酶解制備竹筍可溶性膳食纖維及其抗氧化活性研究

萬仁口，賀楊正，李功景，張 兵，李紅艷，鄧澤元

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室 南昌330047）

竹筍一般是指竹鞭或稈基上萌發(fā)分化而成的膨大的芽和幼嫩的莖[1-2]，其種類繁多，分布廣泛，主要盛產于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)。其肉質鮮嫩，甜脆爽口，具有很長的食用歷史，是一種深受人們喜愛的純天然綠色健康食品[3-4]。竹筍含有蛋白質、多糖、氨基酸、維生素、礦物質等營養(yǎng)物質，具有一定的營養(yǎng)作用[5-7]。特別是竹筍含有豐富的膳食纖維，在腸內可減少人體對脂肪的吸收，有潤腸、加強胃腸蠕動、去積食、防便秘[8]等特性，因此具有預防結腸癌等腸道疾病的作用；長期攝食膳食纖維可以降低心血管疾病、糖尿病、肥胖和胃腸道疾病的風險[7，9]。竹筍含有甾醇如β-谷甾醇，是一種強生理活性物質，具有降血脂、抗腫瘤、防治心臟病和抑制白血病細胞生長等生理功能[1，10]。竹筍還含有黃酮類物質，它是植物的次級代謝產物，具有保護人體血管的功能[11]。竹筍是堿性食物，能中和人體代謝過程中留在體液中的酸性物質，提高人體的抗病能力。中醫(yī)認為竹筍性甘、微寒，能清熱去痰，對咳嗽、高血壓、便秘、糖尿病等均具有一定療效，被譽為“素食第一品”，具有一定藥用價值和保健功效。

膳食纖維可以作為功能食品的原材料[12]，根據(jù)水溶性的不同，分為可溶性膳食纖維（SDF）和不溶性膳食纖維（IDF）兩種[13-14]。竹筍膳食纖維中SDF 的比例是影響其生理功能的主要因素，高品質的膳食纖維SDF 含量高，而通常天然纖維中SDF 的含量僅為3%～5%，嚴重限制了其在食品工業(yè)的運用[15]。為了獲得高品質的高生物活性的膳食纖維，需對原料進行改性處理[16-17]。膳食纖維的改性技術主要有化學改性、生物改性及物理改性3 種[18-19]。酶解法是生物改性技術的一種，因其反應溫和、污染物較少而使用較為廣泛[20-21]。

本研究采用酶解法來制備竹筍可溶性膳食纖維，以纖維素酶為水解酶，通過單因素和正交試驗優(yōu)化酶解pH 值、酶解溫度、酶添加量和酶解時間等工藝條件，同時考察竹筍膳食纖維乙醇提取液對DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率及鐵還原能力的影響，為高附加值開發(fā)竹筍提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹筍，江西廣雅食品有限公司；纖維素酶，南寧龐博生物工程有限公司；胰酶、糖化酶、α-淀粉酶、DPPH，阿拉丁試劑有限公司；MES、TRIS，索萊寶生物科技有限公司；無水乙醇、無水甲醇，上海西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

K9860 自動凱氏定氮儀，海能儀器器械有限公司；SX2 型馬弗爐，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SXT-06 索氏提取器，上海洪記儀器設備有限公司；SHZ-A 水浴恒溫振蕩器，上海博訊實驗有限公司醫(yī)療設備廠；酶標儀，美國博騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 竹筍的成分測定 水分含量按GB5009-2010 中的直接干燥法測定，蛋白質含量按GB5009.5-2016 中的自動凱氏定氮法測定，灰分含量按GB5009.4-2016 測定，粗脂肪含量按GB5009.6-2016 中的索氏提取法測定，膳食纖維含量按GB5009.88-2014 測定，總糖以及甾醇含量的測定分別采用苯酚硫酸法和有機溶劑提取法。

1.3.2 酶改性法制備竹筍可溶性膳食纖維

1.3.2.1 單因素試驗 準確稱取5 g 竹筍樣品于500 mL 高腳燒杯中，加入0.05 mol/L MES-TRIS緩沖液200 mL，依次加入250 μL α-淀粉酶、500 μL 糖化酶以及0.225 g 胰酶于60 ℃恒溫振蕩水浴環(huán)境中分別反應30 min，以去除淀粉、脂質以及蛋白質[22-23]。而后添加纖維素酶于一定條件下（pH、酶解溫度、酶添加量、酶解時間）繼續(xù)酶解，測定竹筍SDF。

