一株降膽固醇菌株的篩選鑒定及安全性評(píng)價(jià)

謝曉娜，張?jiān)?，楊鄭州，侯保朝，廖麗?/p>

（1.百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色533000；2.南陽市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南南陽473000）

0 引 言

腸道菌群是指在人體腸道中長(zhǎng)期定植，與宿主形成共生關(guān)系的菌群，數(shù)量達(dá)幾十萬億到幾百萬億，是人體細(xì)胞的10倍左右[1]，包括古生菌、細(xì)菌、真核生物以及病毒等，與宿主間存在復(fù)雜的相互關(guān)系[2]，腸道菌群與人體的相互作用對(duì)維持人體腸道微生態(tài)平衡及健康狀況極其重要，且嬰幼兒腸道中存在大量的益生菌，極具研究?jī)r(jià)值。

膽固醇在體內(nèi)有多種生理功能，但攝入量過多會(huì)引起血脂過高，引發(fā)各種心血管疾病，對(duì)人類健康造成一定的威脅。隨著近些年心血管疾病發(fā)病率的逐年攀升，降膽固醇成為研究熱點(diǎn)，受到人們的密切關(guān)注，因此研究有效降膽固醇方法尤為重要。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有降膽固醇的能力[3]，利用乳酸菌降膽固醇可以避免因藥物治療引發(fā)的一些副作用，并且可以治療由降膽固醇藥物引起的腸道菌群失調(diào)，在臨床應(yīng)用上有一定的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，乳酸菌還具有多種益生功能，有益于人類機(jī)體健康。

乳酸菌作為GRAS(Generally Regarded As Safe)級(jí)食品微生物，多年來數(shù)次應(yīng)用于發(fā)酵食品中，安全可靠[4]。植物乳桿菌作為乳酸菌的一種，在歐盟具有一定的安全地位和食用安全史，廣泛用于多種發(fā)酵食品中[5]。但仍有一些研究表明，乳酸菌會(huì)引起一些感染事件[6]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)20株分離自嬰幼兒糞便的乳酸菌進(jìn)行體外膽固醇脫除能力的分析，篩選出一株具有顯著降膽固醇能力的菌株，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌，若后續(xù)應(yīng)用于發(fā)酵食品，對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)非常重要。因此對(duì)L.plantarum BS 09進(jìn)行初步安全性分析，包括：抗生素敏感性分析、硝基還原酶活性分析、氨基酸脫羧酶活性分析、溶血試驗(yàn)分析、靛基質(zhì)試驗(yàn)分析。初步確定L.plantarum BS 09為一株安全性乳酸菌，為其應(yīng)用于發(fā)酵食品或是其他制劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20株分離自嬰幼兒糞便的乳酸菌（本研究共收集6名4月齡左右嬰兒的糞便樣本，6名志愿者為女孩，志愿者的篩選要求是嬰兒母親的身體健康，在妊娠期間未服用過抗生素和益生菌，嬰兒未補(bǔ)充益生菌制劑且沒有胃腸病史，足月分娩，分娩方式為順產(chǎn)，嬰兒出生體重在正常體重范圍內(nèi)，嬰兒出生后至采樣前，只經(jīng)母乳喂養(yǎng)，未攝入嬰兒配方乳粉和其他輔食，嬰兒未接受過抗生素治療）；MRS培養(yǎng)基，北京索萊寶生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒，BioTeKe公司；膽固醇，美國Sigma公司；鄰苯二甲醛、氫氧化鉀、正己烷，氯化鈉，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

各種規(guī)格Eppondorf移液器，上海力申科學(xué)儀器有限公司；AE31型倒置顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；BCN 1360型生物潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造；低溫冷凍離心機(jī)，上海離心機(jī)械研究所；快速混勻器，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；Model 680酶標(biāo)儀，美國Beckman公司；DH-101恒溫鼓風(fēng)干燥箱，青島海爾集團(tuán)公司；電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1體外降膽固醇菌株的篩選

