風(fēng)柜斗草醇提物對小鼠酒精性肝損傷的保護作用

華寶玉，陳 津，汪永夫，陳森艷，邱龍新

(1.龍巖學(xué)院；2. 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點實驗室；3.龍巖市中醫(yī)院 福建龍巖 364000)

風(fēng)柜斗草，又名褚紅頭、肉穗草，屬于野牡丹科(Melastomaceae)中的肉穗草屬(SarcopyramisWall)。草本，肉質(zhì)無被毛的四棱莖；卵形葉片對生，葉片頂端漸尖，基部近圓形，邊緣細鋸齒，葉柄纖細；花紫紅色至粉紅色，花瓣卵形；蒴果綠色，杯狀，有四棱，狀如風(fēng)柜斗，故其名[1]。主要分布東南亞和我國的福建、臺灣、廣西、廣東、江西等地。該植物為我國民間習(xí)用，是治療急慢性肝炎的單驗方，療效確切，安全無毒副作用[2]。其藥用價值包括：調(diào)節(jié)人體免疫機制，增加抗氧化能力，幫助機體清除肝臟代謝產(chǎn)生的毒物，減輕肝臟代謝負擔(dān)。

酒精性肝病(Alcoholic liver disease, ALD)是由于長期過量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，是一種臨床常見的肝損傷形式，近年來酒精性肝病發(fā)病率在我國呈逐年增高趨勢，成為僅次于病毒性肝病的第二大肝病，嚴重危害人民健康[3]。ALD 的發(fā)病機制非常復(fù)雜，主要是乙醇及其衍生物的代謝過程中直接或間接誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激、腸源性內(nèi)毒素、炎性介質(zhì)和營養(yǎng)失衡等多種因素相互作用的結(jié)果，脂代謝、肝再生和凋亡、肝臟抗氧化等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、 腸道菌群紊亂、細胞因子、免疫反應(yīng)等多種因素也參與 ALD 的發(fā)生發(fā)展[4]。肝細胞通過乙醇脫氫酶將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，也可通過細胞色素P4502E1 (CYP2E1)將乙醇氧化為乙醛，接著通過乙醛脫氫酶將乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸。肝細胞代謝乙醇時產(chǎn)生大量活性氧，可造成脂質(zhì)過氧化、線粒體損傷、炎癥和凋亡，引起肝損傷[5]。治療酒精性肝病的方法有營養(yǎng)治療、藥物治療、肝移植等。但是如果長期服用藥物也會有負面作用，如糖皮質(zhì)激素、美它多幸，會使肝臟代謝負擔(dān)加重，反而加重病情。鄭曉艷等[6]研究分析，風(fēng)柜斗草醇提物含有多種天然活性物質(zhì)，如多糖類、氨基酸類、酚類、黃酮類等。這些化合物具有提高免疫調(diào)節(jié)能力和抗脂質(zhì)過氧化活性功能，可能對肝臟脂質(zhì)過氧化，肝細胞膜破損導(dǎo)致的急性酒精肝有一定的預(yù)防治療作用。本研究進一步探討風(fēng)柜斗草醇提物對酒精性肝損傷的抗氧化，抗損傷的保護作用和機制，以期為風(fēng)柜斗草醇提物在酒精性肝病治理藥物的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑與動物

風(fēng)柜斗草(購自龍巖市轄區(qū)市場的天然藥用植物 , 經(jīng)龍巖學(xué)院孔祥海教授鑒定);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)檢測試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測試劑盒、蛋白濃度檢測試劑盒等購于南京建成生物工程研究所。乙醇、甲醛均為分析純，由西隴化工股份有限公司生產(chǎn)。健康清潔級ICR種雄性小鼠60只，雌雄各半，體重(20±2) g由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(東京理化公司)、真空冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)、超細勻漿機(上海貝基生物科技公司)、酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 風(fēng)柜斗草醇提取物制備

