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    酶解制備竹筍可溶性膳食纖維及其抗氧化活性研究

    2021-04-22 06:25:28萬仁口賀楊正李功景李紅艷鄧澤元
    中國食品學報 2021年3期
    關鍵詞:竹筍清除率光度

    萬仁口,賀楊正,李功景,張 兵,李紅艷,鄧澤元

    (南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室 南昌330047)

    竹筍一般是指竹鞭或稈基上萌發(fā)分化而成的膨大的芽和幼嫩的莖[1-2],其種類繁多,分布廣泛,主要盛產于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)。其肉質鮮嫩,甜脆爽口,具有很長的食用歷史,是一種深受人們喜愛的純天然綠色健康食品[3-4]。竹筍含有蛋白質、多糖、氨基酸、維生素、礦物質等營養(yǎng)物質,具有一定的營養(yǎng)作用[5-7]。特別是竹筍含有豐富的膳食纖維,在腸內可減少人體對脂肪的吸收,有潤腸、加強胃腸蠕動、去積食、防便秘[8]等特性,因此具有預防結腸癌等腸道疾病的作用;長期攝食膳食纖維可以降低心血管疾病、糖尿病、肥胖和胃腸道疾病的風險[7,9]。竹筍含有甾醇如β-谷甾醇,是一種強生理活性物質,具有降血脂、抗腫瘤、防治心臟病和抑制白血病細胞生長等生理功能[1,10]。竹筍還含有黃酮類物質,它是植物的次級代謝產物,具有保護人體血管的功能[11]。竹筍是堿性食物,能中和人體代謝過程中留在體液中的酸性物質,提高人體的抗病能力。中醫(yī)認為竹筍性甘、微寒,能清熱去痰,對咳嗽、高血壓、便秘、糖尿病等均具有一定療效,被譽為“素食第一品”,具有一定藥用價值和保健功效。

    膳食纖維可以作為功能食品的原材料[12],根據(jù)水溶性的不同,分為可溶性膳食纖維(SDF)和不溶性膳食纖維(IDF)兩種[13-14]。竹筍膳食纖維中SDF 的比例是影響其生理功能的主要因素,高品質的膳食纖維SDF 含量高,而通常天然纖維中SDF 的含量僅為3%~5%,嚴重限制了其在食品工業(yè)的運用[15]。為了獲得高品質的高生物活性的膳食纖維,需對原料進行改性處理[16-17]。膳食纖維的改性技術主要有化學改性、生物改性及物理改性3 種[18-19]。酶解法是生物改性技術的一種,因其反應溫和、污染物較少而使用較為廣泛[20-21]。

    本研究采用酶解法來制備竹筍可溶性膳食纖維,以纖維素酶為水解酶,通過單因素和正交試驗優(yōu)化酶解pH 值、酶解溫度、酶添加量和酶解時間等工藝條件,同時考察竹筍膳食纖維乙醇提取液對DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率及鐵還原能力的影響,為高附加值開發(fā)竹筍提供試驗數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    竹筍,江西廣雅食品有限公司;纖維素酶,南寧龐博生物工程有限公司;胰酶、糖化酶、α-淀粉酶、DPPH,阿拉丁試劑有限公司;MES、TRIS,索萊寶生物科技有限公司;無水乙醇、無水甲醇,上海西隴化工股份有限公司。

    1.2 儀器與設備

    K9860 自動凱氏定氮儀,海能儀器器械有限公司;SX2 型馬弗爐,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;SXT-06 索氏提取器,上海洪記儀器設備有限公司;SHZ-A 水浴恒溫振蕩器,上海博訊實驗有限公司醫(yī)療設備廠;酶標儀,美國博騰儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 竹筍的成分測定 水分含量按GB5009-2010 中的直接干燥法測定,蛋白質含量按GB5009.5-2016 中的自動凱氏定氮法測定,灰分含量按GB5009.4-2016 測定,粗脂肪含量按GB5009.6-2016 中的索氏提取法測定,膳食纖維含量按GB5009.88-2014 測定,總糖以及甾醇含量的測定分別采用苯酚硫酸法和有機溶劑提取法。