1.3.1.1膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別取膽固醇儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 m L于干凈試管中，氮吹后先后加入鄰苯二甲醛和濃硫酸，混勻，靜置后，測(cè)定550 nm處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.2膽固醇脫除率的測(cè)定

將20株從嬰兒糞便中分離出來的乳酸菌活化兩代后按照2%的接種量接種到MRS-CHOL-THIO培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后4℃，5 000 rpm離心10 min，取1 mL上清液于干凈試管中，加入95%乙醇4 mL和3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33%的氫氧化鉀溶液，在60℃水浴15 min后迅速冷卻至室溫，加入70%的正己烷10 mL，振蕩分層后取3 mL上層正己烷，60℃氮吹，加入質(zhì)量濃度0.5 mg/mL的鄰苯二甲醛溶液5 mL，緩慢加入3 m L濃硫酸后搖勻，靜置5 min，在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出膽固醇濃度，并利用公式計(jì)算膽固醇脫除率。公式如下：

式中：C1為菌株接至M RS-CHOL-THIO培養(yǎng)24 h后上清液中膽固醇的質(zhì)量濃度；C0為初始培養(yǎng)基中膽固醇的質(zhì)量濃度。

1.3.2菌株的鑒定

對(duì)篩選出來的一株乳酸菌進(jìn)行革蘭氏染色，依次經(jīng)結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、番紅溶液染色、媒染、脫色、復(fù)染后，在1000倍顯微鏡下鏡檢。參照購買的DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行16SrDNA序列鑒定。將此株乳酸菌提取DNA后，利用通用引物擴(kuò)增16S rDNA，引物序列如下：

上游引物27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'

下游引物1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGC C-3'

擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，查看結(jié)果。將50μL擴(kuò)增產(chǎn)物和通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果，利用NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Blast比對(duì)，鑒定菌株的屬種。

1.3.3菌株安全性評(píng)價(jià)

1.3.3.1抗生素敏感性分析

（1）最小抑制濃度（MIC）測(cè)定

選用氯霉素、慶大霉素、萬古毒素、紅霉素、氨芐青霉素和四環(huán)素6種臨床常用抗生素對(duì)菌株進(jìn)行敏感性分析，分別配制含有以下濃度不同抗生素的MRS培養(yǎng)基：0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024μg/mL。將活化兩代后的實(shí)驗(yàn)菌株以2%接種量接種至上述含有抗生素的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，確定最小抑制濃度，以歐洲食品安全局（EFSA）制定的細(xì)菌對(duì)抗生素抗性的規(guī)定為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較評(píng)定[7]。

（2）質(zhì)粒提取檢測(cè)

提取實(shí)驗(yàn)菌株質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒溶液在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，150 V，20 min，檢測(cè)其有無質(zhì)粒條帶。

1.3.3.2硝基還原酶活性分析

將活化兩代后的實(shí)驗(yàn)菌株接種至硝基還原酶檢測(cè)培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后，依次加入3～5滴α-萘胺溶液和對(duì)氨基苯磺酸溶液，觀察顏色改變。若培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，即為陽性；反之，則為陰性。以Escherichia coli ATCC 25922作為陽性對(duì)照菌株。

1.3.3.3氨基酸脫酸酶活性分析

對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株在生長(zhǎng)過程中是否產(chǎn)生酪胺（tyramine）、組胺（cadaverine）、尸胺（putrescine）和腐胺（histamine）4種生物胺進(jìn)行檢測(cè)。將活化兩代后的實(shí)驗(yàn)菌株以2%接種量分別接種于4種氨基酸脫羧酶檢測(cè)培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72 h后，觀察顏色改變。若培養(yǎng)基變?yōu)樽仙?，即為陽性；反之，則為陰性。以Salmonella ATCC 14028作為陽性對(duì)照菌株。

