預處理對藍莓NFC果汁品質(zhì)和風味的影響

劉 偉，許 彎，胡小琴，胡梓妍，李高陽，張菊華*

（1 湖南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 長沙410125 2 湖南大學研究生院隆平分院 長沙410125）

藍莓果實營養(yǎng)豐富，富含黃酮、花青素和VC等，因其具有潛在的抗癌、抗衰老以及預防心臟病等保健功能而深受消費者歡迎[1]?；ㄇ嗨厥且活悘V泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類化合物[2]?；ㄇ嗨貙Ω纳朴洃浻休^好效果。例如：Adrian 等[3]研究表明采用急性富含類黃酮的藍莓飲品干預，學齡兒童更能有效地編碼記憶項目。Guo 等[4]研究表明藍莓飲料對慢性輕度壓力導致認知障礙的成年大鼠具有保護作用。

藍莓果汁加工是目前最主要的藍莓加工方法。NFC 果汁即非濃縮還原果汁（Not-From-Concentrate，縮寫為NFC），是采用新鮮水果直接榨汁所得100%純鮮果汁。國外藍莓NFC 果汁的研究主要集中在藍莓汁營養(yǎng)和功能活性評價、殺菌方式對品質(zhì)的影響等方面。Barba 等[5]研究了超高壓和脈沖電場處理后藍莓汁4 ℃冷藏過程的品質(zhì)變化。Reque 等[6]研究了藍莓全果汁4 ℃冷藏花青素穩(wěn)定性和抗氧化活力。Bett-Garber 等[7]研究了藍莓汁的糖、酸、花青素和抗氧化能力等與風味的相關(guān)性。藍莓果實富含果膠等黏性物質(zhì)，影響出汁率和果汁品質(zhì)，且藍莓果汁加工中易由多酚氧化酶（polyphenol，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）引發(fā)嚴重的酶促褐變，因此酶促褐變控制和酶解液化等預處理對NFC 果汁品質(zhì)至關(guān)重要。國內(nèi)果漿酶解研究集中在酶解條件[8-12]、藍莓汁酶促褐變控制（如蒸汽熱燙[13]、抑制劑處理[14]）等方面。有關(guān)藍莓酶促褐變的抑制研究未全面評價熱燙處理對藍莓品質(zhì)的影響，果漿酶解缺乏高效酶制劑的篩選及酶解前、后的出汁率、可溶性固形物、花色苷含量及揮發(fā)性香氣成分的系統(tǒng)評價。本文開展熱燙處理鈍酶、高效酶制劑篩選制汁等預處理加工對NFC 藍莓汁品質(zhì)的影響研究，以期為研發(fā)高品質(zhì)藍莓NFC 果汁提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為成熟的粉藍 （兔眼藍莓一號）果實，采自湖南省長沙縣路口鎮(zhèn)的星城明月生態(tài)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司的藍莓基地。

1.2 儀器、設備及試劑

1.2.1 儀器、設備 紫外分光光度計（UV-1800），日本Shimadzu 儀器有限公司；冷凍離心機（Avanti J-26XP），美國貝克曼庫爾特有限公司；電子天平（AL204），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；組織搗碎勻漿機（JJ-2），常州國華儀器有限公司；pH 計（Mettler Toledo Delta 320），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9160），上海精密科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS24），上海一恒科技有限公司。

1.2.2 試劑 果膠酶（A，B，C，D 4 種，酶活均為50 000 U/g），纖維素酶（100 000 U/g）；其它化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；超純水（18MΩ）Millipore Milli QRG 超純水系統(tǒng)制備。

1.3 方法

1.3.1 藍莓熱處理滅酶方法 每組取40 個鮮果，在不同溫度熱水（料液比1∶20）中進行燙漂滅酶處理，處理參數(shù)為100 ℃（0.5，1.0，1.5，2.0 min），90℃（0.5，1.0，1.5，2.0 min），80 ℃（1.0，1.5，2.0，3.0 min），藍莓熱處理后迅速降溫至10 ℃以下，-80℃凍藏備用。

1.3.2 藍莓果漿酶解方法 果膠酶酶解方法：藍莓果實自然解凍后，經(jīng)高速搗碎機勻漿處理，冷藏備用。稱取250 g 藍莓果漿，按質(zhì)量分數(shù)0.3%的比例加入不同種果膠酶，（48±1）℃酶解60 min，酶解后的果漿經(jīng)5 000 r/min 離心20 min 后獲得藍莓原果汁。以常溫不酶解為對照。

