炙甘草湯干預(yù)阿霉素致大鼠心肌損害的能量代謝研究*

杭州市第三人民醫(yī)院 浙江 杭州 310009

目前，阿霉素（ADM）的心臟毒性機(jī)制尚未完全明確，氧自由基損傷、能量代謝障礙、鈣穩(wěn)態(tài)紊亂、線粒體凋亡途徑被認(rèn)為是阿霉素心臟毒性的主要機(jī)制。近年來，眾多醫(yī)者致力于蒽環(huán)類藥物心臟毒性的防治研究，大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明中醫(yī)藥在這方面具有良好療效[1]。炙甘草湯，又名復(fù)脈湯，《傷寒論》記載其主治“心動(dòng)悸、脈結(jié)代”，具有益氣滋陰、通陽復(fù)脈之功效。臨床觀察表明，炙甘草湯可有效防治阿霉素的早期心臟毒性、減輕心臟毒性程度、增強(qiáng)患者對(duì)蒽環(huán)類藥物的耐受性、保證化療的順利進(jìn)行[2]。心肌能量代謝的改善是治療各種心臟疾病的重要理念之一，也是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過炙甘草湯改善心肌能量代謝障礙，揭示其有效防治阿霉素心臟毒性的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性Wistar大鼠均購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（滬）2017-0005]。15只大鼠均由杭州赫貝科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，正常進(jìn)食飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：注射液鹽酸多柔比星，購自深圳萬樂藥業(yè)（批號(hào)：1806E1）；炙甘草湯，購自杭州市華東醫(yī)藥公司，藥物組成：炙甘草12g，生地黃30g，生姜、桂枝各9g，人參、阿膠各6g，麥門冬、麻仁各10g，大棗20g。熬制方法：將藥材加水適量，大火煎開后，小火濃煎至50ml，生藥濃度為2.24g/ml，備用；蘇木精，購自Sigma公司（貨號(hào)H9627，批號(hào)：SLBN3249V）；伊紅，購自Sigma公司（貨號(hào)：E6003，批號(hào)：62R80915X）；心肌肌鈣蛋白I(cTnI)檢測(cè)試劑盒，購自武漢優(yōu)爾生公司（貨號(hào)：SEA478Ra，批號(hào)：L181108550）；三磷酸腺苷（ATP）和二磷酸腺苷（ADP）的二鈉標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京索萊寶科技有限公司，純度98%以上；乙腈（色譜純），購自美國TEDIA公司；甲醇（色譜純），購自Sigma-Aldrich公司；磷酸（分析純），購自杭州高晶精密化工有限公司；磷酸氫二鈉（分析純），購自湖州湖試化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉（分析純），購自江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：RM2235型，Leica公司；顯微鏡：BX43型，Olympus公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱：PYX-DHS500BS-Ⅱ型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；移液器：北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：SpectraMax Plus 384型，美國MD公司；高效液相色譜系統(tǒng)：日本島津shimadzu 20AT；數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-2，上海常思工貿(mào)有限公司；高速離心機(jī)：MIKRO 22R，德國Hettich產(chǎn)品。

1.4 方法：分述如下。

1.4.1 模型建立與分組：15只Wistar大鼠分5組，每組3只，分別為對(duì)照組、模型組、預(yù)防組、治療組和防治結(jié)合組。實(shí)驗(yàn)前2周預(yù)防組及防治結(jié)合組（結(jié)合組）開始灌胃炙甘草湯（10ml/kg），每日2次，第3周開始分別在模型組、預(yù)防組、治療組和結(jié)合組尾靜脈注射ADM（4mg/kg），5天1次，給藥3次，同時(shí)，治療組及結(jié)合組在尾靜脈注射當(dāng)天，繼續(xù)予炙甘草湯灌胃。對(duì)照組以相應(yīng)體積的生理鹽水灌胃。各組大鼠在第1次尾靜脈注射后20d，處死大鼠后收集心臟，分2管凍存，用于檢測(cè)心肌ATP和ADP含量。

1.4.2 血清的采集與保存：每組大鼠分別于灌胃前（T1）和麻醉前（T2）通過斷尾取血0.2ml，麻醉30分鐘后（T3），通過摘除眼球取血0.2ml。將血樣分別注入已編號(hào)的EP管中，靜置30min后，以4℃、2000r/min離心5min，吸取血清后，置于-80℃保存?zhèn)溆?，用于檢測(cè)血清cTnI水平。

1.4.3 ELISA檢測(cè)各組大鼠血清cTnI水平：根據(jù)cTnI檢測(cè)試劑盒，配制好標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔及空白孔。在標(biāo)準(zhǔn)孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品100μl，空白孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100μl，剩余孔中加入各組大鼠血清100μl，置于37℃溫育1h。隨后吸棄液體，將A試劑工作液100μl加入各孔，再次置于37℃溫育1h。吸棄液體，清洗3次后，將B試劑工作液100μl加入每孔，37℃溫育1h。清洗后，于每孔加入90μlTMB底物溶液，置于37℃溫育30min后，終止反應(yīng)，并于酶標(biāo)儀450nm下讀數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.4.4 高效液相色譜法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中ADP、ATP的表達(dá)水平：分述如下。