1.3.2.2 正交試驗 根據(jù)單因素優(yōu)化試驗結果，選擇上述4 個因素，以L9（34）正交表進行正交試驗，以進一步優(yōu)化酶解條件。

1.3.3 膳食纖維的抗氧化性

1.3.3.1 樣品處理 稱取一定質量的SDF、IDF 以及TDF 于50 mL 離心管中，并用50%乙醇定容至刻度以配成質量濃度為0.625～20 mg/mL 的混合液。將其置于60 ℃恒溫水域搖床振蕩4 h，而后于4 000 r/min 的轉速下離心15 min，上清液即為乙醇提取液，分別記做SDFE，TDFE，IDFE。

1.3.3.2 DPPH 自由基的清除能力[24]分別在10 mL 的具塞試管中加入2 mL 質量濃度為0.065 mg/mL 的DPPH 溶液，再加2 mL 的SDFE，TDFE，IDFE溶液或Trolox（BHT）溶液，充分振搖混勻，在暗處靜置30 min 后移取100 μL 反應液至96 孔板，在517 nm 下測定吸光度值。以2 mL 樣品溶液加入2 mL 無水乙醇作為對照，以2 mL DPPH 溶液加入2 mL 溶劑作為空白，計算對DPPH 自由基的清除率。其對DPPH 自由基的清除能力按以下公式計算：

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100

式中：Ai——DPPH 溶液+樣品溶液的吸光度值；Aj——樣品溶液+無水乙醇的吸光度值；Ao——DPPH 溶液+無水乙醇的吸光度值。

1.3.3.3 ABTS+自由基清除能力[25]取5.0 mL 7 mmol/L 的ABTS+溶液，加入88.0 μL 140 mmol/L的K2S2O8，在室溫下置于暗處反應12～16 h，形成ABTS+自由基儲備液，而后用體積分數(shù)80%的甲醇稀釋ABTS+自由基儲備液備用。準確量取0.1 mL的SDFE，TDFE，IDFE溶液或Trolox（BHT）溶液，加入3.9 mL ABTS+溶液，混勻，在室溫下反應6 min，于734 nm 處測定吸光度AE。同時吸取3.9 mL ABTS+溶液，加入0.1 mL 體積分數(shù)80%的甲醇溶液于734 nm 處測定吸光度AB。其對ABTS+自由基清除率按以下公式計算：

清除率（%）=[1-（AE-AK）/AB]×100

式中：AE——ABTS+溶液+樣品溶液的吸光度值；AK——樣品溶液+80%甲醇溶液的吸光度值；AB——ABTS+溶液+80%甲醇溶液的吸光度值。

1.3.3.4 鐵還原能力（FRAP）測定[26]分別在10 mL 的具塞試管中移取SDFE，TDFE，IDFE溶液或Trolox （BHT）溶液100 μL，加入預熱至37 ℃的FRAP 工作液1.8 mL，搖勻置37 ℃恒溫水域反應30 min，反應后分別移取100 μL 反應液置96 孔板中，用酶標儀在593 nm 處測定其吸光度值，同時進行空白試驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 竹筍中的主要成分

竹筍中主要成分含量如表1所示。竹筍中的水分以及總糖含量是影響其老嫩程度、滋味口感的兩個重要影響因素，總糖及水分含量越高，竹筍的口感越好，品質越佳[27-28]。由表可知，竹筍的水分含量為95.20%，高于小佛肚竹筍（90.90%）[29]、云南箭竹（93.43%）[28]等大多數(shù)竹筍；總糖含量為14.32%，含量較小佛肚竹筍（16.04%）低，略高于云南箭竹（11.80%），但遠高于文獻所報道的常見蔬菜（2.00%～5.40%）的含量。由此可見該竹筍的品質較高，鮮嫩、口感較好。蛋白質和粗脂肪含量分別為28.20%和4.31%，蛋白質的含量高而粗脂肪含量低，表明竹筍是一種含有豐富蛋白質，天然低脂、低熱量的健康食物。竹筍中還含有甾醇（29.00 mg/100 g）。膳食纖維是竹筍的主要組成成分，總膳食纖維占干竹筍質量的70.06%，其中IDF為64.53%，SDF 為5.53%，IDF/SDF 為11.722，可溶性膳食纖維的含量較低。綜上所述，竹筍是一種含有豐富蛋白質、膳食纖維以及其它生物活性物質且鮮嫩度高、口感好的食材。

表1 竹筍主要成分Table 1 The composition of bamboo shoots

2.2 酶改性工藝的選擇

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 pH 值對SDF 含量的影響 以竹筍粉末為原料，纖維素酶作為水解酶，酶解溫度為60℃，酶解時間為1 h，酶添加量為0.1%，pH 分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5 時，測定不同pH 值下酶解竹筍粉末SDF 的含量，以確定纖維素酶最佳的酶解pH 值。