    1.3.2 酶改性法制備竹筍可溶性膳食纖維

    1.3.2.1 單因素試驗 準確稱取5 g 竹筍樣品于500 mL 高腳燒杯中,加入0.05 mol/L MES-TRIS緩沖液200 mL,依次加入250 μL α-淀粉酶、500 μL 糖化酶以及0.225 g 胰酶于60 ℃恒溫振蕩水浴環(huán)境中分別反應30 min,以去除淀粉、脂質以及蛋白質[22-23]。而后添加纖維素酶于一定條件下(pH、酶解溫度、酶添加量、酶解時間)繼續(xù)酶解,測定竹筍SDF。

    1.3.2.2 正交試驗 根據(jù)單因素優(yōu)化試驗結果,選擇上述4 個因素,以L9(34)正交表進行正交試驗,以進一步優(yōu)化酶解條件。

    1.3.3 膳食纖維的抗氧化性

    1.3.3.1 樣品處理 稱取一定質量的SDF、IDF 以及TDF 于50 mL 離心管中,并用50%乙醇定容至刻度以配成質量濃度為0.625~20 mg/mL 的混合液。將其置于60 ℃恒溫水域搖床振蕩4 h,而后于4 000 r/min 的轉速下離心15 min,上清液即為乙醇提取液,分別記做SDFE,TDFE,IDFE。

    1.3.3.2 DPPH 自由基的清除能力[24]分別在10 mL 的具塞試管中加入2 mL 質量濃度為0.065 mg/mL 的DPPH 溶液,再加2 mL 的SDFE,TDFE,IDFE溶液或Trolox(BHT)溶液,充分振搖混勻,在暗處靜置30 min 后移取100 μL 反應液至96 孔板,在517 nm 下測定吸光度值。以2 mL 樣品溶液加入2 mL 無水乙醇作為對照,以2 mL DPPH 溶液加入2 mL 溶劑作為空白,計算對DPPH 自由基的清除率。其對DPPH 自由基的清除能力按以下公式計算:

    清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100

    式中:Ai——DPPH 溶液+樣品溶液的吸光度值;Aj——樣品溶液+無水乙醇的吸光度值;Ao——DPPH 溶液+無水乙醇的吸光度值。

    1.3.3.3 ABTS+自由基清除能力[25]取5.0 mL 7 mmol/L 的ABTS+溶液,加入88.0 μL 140 mmol/L的K2S2O8,在室溫下置于暗處反應12~16 h,形成ABTS+自由基儲備液,而后用體積分數(shù)80%的甲醇稀釋ABTS+自由基儲備液備用。準確量取0.1 mL的SDFE,TDFE,IDFE溶液或Trolox(BHT)溶液,加入3.9 mL ABTS+溶液,混勻,在室溫下反應6 min,于734 nm 處測定吸光度AE。同時吸取3.9 mL ABTS+溶液,加入0.1 mL 體積分數(shù)80%的甲醇溶液于734 nm 處測定吸光度AB。其對ABTS+自由基清除率按以下公式計算:

    清除率(%)=[1-(AE-AK)/AB]×100

    式中:AE——ABTS+溶液+樣品溶液的吸光度值;AK——樣品溶液+80%甲醇溶液的吸光度值;AB——ABTS+溶液+80%甲醇溶液的吸光度值。

    1.3.3.4 鐵還原能力(FRAP)測定[26]分別在10 mL 的具塞試管中移取SDFE,TDFE,IDFE溶液或Trolox (BHT)溶液100 μL,加入預熱至37 ℃的FRAP 工作液1.8 mL,搖勻置37 ℃恒溫水域反應30 min,反應后分別移取100 μL 反應液置96 孔板中,用酶標儀在593 nm 處測定其吸光度值,同時進行空白試驗。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