1.3.3.4溶血實(shí)驗(yàn)分析

將活化兩代后的實(shí)驗(yàn)菌株劃線接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，若出現(xiàn)草綠色溶血環(huán)，即為α-溶血；若出現(xiàn)無色透明的溶血環(huán)，即為β-溶血；若無溶血環(huán)，即為γ-溶血。以Staphylococcus aureus ATCC 25923作為陽性對(duì)照菌株。

1.3.3.5靛基質(zhì)試驗(yàn)分析

將活化兩代后的實(shí)驗(yàn)菌株接種至蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后，加入少量二甲苯，搖動(dòng)試管提取靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)基表面后沿管壁加入Kovacs試劑，觀察二甲苯層顏色變化。若二甲苯層呈玫瑰紅色，即為陽性；反之，則為陰性。以E.coli ATCC 25922作為陽性對(duì)照菌株。

1.3.4統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析（ANOVA），檢測(cè)差異顯著性結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 降膽固醇菌株的篩選

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性回歸方程為：y=0.0074x+0.0044，相關(guān)系數(shù)R2=0.9951,說明線性關(guān)系較好，標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于膽固醇濃度測(cè)定。

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 20株乳酸菌的膽固醇脫除率

由圖2可以看出，20株乳酸菌均有一定的降膽固醇能力，但對(duì)膽固醇的脫除率各不相同。脫除率越大說明菌株體外降膽固醇能力越強(qiáng)。其中，膽固醇脫除率小于10%的有15株菌，占20株菌中比重相對(duì)較大；膽固醇脫除率在10%～30%之間的僅有4株菌，BS 09菌株的體外膽固醇脫除率最高為42.57%±4.29%。因此選擇選取膽固醇脫除率最高的菌株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。

2.2 菌株鑒定結(jié)果

活化兩代后的實(shí)驗(yàn)菌株，經(jīng)革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，呈紫色，為革蘭氏陽性菌。視野中呈現(xiàn)單一的形態(tài)，桿狀，沒有雜菌。鏡檢結(jié)果如圖3所示，提取細(xì)菌基因組DNA后，利用通用引物對(duì)菌株進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳后成像結(jié)果如圖4所示。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物和通用引物送至測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果，利用NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Blast比對(duì)，與植物乳桿菌同源性為100%，由此，確定該菌株為植物乳桿菌，將實(shí)驗(yàn)菌株命名為L(zhǎng).plantarum BS 09。

圖3 乳酸菌鏡檢圖

2.3 安全性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1抗生素敏感性分析

乳酸菌對(duì)抗生素敏感性的研究是評(píng)價(jià)菌株安全性的首要指標(biāo),本實(shí)驗(yàn)選取6種抗生素作為研究對(duì)象，其中包括抑制蛋白質(zhì)合成的氯霉素、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素和抑制細(xì)胞壁合成的萬古毒素、氨芐青霉素，通過測(cè)定菌株MIC值判斷其對(duì)不同抗生素的敏感性。將測(cè)定的MIC值與歐洲食品安全局（European Food Safety Authority,EFSA）定義的微生物截止值進(jìn)行比較，MIC值小于或等于微生物截止值，說明菌株對(duì)抗生素敏感；MIC值大于微生物截止值，說明菌株對(duì)抗生素有抗性[8]。L.plantarum BS 09對(duì)6種抗生素的最小抑制濃度如表1所示。L.plantarum BS 09對(duì)氯霉素、慶大霉素、萬古霉素、紅霉素、四環(huán)素有抗性，對(duì)氨芐青霉素敏感。在乳酸菌耐藥性近幾年研究中，乳酸菌是否帶有可轉(zhuǎn)移性耐藥基因引起人們的關(guān)注[9]。很多研究表明，乳酸菌的抗性主要來自于兩種：固有和獲得性，固有抗性是自身帶有的，獲得性抗性是從外源DNA獲得的[10]。研究認(rèn)為，多數(shù)乳酸菌的耐藥性是非轉(zhuǎn)移性的，但是與結(jié)合質(zhì)粒相關(guān)的耐藥性會(huì)有轉(zhuǎn)移的可能。若菌株帶有固有抗性，在臨床應(yīng)用上有一定的優(yōu)勢(shì)，可以改善由抗生素引起的腸道菌群紊亂。若菌株有獲得性抗性，有將抗性轉(zhuǎn)移到腸道致病菌中的風(fēng)險(xiǎn)。然而多數(shù)乳酸菌的抗性是固有抗性，非轉(zhuǎn)移性的[11]，但與結(jié)合質(zhì)粒相關(guān)的耐藥性有轉(zhuǎn)移的可能[12]。為了進(jìn)一步研究L.plantarum BS 09對(duì)抗生素的抗性是否存在轉(zhuǎn)移性，提取菌株質(zhì)粒，通過電泳檢測(cè)其是否存在質(zhì)粒。質(zhì)粒提取電泳結(jié)果如圖5所示，通過對(duì)L.plantarum BS 09進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè)，未出現(xiàn)條帶，可以由此推測(cè)L.plantarum BS 09不含有耐藥質(zhì)粒，或是耐藥基因存在于細(xì)菌DNA上，這兩種情況都不會(huì)出現(xiàn)抗性轉(zhuǎn)移，初步判定L.plantarum BS 09無抗性轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