不同pH 值酶解獲得可溶性膳食纖維的含量如圖1所示，當pH 3.5 時含量最低，而后隨著pH的不斷上升，SDF 含量有顯著的增加。pH 4.5 時達到最高，約為7.5%，之后隨著溶液酸性減弱，SDF 的含量也相應降低。pH 通過影響纖維素酶的活性影響可溶性膳食纖維的含量，當pH 在4.5 左右時，纖維素酶活性最佳，酶解效果最好，所以選擇提取液pH 4.5 做進一步試驗。

2.2.1.2 酶解溫度對SDF 含量的影響 酶解溫度分別設定為30，40，50，60，70 ℃，酶解時間1 h，酶添加量為0.1%，pH 為4.5，通過測定SDF 含量來研究不同酶解溫度對纖維素酶酶解竹筍反應的影響。

圖1 不同酶解pH 值對竹筍SDF 含量的影響Fig.1 Effect of different pH values on SDF content

圖2 不同酶解溫度對竹筍SDF 含量的影響Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on SDF content

由圖2可見，隨著酶解溫度的升高，竹筍可溶性膳食纖維的含量也增加，直到溫度為50 ℃時達到最高值8.4%，而后隨著溫度的升高，其含量快速下降。酶的活性變化是影響SDF 含量的主要因素，當溫度較低時，酶的活性較弱，酶分解不溶性膳食纖維生產可溶性膳食纖維的效果較差，而后隨著溫度升高，酶活力不斷提升，到50 ℃左右達到纖維素酶的最適溫度，再升高溫度，酶逐漸失活，從而使SDF 含量下降[20]。因此，選擇纖維素酶的酶解溫度為50 ℃。

2.2.1.3 酶添加量對SDF 含量的影響 酶的添加量用與底物質量百分比來衡量，酶用量選取0.1%，0.2%，0.5%，1%，2%，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為1 h，pH 為4.5，通過測定SDF 含量，研究不同酶添加量對纖維素酶酶解竹筍反應的影響。

由圖3可見，隨著酶添加量的增加，可溶性膳食纖維的含量先逐步增加而后趨于穩(wěn)定。當酶添加量為0.5%及以上時，其SDF 含量在10%附近浮動。當加酶量較低時，不溶性膳食纖維被纖維素酶降解，其中的不溶性半纖維素可酶解為可溶性半纖維素甚至變成葡聚糖，有效提高了SDF 的含量；當加酶量在高水平時，所得到的SDF 進一步水解，生成分子質量更低且不能被乙醇沉淀的糖類物質，降低了SDF 的得率[6]。選擇適量的加酶量可以維持IDF 和SDF 的水解平衡，使得SDF 的含量達到最大。因此，纖維素酶的添加量選擇0.5%最為合理。

2.2.1.4 酶解時間對SDF 含量的影響 酶解時間分別取1，2，3，4，5 h，酶解溫度設定為50 ℃，酶添加量0.5%，pH 為4.5，通過測定SDF 含量，研究不同酶解時間對纖維素酶酶解反應的影響。

不同酶解時間對可溶性膳食纖維含量的影響如圖4所示，酶解時間為3 h 最佳，SDF 的含量最高可達10.8%。酶解時間短，則酶解不完全；酶解時間過長，SDF 會進一步降解而導致含量降低。因此，選擇酶解時間為3 h。

2.2.2 正交試驗 根據(jù)單因子試驗結果，正交試驗的設計為pH 值、酶解溫度、酶添加量、酶解時間等4 個因素，每個因素3 個水平，見表2。

正交試驗結果見表3，根據(jù)極差R 值可以看出，影響SDF 含量大小的因素排序為：D>C>B>A。酶解時間的影響最大，酶解pH 值的影響最小。根據(jù)各因素k 值和直觀比較，最佳工藝條件為A3B1C3D3，即SDF 最佳的酶解工藝為：pH 值為5.0，酶解溫度45 ℃，酶添加量0.7%，酶解時間3.5 h。

圖3 不同酶添加量對SDF 含量的影響Fig.3 Effect of different enzyme additions on SDF content

圖4 不同酶解時間對SDF 含量的影響Fig.4 Effect of different enzymatic hydrolysis time on SDF content

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Orthogonal experimental factor-level table

2.3 竹筍膳食纖維的抗氧化活性

2.3.1 DPPH 自由基的清除能力 DPPH·是一種能夠在室溫條件下保持穩(wěn)定的有機自由基，當抗氧化劑或供氫體出現(xiàn)時，穩(wěn)定的自由基變成DPPH-H[30]。不同纖維濃度提取液SDFE、TDFE、IDFE、BHT 和Trolox 的DPPH 自由基清除率如圖5所示，在纖維質量濃度為0.625 mg/mL 時，BHT 和Trolox 抗氧化劑的DPPH·清除率為80%～90%，而SDFE、TDFE、IDFE三者DPPH 自由基的清除率分別為21%，7.0%和6.7%。隨著纖維濃度的升高，兩種抗氧化劑的清除率迅速趨于100%，表現(xiàn)出極強的抗氧化性。SDFE、TDFE、IDFE的清除能力隨著濃度的升高呈明顯上升趨勢，在質量濃度為20 mg/mL 時，SDFE的DPPH·清除率可達75.77%，明顯高于TDFE（16.9%）以及IDFE（14%），表明高纖維濃度SDFE對DPPH·有較強的清除能力，3 種膳食纖維乙醇提物在相同纖維濃度下的DPPH·清除能力大小順序為SDFE>TDFE>IDFE。