    2 結果與分析

    2.1 竹筍中的主要成分

    竹筍中主要成分含量如表1所示。竹筍中的水分以及總糖含量是影響其老嫩程度、滋味口感的兩個重要影響因素,總糖及水分含量越高,竹筍的口感越好,品質越佳[27-28]。由表可知,竹筍的水分含量為95.20%,高于小佛肚竹筍(90.90%)[29]、云南箭竹(93.43%)[28]等大多數(shù)竹筍;總糖含量為14.32%,含量較小佛肚竹筍(16.04%)低,略高于云南箭竹(11.80%),但遠高于文獻所報道的常見蔬菜(2.00%~5.40%)的含量。由此可見該竹筍的品質較高,鮮嫩、口感較好。蛋白質和粗脂肪含量分別為28.20%和4.31%,蛋白質的含量高而粗脂肪含量低,表明竹筍是一種含有豐富蛋白質,天然低脂、低熱量的健康食物。竹筍中還含有甾醇(29.00 mg/100 g)。膳食纖維是竹筍的主要組成成分,總膳食纖維占干竹筍質量的70.06%,其中IDF為64.53%,SDF 為5.53%,IDF/SDF 為11.722,可溶性膳食纖維的含量較低。綜上所述,竹筍是一種含有豐富蛋白質、膳食纖維以及其它生物活性物質且鮮嫩度高、口感好的食材。

    表1 竹筍主要成分Table 1 The composition of bamboo shoots

    2.2 酶改性工藝的選擇

    2.2.1 單因素試驗

    2.2.1.1 pH 值對SDF 含量的影響 以竹筍粉末為原料,纖維素酶作為水解酶,酶解溫度為60℃,酶解時間為1 h,酶添加量為0.1%,pH 分別為3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5 時,測定不同pH 值下酶解竹筍粉末SDF 的含量,以確定纖維素酶最佳的酶解pH 值。

    不同pH 值酶解獲得可溶性膳食纖維的含量如圖1所示,當pH 3.5 時含量最低,而后隨著pH的不斷上升,SDF 含量有顯著的增加。pH 4.5 時達到最高,約為7.5%,之后隨著溶液酸性減弱,SDF 的含量也相應降低。pH 通過影響纖維素酶的活性影響可溶性膳食纖維的含量,當pH 在4.5 左右時,纖維素酶活性最佳,酶解效果最好,所以選擇提取液pH 4.5 做進一步試驗。

    2.2.1.2 酶解溫度對SDF 含量的影響 酶解溫度分別設定為30,40,50,60,70 ℃,酶解時間1 h,酶添加量為0.1%,pH 為4.5,通過測定SDF 含量來研究不同酶解溫度對纖維素酶酶解竹筍反應的影響。

    圖1 不同酶解pH 值對竹筍SDF 含量的影響Fig.1 Effect of different pH values on SDF content

    圖2 不同酶解溫度對竹筍SDF 含量的影響Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on SDF content

    由圖2可見,隨著酶解溫度的升高,竹筍可溶性膳食纖維的含量也增加,直到溫度為50 ℃時達到最高值8.4%,而后隨著溫度的升高,其含量快速下降。酶的活性變化是影響SDF 含量的主要因素,當溫度較低時,酶的活性較弱,酶分解不溶性膳食纖維生產可溶性膳食纖維的效果較差,而后隨著溫度升高,酶活力不斷提升,到50 ℃左右達到纖維素酶的最適溫度,再升高溫度,酶逐漸失活,從而使SDF 含量下降[20]。因此,選擇纖維素酶的酶解溫度為50 ℃。

    2.2.1.3 酶添加量對SDF 含量的影響 酶的添加量用與底物質量百分比來衡量,酶用量選取0.1%,0.2%,0.5%,1%,2%,酶解溫度為50 ℃,酶解時間為1 h,pH 為4.5,通過測定SDF 含量,研究不同酶添加量對纖維素酶酶解竹筍反應的影響。