表1 植物乳桿菌BS09針對(duì)不同抗生素的MIC值結(jié)果 μg/mL

圖5 質(zhì)粒提取電泳

2.3.2硝基還原酶活性分析

對(duì)L.plantarum BS 09進(jìn)行硝基還原酶活性分析，結(jié)果如圖6所示。接種陽性對(duì)照菌株E.coli ATCC 25922的硝基還原酶培養(yǎng)基呈紅色，為陽性；而接種L.plantarum BS 09的培養(yǎng)基未發(fā)生顏色變化。由此說明，L.plantarum BS 09不能產(chǎn)生硝基還原酶。當(dāng)人體攝入含有硝酸鹽成分的食物時(shí)，如果體內(nèi)菌株含有硝基還原酶，會(huì)將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成亞硝胺類物質(zhì)，對(duì)人體有害[14]。因此檢測(cè)菌株是否有硝基還原酶活性十分重要。本實(shí)驗(yàn)以E.coli ATCC 25922為陽性對(duì)照菌株，利用亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸和α-萘胺試劑反應(yīng)生成紅色重氮化合物的原理，對(duì)L.plantarum BS 09進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果呈陰性，說明其沒有硝基還原酶活性。這與一些研究中植物乳桿菌沒有硝基還原酶活性的結(jié)果一致[15]。

圖6 硝基還原酶活性檢測(cè)結(jié)果

2.3.3氨基酸脫羧酶活性分析

將L.plantarum BS 09和Salmonella ATCC 14028分別接種于4種氨基酸脫羧酶檢測(cè)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)基顏色變化。結(jié)果如圖7所示。接種陽性對(duì)照菌株Salmonella ATCC 14028的尸胺、腐胺檢測(cè)培養(yǎng)基顏色呈現(xiàn)紫色，為陽性結(jié)果；而接種L.plantarum BS 09的酪胺、組胺、尸胺、腐胺檢測(cè)培養(yǎng)基顏色均呈現(xiàn)黃色，為陰性結(jié)果。生物胺是一類有活性含氮低分子量的有機(jī)化合物，人體攝入過多會(huì)引起過敏反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及生命。一些研究表明[16]，一些乳酸菌在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生生物胺[17]。菌株若含有氨基酸脫羧酶，可將氨基酸脫羧成生物胺，因此對(duì)L.plantarum BS 09的氨基酸脫羧酶活性進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)以Salmonella ATCC 14028作為陽性對(duì)照菌株，利用生物胺呈堿性，使指示劑溴甲酚紫呈紫色的原理，對(duì)L.plantarum BS 09進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果呈陰性，說明其生長(zhǎng)過程中不會(huì)產(chǎn)生酪胺、組胺、尸胺和腐胺等有害代謝產(chǎn)物。這與其他研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌較少有氨基酸脫羧酶活性相一致[18]。本實(shí)驗(yàn)中的L.plantarum BS 09為氨基酸脫羧酶陰性菌株，是否有減少或降低生物胺能力還有待于做進(jìn)一步研究。