表3 正交試驗設計及其結果Table 3 Orthogonal experimental design and its results

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 ABTS+自由基被廣泛應用于樣品的總抗氧化能力的測定，當樣品中存在抗氧化成分時，反應體系顏色變淺，在734 nm 處吸光度降低，吸光度越低，表明所檢測物質的總抗氧化能力越強[31]。圖6結果顯示，隨竹筍纖維濃度的增加，SDFE、TDFE、IDFE清除ABTS+自由基能力逐漸增強，且呈一定正相關性，但其清除率明顯低于BHT 和Trolox。在纖維質量濃度為20 mg/mL 時，SDFE、TDFE、IDFE的ABTS+清除率分別可達70.2%，30.0%和13.1%，在同等纖維濃度下，SDF 提取物的清除能力明顯優(yōu)于TDF 和IDF 的醇提取物，即ABTS+清除率能力大小規(guī)律為SDFE> TDFE> IDFE。

圖5 不同纖維濃度乙醇提取液（SDFE、TDFE、IDFE）的DPPH 自由基清除率比較Fig.5 Comparison of DPPH· scavenging rate of ethanol extracts （SDFE，TDFE，IDFE）at different concentrations of dietary fiber

圖6 不同纖維濃度乙醇提取液（SDFE、TDFE、IDFE）的ABTS+自由基清除率比較Fig.6 Comparison of ABTS+ scavenging rate of ethanol extracts （SDFE，TDFE，IDFE）at different concentrations of dietary fiber

2.3.3 鐵還原能力測定 還原能力是衡量抗氧化物質能否高效提供電子的重要評價指標，還原能力強的樣品是良好的電子供體，可以通過提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的物質，以中斷自由基的連鎖反應。研究表明，抗氧化活性同還原力之間呈正相關關系，物質的吸光度越大，還原能力越強，其抗氧化能力也越高。由圖7可知，SDFE、TDFE、IDFE、BHT 和Trolox 抗氧化劑等5 種物質的吸光度值均與其質量濃度呈正相關，隨著濃度的升高還原能力也隨之增強。在相同濃度時，BHT 和Trolox 的總還原能力明顯優(yōu)于SDFE、TDFE、IDFE的還原能力，SDFE的鐵還原能力明顯優(yōu)于TDFE與IDFE，還原能力大小規(guī)律與DPPH·清除能力以及ABTS+清除能力一致。

2.3.4 抗氧化指標的線性分析 竹筍SDFE，TDFE以及IDFE對DPPH 自由基和ABTS+自由基均有一定的清除能力，并隨質量的增加而增強，呈較強的線性關系，R2均在0.876～0.968 之間，但不同膳食纖維抗氧化指標的IC50差別較大。

在還原力試驗中，吸光度值越高，表示還原能力越強。由表4可知，竹筍3 種膳食纖維提取物均具有一定的還原能力，并呈現(xiàn)出與其它兩種抗氧化指標相似的規(guī)律，隨著樣品質量濃度的增加而增強，且有很大的相關性，R2分別為0.9875，0.9278 和0.9189。

圖7 不同纖維濃度乙醇提取液（SDFE、TDFE、IDFE）的鐵還原能力比較Fig.7 Comparison of FRAP assay of ethanol extracts（SDFE，TDFE，IDFE）at different concentrations of dietary fiber

表4 SDFE、TDFE、IDFE 抗氧化指標的線性分析Table 4 Linear analysis of antioxidant indices of SDFE，TDFE，IDFE

3 結論

竹筍中的蛋白質含量高達28.2%，且其氨基酸種類豐富；膳食纖維的量為70%，但可溶性膳食纖維的含量僅為5.53%。采用纖維素酶解法對竹筍進行改性處理，對酶解的pH 值、酶解溫度、酶的添加量以及酶解時間進行單因素試驗和正交試驗，得出最佳的pH 值為5.0；酶解的最適溫度為45 ℃；酶的適宜添加量為0.7%；最佳酶解時間為3.5 h。竹筍膳食纖維乙醇提取液SDFE、TDFE以及IDFE均具有一定程度的抗氧化活性，且DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率以及鐵還原能力與纖維濃度均有較強的正相關性。