    由圖3可見,隨著酶添加量的增加,可溶性膳食纖維的含量先逐步增加而后趨于穩(wěn)定。當酶添加量為0.5%及以上時,其SDF 含量在10%附近浮動。當加酶量較低時,不溶性膳食纖維被纖維素酶降解,其中的不溶性半纖維素可酶解為可溶性半纖維素甚至變成葡聚糖,有效提高了SDF 的含量;當加酶量在高水平時,所得到的SDF 進一步水解,生成分子質量更低且不能被乙醇沉淀的糖類物質,降低了SDF 的得率[6]。選擇適量的加酶量可以維持IDF 和SDF 的水解平衡,使得SDF 的含量達到最大。因此,纖維素酶的添加量選擇0.5%最為合理。

    2.2.1.4 酶解時間對SDF 含量的影響 酶解時間分別取1,2,3,4,5 h,酶解溫度設定為50 ℃,酶添加量0.5%,pH 為4.5,通過測定SDF 含量,研究不同酶解時間對纖維素酶酶解反應的影響。

    不同酶解時間對可溶性膳食纖維含量的影響如圖4所示,酶解時間為3 h 最佳,SDF 的含量最高可達10.8%。酶解時間短,則酶解不完全;酶解時間過長,SDF 會進一步降解而導致含量降低。因此,選擇酶解時間為3 h。

    2.2.2 正交試驗 根據(jù)單因子試驗結果,正交試驗的設計為pH 值、酶解溫度、酶添加量、酶解時間等4 個因素,每個因素3 個水平,見表2。

    正交試驗結果見表3,根據(jù)極差R 值可以看出,影響SDF 含量大小的因素排序為:D>C>B>A。酶解時間的影響最大,酶解pH 值的影響最小。根據(jù)各因素k 值和直觀比較,最佳工藝條件為A3B1C3D3,即SDF 最佳的酶解工藝為:pH 值為5.0,酶解溫度45 ℃,酶添加量0.7%,酶解時間3.5 h。

    圖3 不同酶添加量對SDF 含量的影響Fig.3 Effect of different enzyme additions on SDF content

    圖4 不同酶解時間對SDF 含量的影響Fig.4 Effect of different enzymatic hydrolysis time on SDF content

    表2 正交試驗因素水平表Table 2 Orthogonal experimental factor-level table

    2.3 竹筍膳食纖維的抗氧化活性

    2.3.1 DPPH 自由基的清除能力 DPPH·是一種能夠在室溫條件下保持穩(wěn)定的有機自由基,當抗氧化劑或供氫體出現(xiàn)時,穩(wěn)定的自由基變成DPPH-H[30]。不同纖維濃度提取液SDFE、TDFE、IDFE、BHT 和Trolox 的DPPH 自由基清除率如圖5所示,在纖維質量濃度為0.625 mg/mL 時,BHT 和Trolox 抗氧化劑的DPPH·清除率為80%~90%,而SDFE、TDFE、IDFE三者DPPH 自由基的清除率分別為21%,7.0%和6.7%。隨著纖維濃度的升高,兩種抗氧化劑的清除率迅速趨于100%,表現(xiàn)出極強的抗氧化性。SDFE、TDFE、IDFE的清除能力隨著濃度的升高呈明顯上升趨勢,在質量濃度為20 mg/mL 時,SDFE的DPPH·清除率可達75.77%,明顯高于TDFE(16.9%)以及IDFE(14%),表明高纖維濃度SDFE對DPPH·有較強的清除能力,3 種膳食纖維乙醇提物在相同纖維濃度下的DPPH·清除能力大小順序為SDFE>TDFE>IDFE。