復合酶酶解方法：控制酶制劑總添加量為0.3%，優(yōu)選的果膠酶與纖維素酶添加比例分別為（4∶1，3∶1，2∶1，1∶1），以常溫不酶解和果膠酶為對照。

1.3.3 破損率 以果實表皮破損，果肉軟爛為破損果。計算公式：

1.3.4 出汁率 酶解后獲得的果汁質(zhì)量占原果漿比例。計算公式：

1.3.5 PPO 和POD 活性的測定[15]取藍莓果漿2.0 g，加入10 mL 已預冷的0.05 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0）進行勻漿，于4 ℃下15 000 g 離心20 min，收集上清液用于酶活性測定。

POD 活性的測定：3 mL 反應液包括：質(zhì)量分數(shù)4.0%的愈創(chuàng)木酚0.1 mL，質(zhì)量分數(shù)0.46%的H2O20.1 mL，0.2 mol/L 的pH 7.0 磷酸緩沖液2.75 mL 和酶液0.05 mL。加入酶液測定OD470變化，以每分鐘OD470升高0.01 表示一個酶活性單位。以緩沖液調(diào)零，依次加緩沖液，愈創(chuàng)木酚，酶液，最后加H2O2快速混勻，連續(xù)讀取3 min。

式中，Vt——提取酶液總體積，mL；W——樣品質(zhì)量，g；Vs——測定酶液體積，mL；t——反應時間，min。

PPO 活性的測定：3 mL 反應液中含有：0.05 mol/L 的pH 7.0 磷酸緩沖液1.5 mL 和0.05 mol/L鄰苯二酚溶液1.0 mL，最后加入酶提取液0.5 mL，以緩沖液為參比，連續(xù)測定3 min，以每分鐘內(nèi)OD410升高0.01 為一個單位。

式中，Vt——提取酶液總體積，mL；W——樣品質(zhì)量，g；Vs——測定酶液體積，mL；t——反應時間，min。

1.3.6 花色苷測定方法[16]藍莓鮮果稱取果漿2.0 g 于50 mL 離心管中，加入20 mL 體積分數(shù)60%的乙醇溶液浸提后離心，收集上清液后，再次加入20 mL 體積分數(shù)60%的乙醇溶液浸提離心，合并兩次上清液，吸取1 mL 清液于9 mL 的緩沖液測定花色苷含量；藍莓汁直接吸取1 mL 清液于9 mL 的緩沖液測定花色苷含量。

以上各指標測定均重復3 次，結(jié)果以平均值±標準差表示。

1.3.7 揮發(fā)性香氣成分的測定 以藍莓復合酶（4∶1）酶解汁和對照（未酶解汁）為樣本，樣本制備方法：取10 mL 藍莓汁樣品置于20 mL 的頂空瓶中，加入1.5 g NaCl。

GC-MS 條件：色譜柱HP-5MS （30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度250 ℃；初始溫度40℃（3 min）；3 ℃/min 程序升溫至160 ℃（2 min），再以8 ℃/min 程序升溫至220 ℃（10 min）；載氣He，流速1.67 mL/min，無分流進樣，進樣量1 μL。

MS 條件：離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150℃；EI 電離源：電子能量70 eV；掃描范圍33～550 u。

定性定量法：由GC-MS 檢測藍莓汁的香氣離子流色譜峰所對應的質(zhì)譜圖，經(jīng)NIST 譜庫檢索，保留匹配度大于80%的藍莓汁的香氣成分，Chemical Book 網(wǎng)站對比及分析，采用面積歸一法計算藍莓汁香氣成分的相對含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 所有圖表繪制采用Origin 8 和Excel 2003 進行處理；利用SPSS 16.0 進行顯著性分析，置信概率為0.95，P＜0.05 為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱水燙漂對藍莓品質(zhì)的影響

熱水燙漂的主要目的是使藍莓內(nèi)源性酶失活，防止發(fā)生酶促褐變。水果的酶促褐變反應主要是由酶、O2及酚類物質(zhì)為底物的一系列反應系統(tǒng)，PPO 和POD 是導致藍莓汁褐變的關(guān)鍵因素[14，17]。藍莓汁加工過程中，被氧化的酚類物質(zhì)及發(fā)生降解的花色苷附著結(jié)合，產(chǎn)生黑褐色絮狀沉淀，嚴重影響外觀和品質(zhì)。確定藍莓最佳的熱燙工藝，既有效控制PPO 和POD 活性，又減少藍莓的功效成分損失，對保護藍莓汁的天然色澤和營養(yǎng)價值尤為重要。