1.4.4.1 對(duì)照品溶液的配制：準(zhǔn)確稱取ATP和ADP標(biāo)準(zhǔn)品溶解于超純水中，作為儲(chǔ)備液，利用超純水將儲(chǔ)備液分別稀釋成 200.0、100.0、50.0、20.0、10.0、5.0和1.0mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)液，置于4℃冰箱保存。

1.4.4.2 心肌樣品的制備：從超低溫冰箱中取出小鼠心肌樣本，準(zhǔn)確稱取一定量小鼠心肌組織，并將組織置于玻璃勻漿器中。將預(yù)冷的0.4mol/L的高氯酸溶液，以10ml/g比例加入勻漿器中，置于冰浴中勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至10ml具塞離心管中，以4℃、10000r/min離心5min。取0.4ml上清液，加入4℃預(yù)冷的2.0mol/L氫氧化鉀溶液20μl，混勻后，4℃、10000r/min離心10min。吸取上清液后，于0.45μm微孔濾膜過濾，取過濾液20μl進(jìn)高效液相色譜系統(tǒng)分析。

1.4.4.3 色譜條件：色譜柱為：ODS C18 column(5μm,150mm×4.6mm)；流動(dòng)相為100mmol/L磷酸鹽緩沖液（含12mmol/L磷酸氫二鈉和88mmol/L磷酸二氫鈉，pH=6.5）-甲醇=99.9-0.1（v/v），流速 0.8ml/min，柱溫25℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：所有數(shù)據(jù)均由SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行作圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若方差齊，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK檢驗(yàn)。若方差不齊，則采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量的變化：在ADM造模前，各組大鼠體重未顯示出明顯差異(P＞0.05)，表明炙甘草湯灌胃對(duì)大鼠體質(zhì)量無明顯影響；在開始尾靜脈注射ADM后，模型組體質(zhì)量與對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其余組無顯著性差異(P＞0.05)。一定程度說明炙甘草湯可以緩解ADM的相關(guān)毒副反應(yīng)。見表1。

表1 各組大鼠ADM造模前后體質(zhì)量的變化（±s，g）

表1 各組大鼠ADM造模前后體質(zhì)量的變化（±s，g）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別對(duì)照組模型組治療組預(yù)防組結(jié)合組例數(shù)造模后3 3 3 3 3造模前1d 294.00±11.53 291.00±23.52 289.00±7.21 290.33±15.95 288.00±15.59 11d 300.67±13.65 306.00±25.16 300.00±4.58 310.00±13.75 289.00±12.00 14d 304.33±14.01 300.67±20.65 296.67±4.93 308.67±15.95 296.00±15.87 21d 317.67±29.67 291.33±16.07*300.33±1.15 302.67±11.85 288.67±17.16 28d 336.00±25.12 273.33±20.82**288.67±8.14 288.00±9.64 271.33±18.50*31d 338.67±25.15 274.67±19.60**286.67±9.07 289.33±10.02 276.67±17.21

2.2 各組大鼠血清cTnI含量：見表2。對(duì)照組與模型組cTnI含量變化為T1＜T2＜T3，預(yù)防組cTnI含量變化為T2＜T1＜T3，治療組與結(jié)合組cTnI含量變化為T2＜T3＜T1。與對(duì)照組比較，均顯著升高（P＜0.01），與模型組比較，結(jié)合組T2時(shí)間點(diǎn)呈下降趨勢(shì)（P＜0.05）；與模型組比較，預(yù)防組、治療組與結(jié)合組T3時(shí)間點(diǎn)均顯著下降（P＜0.01），其余組間無顯著性差異(P＞0.05)。

表2 各組大鼠血清樣本cTnI含量（±s，n=3）

表2 各組大鼠血清樣本cTnI含量（±s，n=3）

注：與對(duì)照組比較，▲P＜0.01；與模型組比較，○P＜0.05，○○P＜0.01。

T3（麻醉后）148.88±12.65 502.36±17.74▲412.44±25.68▲○○396.77±18.11▲○○379.29± 8.80▲○○組別對(duì)照組模型組預(yù)防組治療組結(jié)合組T1（灌胃前）115.78±15.17 424.48±22.90▲399.54±10.13▲441.57±50.09▲388.32± 8.66▲T2（麻醉前）136.84±22.02 469.59±67.28▲394.22±14.88▲369.32± 6.49▲360.90± 7.23▲○

2.3 各組ADP和ATP的表達(dá)水平比較：見表3。檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組ATP和ADP濃度均下降（P＜0.05），表明造模成功。預(yù)防組與對(duì)照組比較ATP濃度降低（P＜0.05），但是與模型組比較明顯升高（P＜0.05），ADP影響不顯著，說明中藥預(yù)防對(duì)ATP濃度具有效果。然而，治療組與模型組比較，ATP和ADP差異均不顯著（P＞0.05），說明中藥治療對(duì)ATP和ADP濃度的影響并不顯著。與模型組和治療組比較，結(jié)合組ATP濃度升高（P＜0.05），但與預(yù)防組比較差異不顯著（P＞0.05）；結(jié)合組ADP與模型組比較差異不顯著(P＞0.05)。以上結(jié)果說明預(yù)防組對(duì)ATP濃度影響較大，治療組和結(jié)合組對(duì)ATP和ADP影響并不顯著。