將風(fēng)柜斗草放入烘箱24 h后，放入粉碎機進行粉碎，經(jīng)過50目篩子過目收集。稱取風(fēng)柜斗草粉末50 g放入燒杯，加入500 mL無水乙醇，玻璃棒攪拌均勻，放入超聲波清洗機1 h，期間每隔10～15 min攪拌一次，至少攪拌3～5次，促進有效成分的溶出；結(jié)束后將溶液進行抽濾，收集濾液，濾渣根據(jù)上述方法重復(fù)提取3次，收集濾液，將其進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無酒精后加入少量蒸餾水收集；最后得到收集的量，放入真空冷凍干燥機，充分干燥，收集到風(fēng)柜斗草醇提取物。上述提取物臨用前搗碎成細粉用蒸餾水溶解配成所需的劑量，灌胃前均勻搖晃。

1.2.2 動物模型的建立及實驗設(shè)計

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，然后隨機分6組，分別為空白組、急性酒精肝模型組、聯(lián)苯雙酯陽性組(200 mg/kg)、風(fēng)柜斗草醇提物組(低、中、高組劑量分別為200、400、800 mg/kg)且每組10只。在第8 ～ 29天內(nèi)，每天給小鼠灌胃受試品，每周稱兩次體重，并根據(jù)體重進行調(diào)整藥量。30 d后，除空白組外其余小鼠灌胃體積分數(shù)為50%乙醇(分析純)，胃灌量為12 mL/kg，空白組給予水，禁食16 h后。通過眼球取血法得到全血，且離心得到血清；采用脊椎脫臼法處死。解剖小鼠得到肝臟分裝五份，用于切片及其他的檢測。將離心后得到的血清和肝臟置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 肝臟病理學(xué)切片制作及觀察肝臟變化

將小鼠解剖得到的肝臟切取小塊立即用體積分數(shù)10%福爾馬林固定，進行病理學(xué)切片制作，然后觀察切片，比對各組小鼠肝臟的病變程度。在每張病理學(xué)切片上取5處觀察，分別為左上、右上、中間、左下、右下，以平均每個部位空泡所占百分比表示肝臟脂肪變性程度。依據(jù)空泡面積占肝組織切片的比例，判斷肝臟損傷程度。

1.2.4 血清中ALT、AST含量測定

對小鼠灌胃乙醇以及禁食16 h后，取得全血，常溫下放置20 min，設(shè)置離心機溫度4 ℃，離心(3500 r/min，10 min)得到血清，分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱，按試劑盒操作說明檢測ALT、AST含量。

1.2.5 肝組織中GSH-PX、SOD、MDA含量測定

用生理鹽水制作10% (m/V)肝組織勻漿液，按采購的試劑盒中步驟測定GSH-PX、SOD。MDA的檢測先采用RIPA裂解液制作10%肝組織勻漿液，再用試劑盒對MDA含量的測定。

1.2.6 統(tǒng)計分析

將實驗數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)整理。GraphPad Prism 5.0用作統(tǒng)計學(xué)分析和處理，且用MeanSEM表示獲得的數(shù)據(jù)，ANOVA-One Way可對多組間進行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理學(xué)切片的觀察

由圖1得，空白組肝組織表現(xiàn)為正常形式且肝細胞未見腫脹，呈放射狀分布，細胞核呈正常圓形狀，胞質(zhì)內(nèi)幾乎沒有脂滴；模型組肝細胞變大，圓形脂滴空泡明顯增多，存在脂滴的肝細胞數(shù)量上升，且肝組織中含有大量的脂滴，細胞質(zhì)疏松呈網(wǎng)狀，說明酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型建立。陽性對照組中，肝細胞未見明顯腫脹，但仍可見少量滴空泡；風(fēng)柜斗草醇提物低劑量組(200 mg/kg)，圓形脂滴空泡分布范圍較廣，還存在大量肝細胞脂肪變性；中劑量組(400 mg/kg)，肝細胞脂滴空泡數(shù)量明顯減少，病變范圍縮小，肝細胞結(jié)構(gòu)清晰，治療效果明顯；高劑量組(800 mg/kg)，肝細胞細胞質(zhì)疏松呈網(wǎng)狀，細胞核部分被破壞。與模型組比較，說明低劑量和中劑量組藥物組均有減輕脂肪變性和炎癥反應(yīng)的作用，而高劑量組治療效果不如低劑量和中劑量組藥物組。

A:空白； B:模型； C:陽性；D:低劑量組；E：中劑量組；F：高劑量組；圖中箭頭所示為圓形脂滴空泡圖1 風(fēng)柜斗草醇提物對酒精肝損傷小鼠肝組織病理切片的影響(HE，×200)