2.1.1 熱水燙漂對藍莓感官品質(zhì)的影響 從表1可以看出，處理溫度越高，處理時間越長，藍莓果皮完整度下降，組織變軟，破損率增高。100 ℃處理1 min 能較好地保證藍莓的果皮完整和果肉的組織完好，破損率5%；90 ℃下處理時間1.5 min 內(nèi)能較好地保持果皮完整和組織狀態(tài)，破損率10%；80 ℃下處理3 min 果皮較完整，組織偏軟，無破損。因此，從控制藍莓營養(yǎng)成分流失方面考慮，較適宜的熱水處理溫度及時間100 ℃處理1 min，90℃處理1.5 min，80 ℃處理3 min 均能控制藍莓破損率在10%以內(nèi)。

表1 熱水燙漂對藍莓感官品質(zhì)的影響Table 1 Effect of blanching on sensory quality of blueberries

2.1.2 熱水燙漂對藍莓PPO 和POD 的影響 PPO是呼吸鏈末端氧化酶之一，藍莓的PPO 在果汁加工過程中能催化多酚類物質(zhì)氧化、聚合形成黑褐色物質(zhì)而導致酶促褐變，不僅使果汁色澤變暗，且降低了藍莓汁的生物學功效，嚴重影響藍莓汁的商品價值[18]。POD 與果蔬產(chǎn)品及其制品的變色和變味關(guān)系密切[19]。同時，POD 酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度[20]。

由圖1可知，熱水熱燙可使藍莓PPO、POD 活性顯著降低，且不同處理間差異顯著（P＜0.05）。熱水熱燙對PPO、POD 活性的抑制作用受溫度影響較大，當熱燙時間1 min 時，80 ℃時POD 殘余酶活力降至30%以下，100 ℃時POD 殘余酶活力降至4.9%，接近失活。此結(jié)果與劉小莉等[21]的研究結(jié)果一致。這可能是由于藍莓中PPO 酶熱穩(wěn)定性較低，在熱水熱燙作用下迅速失去活性。當熱燙溫度80 ℃處理1 min，POD 殘余酶活力均在30%以上，但當溫度達90 ℃時POD 殘余酶活力低于20%，100 ℃時POD 殘余酶活力低于15%，且隨熱燙時間延長，其相對殘余活性大大降低。果蔬熱燙過程中，熱燙時間延長有助于酶的鈍化作用，且不同果蔬品種酶的穩(wěn)定性也有較大差別。常用的酶熱抑活方法是水燙漂，且比蒸汽燙漂更有效。影響酶熱失活的因素主要是溫度和受熱時間，熱處理足夠長的時間會使PPO 和POD 失活更完全，但長時間加熱對保持果蔬的營養(yǎng)和風味不利。Vamos[22]報道POD 酶有較高的熱穩(wěn)定性，因此常以POD 酶是否失活作為熱燙是否充分的標準。李星賀等[23]采用超高壓鈍化藍莓汁中PPO 和POD 兩種褐變酶，POD 失活所需溫度較PPO 高。由以上分析可知，藍莓POD 滅活需要較長時間，因此POD 較PPO熱穩(wěn)定性高。

圖1 熱燙處理對藍莓PPO 和POD 酶活的影響Fig.1 Effect of blanching on PPO and POD activities of blueberry

2.1.3 熱水燙漂對藍莓花色苷影響 花色苷對果汁品質(zhì)、身體健康都有重要作用，Kim 等[24]研究發(fā)現(xiàn)藍莓功能飲料的功能信息對消費者的健康要求感知產(chǎn)生了積極的影響，如消費者對“緩解眼部疲勞”的認知，因此藍莓汁加工中花色苷的保留具有重要價值。但果蔬中的花青素極不穩(wěn)定，其降解主要與吡咯環(huán)的開放和查爾酮的形成有關(guān)。查耳酮的形成是花青素降解的第一步，之后繼續(xù)降解，形成化合物如間苯三酚醛和原兒茶酸，降解影響其生物活性[25]?；ㄇ嗨厥芗庸l件包括pH、溫度、光、氧以及酶和金屬離子的影響。

