優(yōu)組為蜂膠3、水溶性殼聚糖3、Nisin 2、納他霉素1。

貯藏前期真菌增加速度慢，48 h 后速度變快。組1、5、9 的真菌最高，組1 與組2、3、4、8 差異顯著（P＜0.05）；組3、4、8 真菌最低。組3、4、8 與組1、2、5、6、7、9 差異顯著（P＜0.05）。組3、4、8 對(duì)真菌生長(zhǎng)的抑制作用較好，而這幾個(gè)組正好是納他霉素添加量最高的組?？瞻讓?duì)照組在36 ℃下，24 h 就發(fā)現(xiàn)烤雞表面出現(xiàn)霉菌菌落。霉菌、酵母菌菌落總數(shù)達(dá)3.67 lg （CFU/g），說明加入復(fù)合防腐劑的效果非常好。

根據(jù)極差R 大小，各防腐劑抑制真菌的主次順序?yàn)椋杭{他霉素＞Nisin＞水溶性殼聚糖＞蜂膠。最優(yōu)組為蜂膠1、水溶性殼聚糖1、Nisin 1、納他霉素3。

表10 不同試驗(yàn)組貯藏期內(nèi)菌落總數(shù)的變化[lg（CFU/g）]Table 10 Changes in the total number of colonies during the storage period in different experimental groups [lg（CFU/g）]

表11 菌落總數(shù)正交直觀分析表Table 11 Orthogonal intuitive analysis table of total number of colonies

表12 不同試驗(yàn)組貯藏期內(nèi)真菌菌落總數(shù)的變化[lg（CFU/g）]Table 12 Changes of the total number of fungi colonies during the storage period in different experimental groups [lg（CFU/g）]

表13 真菌菌落總數(shù)正交直觀表Table 13 Orthogonal intuitive table of total number of fungi colonies

3 結(jié)論

導(dǎo)致烤雞變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)菌有細(xì)菌和霉菌，細(xì)菌分別是枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌，霉菌是亮白曲霉。蜂膠對(duì)細(xì)菌抑制能力強(qiáng)，納他霉素對(duì)霉菌抑制能力強(qiáng)。Nisin、水溶性殼聚糖對(duì)細(xì)菌也有較強(qiáng)的抑制作用。36 ℃下，Nisin、蜂膠單因素添加可以延長(zhǎng)烤雞的菌落總數(shù)合格時(shí)間至2 d 以上。比空白組不足12 h 的貨架期延長(zhǎng)了4 倍。在36 ℃下，空白組1 d 后就能看到明顯的白曲霉菌落，而添加納他霉素后3 d 才出現(xiàn)白曲霉菌落。最優(yōu)組對(duì)烤雞微生物的抑制超過60 h，與空白組不足12 h相比，延長(zhǎng)了5 倍以上。