圖7 氨基酸脫羧酶活性檢測(cè)結(jié)果

2.3.4溶血試驗(yàn)分析

將L.plantarum BS 09和S.aureus ATCC 25923分別劃線接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察，結(jié)果如圖8所示。S.aureus ATCC 25923菌落周圍出現(xiàn)了透明圈，發(fā)生了β-溶血現(xiàn)象，而L.plantarum BS 09菌落周圍無溶血環(huán)出現(xiàn)，為γ-溶血。由此說明，L.plantarum BS 09無溶血能力。溶血指紅細(xì)胞破裂，可能引起的因素有：溶血性細(xì)菌、蛇毒侵入、輸入配血不合的血液導(dǎo)致的抗原抗體反應(yīng)、機(jī)械性損傷、紅細(xì)胞內(nèi)在缺陷等[19]。溶血性細(xì)菌可能會(huì)引起敗血癥，因此檢測(cè)L.plantarum BS 09有無溶血性。本實(shí)驗(yàn)以S.aureus ATCC 25923為陽性對(duì)照菌株，在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，L.plantarum BS 09菌落周圍沒有溶血環(huán)出現(xiàn)，為γ-溶血，由此說明，L.plantarum BS 09不是溶血性細(xì)菌，不存在引起敗血癥的風(fēng)險(xiǎn)。與以往研究乳酸菌未檢測(cè)出β-溶血現(xiàn)象一致[20]。

圖8 溶血試驗(yàn)結(jié)果

2.3.5靛基質(zhì)試驗(yàn)分析

對(duì)L.plantarum BS 09進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)分析，結(jié)果如圖9所示。接種陽性對(duì)照菌株E.coli ATCC 25922的檢測(cè)培養(yǎng)基液面出現(xiàn)玫瑰紅色，為陽性結(jié)果；而接種L.plantarum BS 09的培養(yǎng)基液面無玫瑰紅色，為陰性結(jié)果。由此說明，L.plantarum BS 09不能產(chǎn)生色氨酸酶分解色氨酸生成吲哚。靛基質(zhì)試驗(yàn)主要是檢測(cè)菌株是否有色氨酸酶，將色氨酸分解成吲哚。色氨酸作為人體必需氨基酸之一，參與人體免疫、消化等多種過程[21]，色氨酸代謝障礙會(huì)引起惡性腫瘤、肝功能衰退等[22]。多數(shù)乳酸菌為靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性菌，但也有一些乳酸菌被發(fā)現(xiàn)為靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性菌[23]，因此對(duì)菌株進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)檢測(cè)十分必要。本實(shí)驗(yàn)以E.coli ATCC 25922為陽性對(duì)照菌株，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)L.plantarum BS 09為陰性結(jié)果，說明其不含有色氨酸酶。

圖9 靛基質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

本研究從20株嬰幼兒糞便中分離出來的乳酸菌中篩選出降膽固醇能力相對(duì)較強(qiáng)的一株菌株BS 09，并通過菌株鑒定其為L(zhǎng).plantarum BS 09，通過安全性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)L.plantarum BS 09對(duì)氨芐青霉素未表現(xiàn)出抗性，對(duì)氯霉素、慶大霉素、萬古霉素、紅霉素和四環(huán)素表現(xiàn)出抗性，無抗性轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。此外，該菌株為硝基還原酶陰性、靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性，無溶血能力，不能產(chǎn)生tyramine、cadaverine、putrescine、histamin生物胺類物質(zhì)，初步判定L.plantarum BS 09為一株安全的益生菌。此研究為功能性乳酸菌的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為具有降膽固醇作用的L.plantarum BS 09菌株的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了理論參考。