從圖2可以看出，熱燙溫度越高，花色苷含量損失越大，同一溫度下，隨著熱燙時間延長，花色苷含量呈下降趨勢。因此，綜合熱處理對藍莓感官品質(zhì)、褐變酶控制及花色苷保留的研究結(jié)果，選擇較適宜的熱處理工藝為80 ℃下保持2.0 min，果皮較完整、無破損，營養(yǎng)成分及功效成分流失少，褐變相關(guān)酶活基本被抑制。

2.2 藍莓NFC 果汁的酶解預處理研究

圖2 熱水燙漂對藍莓花色苷的影響Fig.2 Effect of blanching on anthocyanin of blueberry

2.2.1 藍莓果汁加工的適宜果膠酶篩選 果膠酶可以催化果膠中的甲酯水解，將多半乳糖醛酸分解成較小分子多聚物。藍莓汁中含有果膠，果汁黏度大導致果汁的出汁率降低，果膠酶處理后能釋放出更多的藍莓汁，并促進花色苷的溶出，降低黏度，果汁與果渣更易分離，提高出汁率和生產(chǎn)能力[8]。Yamasaki 等[26]研究表明果蔬汁中的果膠在果膠酶的作用下發(fā)生部分水解，使果汁黏度降低。Sandri 等[27]研究了一株新黑曲霉所產(chǎn)果膠酶應用于藍莓汁的酶處理。

從圖3可以看出，藍莓果漿經(jīng)不同的果膠酶處理后，藍莓汁的出汁率、可溶性固形物和花色苷含量明顯上升，在藍莓果漿的酶解工藝中宜采用B 酶制劑，其處理后的藍莓出汁率、固形物含量及花色苷含量最高，增加藍莓汁的營養(yǎng)性及功能性。

2.2.2 復合酶制劑對藍莓果汁的影響 纖維素酶可將纖維素中的β-1，4 糖苷鍵水解，生成可溶性的聚合物、寡糖、β 糊精、二糖和D-葡萄糖等[27]。果膠酶和纖維素酶復合酶解，不僅有助于植物細胞壁的降解，提高果蔬出汁率，同時可增加果蔬汁中可溶性固形物及功效成分的含量。

圖3 不同果膠酶對藍莓汁的影響Fig.3 Effects of different pectinases on blueberry juice

表2 不同比例復合酶對藍莓汁的影響Table 2 Effects of different proportion of complex enzymes on blueberry juice

由表2可知，當果膠酶與纖維素酶比例為1∶1～4∶1 時，出汁率與可溶性固形物隨果膠酶的增加而增大，果膠酶∶纖維素酶4∶1 時的出汁率最高為（81.8±1.5）%，可溶性固形物最高為（11.6±0.1）°Brix。相比對照，果膠酶∶纖維素酶4∶1 處理的藍莓出汁率提高了15.9%。在酶制劑總量一定的條件下，果膠酶B 單獨處理的出汁率（76.2±1.7）%，復合酶4∶1 處理提高藍莓出汁率5.6%。此結(jié)果與菅蓁等[10]的研究相比，酶用量0.3%一致的條件下，出汁率提高19.75%。藍莓果實中的花色苷主要分布在果皮中，結(jié)合在果皮細胞壁中，經(jīng)過復合酶處理后，花色苷溶出果汁，其含量顯著上升，提高了約1.9 倍，程紅等[18]報道復合酶解后花色苷含量增加1.5 倍。因此復合酶處理選擇果膠酶與纖維素酶比例4∶1 為宜。

2.2.3 藍莓汁酶解前后果汁的香氣成分變化 果膠酶和纖維素酶同時作用，不僅可以降解植物細胞壁提高出汁率和營養(yǎng)價值，而且能釋放出內(nèi)源酶，使之與風味前體物反應，提升風味及香氣強度[10，27]。藍莓汁酶解前后香氣成分的檢測結(jié)果見圖4，表3。圖4是藍莓酶解汁及未酶解汁的香氣成分總離子流色譜圖，從圖可以看出酶解前后的藍莓汁香氣成分有較大相似性。