    表3 正交試驗設計及其結果Table 3 Orthogonal experimental design and its results

    2.3.2 ABTS+自由基清除能力 ABTS+自由基被廣泛應用于樣品的總抗氧化能力的測定,當樣品中存在抗氧化成分時,反應體系顏色變淺,在734 nm 處吸光度降低,吸光度越低,表明所檢測物質的總抗氧化能力越強[31]。圖6結果顯示,隨竹筍纖維濃度的增加,SDFE、TDFE、IDFE清除ABTS+自由基能力逐漸增強,且呈一定正相關性,但其清除率明顯低于BHT 和Trolox。在纖維質量濃度為20 mg/mL 時,SDFE、TDFE、IDFE的ABTS+清除率分別可達70.2%,30.0%和13.1%,在同等纖維濃度下,SDF 提取物的清除能力明顯優(yōu)于TDF 和IDF 的醇提取物,即ABTS+清除率能力大小規(guī)律為SDFE> TDFE> IDFE。

    圖5 不同纖維濃度乙醇提取液(SDFE、TDFE、IDFE)的DPPH 自由基清除率比較Fig.5 Comparison of DPPH· scavenging rate of ethanol extracts (SDFE,TDFE,IDFE)at different concentrations of dietary fiber

    圖6 不同纖維濃度乙醇提取液(SDFE、TDFE、IDFE)的ABTS+自由基清除率比較Fig.6 Comparison of ABTS+ scavenging rate of ethanol extracts (SDFE,TDFE,IDFE)at different concentrations of dietary fiber

    2.3.3 鐵還原能力測定 還原能力是衡量抗氧化物質能否高效提供電子的重要評價指標,還原能力強的樣品是良好的電子供體,可以通過提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的物質,以中斷自由基的連鎖反應。研究表明,抗氧化活性同還原力之間呈正相關關系,物質的吸光度越大,還原能力越強,其抗氧化能力也越高。由圖7可知,SDFE、TDFE、IDFE、BHT 和Trolox 抗氧化劑等5 種物質的吸光度值均與其質量濃度呈正相關,隨著濃度的升高還原能力也隨之增強。在相同濃度時,BHT 和Trolox 的總還原能力明顯優(yōu)于SDFE、TDFE、IDFE的還原能力,SDFE的鐵還原能力明顯優(yōu)于TDFE與IDFE,還原能力大小規(guī)律與DPPH·清除能力以及ABTS+清除能力一致。

    2.3.4 抗氧化指標的線性分析 竹筍SDFE,TDFE以及IDFE對DPPH 自由基和ABTS+自由基均有一定的清除能力,并隨質量的增加而增強,呈較強的線性關系,R2均在0.876~0.968 之間,但不同膳食纖維抗氧化指標的IC50差別較大。

    在還原力試驗中,吸光度值越高,表示還原能力越強。由表4可知,竹筍3 種膳食纖維提取物均具有一定的還原能力,并呈現(xiàn)出與其它兩種抗氧化指標相似的規(guī)律,隨著樣品質量濃度的增加而增強,且有很大的相關性,R2分別為0.9875,0.9278 和0.9189。

    圖7 不同纖維濃度乙醇提取液(SDFE、TDFE、IDFE)的鐵還原能力比較Fig.7 Comparison of FRAP assay of ethanol extracts(SDFE,TDFE,IDFE)at different concentrations of dietary fiber

    表4 SDFE、TDFE、IDFE 抗氧化指標的線性分析Table 4 Linear analysis of antioxidant indices of SDFE,TDFE,IDFE

    3 結論

    竹筍中的蛋白質含量高達28.2%,且其氨基酸種類豐富;膳食纖維的量為70%,但可溶性膳食纖維的含量僅為5.53%。采用纖維素酶解法對竹筍進行改性處理,對酶解的pH 值、酶解溫度、酶的添加量以及酶解時間進行單因素試驗和正交試驗,得出最佳的pH 值為5.0;酶解的最適溫度為45 ℃;酶的適宜添加量為0.7%;最佳酶解時間為3.5 h。竹筍膳食纖維乙醇提取液SDFE、TDFE以及IDFE均具有一定程度的抗氧化活性,且DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率以及鐵還原能力與纖維濃度均有較強的正相關性。

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