表3 各組樣本中ATP和ADP含量（±s）

表3 各組樣本中ATP和ADP含量（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

ADP（mg/L）183.48±4.31 129.85±19.22*136.41±4.08*146.28±20.61*137.16±4.73*組別對(duì)照組模型組預(yù)防組治療組結(jié)合組例數(shù)3 3 3 3 3 ATP（mg/L）604.42±53.41 270.75±18.61*487.23±53.95*▲256.23±28.39*397.85±35.39*▲

3 討論

阿霉素是一種抗腫瘤抗生素藥物，其抗腫瘤作用主要是通過插入脫氧核糖核酸雙鏈，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的[3]。正常心臟的能量代謝過程對(duì)維持機(jī)體的生理功能具有重要意義，ATP及ADP是最常見的心肌高能磷酸化合物，可作為心肌細(xì)胞進(jìn)行生命活動(dòng)的直接能源供給者。阿霉素多次給藥后，產(chǎn)生的糖苷代謝物和次級(jí)醇代謝物通過活性氧（ROS）機(jī)制引發(fā)心肌損傷。心肌中的線粒體功能受損，ATP值也會(huì)隨之下降，心臟生理活動(dòng)需要的能量供給將受到影響，從而導(dǎo)致體內(nèi)的能量代謝通路發(fā)生紊亂[4]。三大營養(yǎng)素的最終代謝通路，分布在線粒體內(nèi)，線粒體的形狀、功能與細(xì)胞骨架密切相關(guān)，心肌的損傷可以導(dǎo)致細(xì)胞骨架的改變，同時(shí)各種損傷原因均可導(dǎo)致線粒體功能的損傷，兩者相互影響相互作用，長(zhǎng)期累積作用導(dǎo)致慢性心力衰竭[5]。心衰發(fā)生后，供養(yǎng)和耗氧的平衡失調(diào)，線粒體的功能改變，使ATP生成和利用均減少，將導(dǎo)致心功能的進(jìn)一步惡化[6]。

根據(jù)阿霉素導(dǎo)致的心臟毒性表現(xiàn)癥狀，中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“心悸”“怔忡”“心痹”“虛勞”等病證范疇。心悸、怔忡的病因，多責(zé)之于痰、火、瘀、虛、驚等眾多因素。ADM所致心臟毒性的病機(jī)為藥毒熾熱、耗氣傷陰、心神失養(yǎng)，或久病體虛、正氣不復(fù)、心氣不足、心陽不振所致，應(yīng)采用益氣養(yǎng)陰溫陽等治法進(jìn)行治療。炙甘草湯方中，生地黃滋陰養(yǎng)血為君藥；輔以炙甘草、人參、大棗補(bǔ)益心脾，以資氣血生化之源，阿膠、麥冬、麻仁滋心陰，養(yǎng)心血，充血脈，共為臣藥；佐以桂枝、生姜辛行溫通，溫心陽，通血脈，諸厚味滋膩之品得姜、桂則滋而不膩。臨床中，炙甘草湯治療慢性心力衰竭的療效顯著，且安全性高，副反應(yīng)少[7]。有學(xué)者認(rèn)為炙甘草湯可以顯著增強(qiáng)心肌收縮力，改善心肌結(jié)構(gòu)，同時(shí)促進(jìn)其細(xì)胞功能恢復(fù)，可有效增強(qiáng)心肌纖維線粒體的氧化與代謝，起到很好的強(qiáng)心效果[8]。

cTnI是心肌損傷的標(biāo)志之一，本實(shí)驗(yàn)以尾靜脈注射ADM建立大鼠心肌損傷模型，在不同階段進(jìn)行炙甘草湯干預(yù)，結(jié)果顯示，經(jīng)ADM干預(yù)后，模型組的cTnI含量明顯升高，而與之相反，預(yù)防組在ADM干預(yù)后cTnI在一定階段也隨之降低，治療組及防治結(jié)合組，均顯示出炙甘草湯干預(yù)后，可減少cTnI的含量，同時(shí)，與模型組比較，預(yù)防組、治療組與防治結(jié)合組均顯著下降，表明炙甘草湯對(duì)ADM引起的心肌損傷具有修復(fù)作用。通過測(cè)定ATP及ADP的含量，結(jié)果顯示ADM干預(yù)后，模型組的ATP及ADP含量明顯減少，即說明心肌損傷已導(dǎo)致能量代謝障礙，而炙甘草湯干預(yù)后，一定程度上，可增加ATP及ADP的生成，說明在預(yù)防、治療ADM引起的心臟毒性過程中，炙甘草湯均具有較好的療效。然而炙甘草湯改善能量代謝障礙的具體環(huán)節(jié)、對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的作用，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。