表3是藍莓酶解汁及未酶解汁的GC-MS 分析結(jié)果。從表3可以看出，藍莓未酶解汁與酶解汁共檢出酯類、烯烷類、醇類、酮類、醛類和羧酸類、雜環(huán)類共59 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類11 種、烯烷類8 種、醇類16 種、酮類8 種、醛類7 種、羧酸類3 種、雜環(huán)類6 種。藍莓未酶解汁香氣成分為45種，占峰面積的88.41%，酶解汁香氣成分為42種，占峰面積的90.59%。藍莓未酶解汁、酶解汁相對峰面積超過10%的組分有乙酸乙酯 （分別為25.17%，30.36%）和異戊酸乙酯（分別為13.35%，15.2%）。

圖4 未酶解藍莓汁（上）與酶解汁（下）的GC-MS 總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of GC-MS for volatile components in un-enzymatic juice （top）and enzymatic juice （bottom）

表3 藍莓未酶解汁和酶解汁的香氣成分GC-MS 分析Table 3 GC-MS analysis results of the volatile components in un-enzymatic and enzymatic juice of blueberry

（續(xù)表3）

圖5 藍莓未酶解汁和酶解汁的各類風味物質(zhì)相對含量Fig.5 Relative contents of flavor components in un-enzymatic and enzymatic juice of blueberry

從圖5可以看出：藍莓汁酶解后酯類含量明顯上升，增加了20%，主要是乙酸乙酯、異戊酸乙酯和鄰苯二甲酸二丁酯含量增高，同時增加了乙酸異戊酯和苯甲酸乙酯新成分。這與Essa 等[28]研究結(jié)果基本一致，其采用果膠酶和纖維素酶酶解刺梨汁，發(fā)現(xiàn)風味品質(zhì)明顯提高，乙酸乙酯和內(nèi)酯等特征香氣成分的含量增加。烯烷類、酮類、醛類和羧酸類、雜環(huán)類均有不同程度增加；醇類含量降低了33.41%，氧化芳樟醇、芳樟醇、香葉醇、苯乙醇、2-乙基-1-己醇等含量增加明顯。文獻報道芳樟醇與香葉醇等物質(zhì)對于構(gòu)成藍莓特有香氣起重要作用[29]。

水果的風味不同主要由酯類、烯烷類、醇類和醛類等揮發(fā)性物質(zhì)組成決定?？傮w來說，未酶解汁與酶解汁的揮發(fā)性成分相對含量變化較小，整體上保留了藍莓果汁香氣的穩(wěn)定性和協(xié)調(diào)性，同時有部分潛在的香氣成分釋放，酶解后的藍莓汁香氣成分增加2.18%，增加了果汁中的芳香物質(zhì)含量，強化了藍莓汁的香氣，起到增香的效果。本研究的酶解增香效果與關(guān)小鶯等[30]研究的南高叢藍莓濁汁酶解前后揮發(fā)性成分變化存在差異，可能與藍莓原料、酶用量及酶解汁滅酶條件等不同有關(guān)。

3 結(jié)論

酶促褐變控制及酶解高效制汁等預處理對藍莓NFC 果汁加工至關(guān)重要，本研究開展熱水燙漂參數(shù)對藍莓品質(zhì)的影響，結(jié)果表明80 ℃熱燙2 min 對控制藍莓褐變酶活性和保留花色苷功效成分具有較好的效果。優(yōu)選的果膠酶和纖維素酶按4∶1 的比例應用于藍莓的酶解處理，出汁率高達（81.8±1.5）%，可溶性固形物相比未酶解提高1.4°Brix，花色苷含量是未酶解的1.92 倍，酶解后的果汁香氣成分也略有增加，起到增香的效果。

NFC 果汁非常適于現(xiàn)代都市生活的流行趨勢，并且可以迅速成為人們的新寵。藍莓果汁加工采用熱水燙漂鈍化褐變酶活性是簡單有效的方法，但熱處理對藍莓營養(yǎng)價值造成一定損失。果汁加工中酶促褐變主要發(fā)生在破碎、壓榨工序[31]，因此采用有效的冷加工處理方法是未來的研究方向，如低溫打漿或充氮打漿等措施控制果汁的酶褐變，避免營養(yǎng)品質(zhì)的損失。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，生物酶解技術(shù)將會越來越多地應用于藍莓NFC 果汁加工，在提高藍莓出汁率的同時達到增香和增味作用，使藍莓汁的營養(yǎng)、風味與功效性成分完全釋放，提升藍莓果汁品質(zhì)。