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較

2.2 小鼠血清中ALT、AST檢測結(jié)果

由于受到刺激因子的作用致使肝細胞膜結(jié)構(gòu)損傷，ALT、AST大量從肝細胞中流出會導(dǎo)致血清中轉(zhuǎn)氨酶活性增加。根據(jù)表1，模型組小鼠在酒精刺激下造成了血清中ALT、AST水平升高，與不受酒精刺激的空白組比較有差異極顯著(P<0.01)，可以判斷實驗?zāi)Ｐ蜆?gòu)建成功。陽性組與模型組差異極顯著(P<0.01)，表明陽性藥物可以穩(wěn)定肝細胞膜結(jié)構(gòu)，減輕肝損傷。從比較模型組與各劑量組的結(jié)果可以看出：劑量為200 mg/kg，小鼠血清中AST水平明顯降低(P<0.05)，ALT水平下降；劑量為400 mg/kg，ALT、AST水平顯著降低(P<0.01)，得到的效果最佳；劑量為800 mg/kg，顯著降低AST水平(P<0.01)，且ALT也明顯下降(P<0.05)。因此可以得出風(fēng)柜斗草醇提物不同劑量的給藥方式，所呈現(xiàn)的效果也具有差異。

2.3 小鼠肝組織中GSH-PX、SOD、MDA的檢測結(jié)果

由表2得，模型組中GSH-PX活力比空白組中低(P<0.05)，因GSH-PX和SOD是主要的抗氧化酶，且SOD能有效降低超氧陰離子含量，防止肝臟受到自由基作用產(chǎn)生損傷；因此模型組GSH-PX、SOD活力明顯減小，可以說明肝臟發(fā)生損傷，造模成功。陽性藥物組和風(fēng)柜斗草醇提物各劑量組都能提高GSH-PX活力，陽性藥物組顯著提高(P<0.01)，低劑量組和中劑量組能明顯提高GSH-PX活力(P<0.05)；說明風(fēng)柜斗草醇提物對治療肝損傷造成抗氧化物活性變化有一定效果，減小肝臟損傷。在比較各組SOD水平，可以看出模型組由于受到外界因子影響導(dǎo)致小鼠肝臟中的SOD活力明顯降低；在比較模型組與陽性組時，陽性組在SOD活力提高表現(xiàn)顯著(P<0.05)，風(fēng)柜斗草醇提物各劑量組相對于模型組都有提高SOD活力，其中中劑量組為防止肝臟受到自由基作用造成損傷效果最佳(P<0.05)。

當(dāng)肝細胞受到外界刺激因子作用時，會導(dǎo)致體內(nèi)的氧化與抗氧化作用失調(diào)，產(chǎn)生大量且作用偏向于發(fā)生氧化反應(yīng)。在肝組織中的脂肪酸會被氧化分解產(chǎn)生許多復(fù)雜的物質(zhì)，其中包含MDA。通常肝臟自由基的產(chǎn)生和機體的過氧化程度可以通過檢測MDA的水平來檢測。由表2得，從模型組數(shù)據(jù)可以看出，該組小鼠肝臟中MDA含量平均偏高，與空白組比較有統(tǒng)計學(xué)上的差異；從模型組分析中可以得到該組小鼠肝臟中MDA變多，破壞肝功能。對照組MDA含量比模型組中的低，說明聯(lián)苯雙酯可以降低肝臟損傷。各劑量組與模型組比較，MDA水平有所下降，其中低劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

為研究風(fēng)柜斗草醇提物的作用機制，本實驗采用的是乙醇灌胃制造急性酒精性肝損傷的模型，從模型組小鼠血清中可以檢測到大量的AST、ALT。ALT、AST在正常肝細胞中含量較高，血清中含量較少，當(dāng)肝臟受到損傷時，肝細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶從細胞流出進入血液，通過小鼠血清中ALT和AST活性的高低可判斷其肝細胞損傷的程度[7]。檢測到給予風(fēng)柜斗草醇提物后，血清中的AST、ALT水平明顯降低，可以判斷風(fēng)柜斗草醇提物可以降低酒精對肝臟損傷程度，提高肝細胞膜的耐受能力，保持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。對肝組織的檢測，風(fēng)柜斗草醇提物能提高GSH-PX、SOD活力，同時降低肝組織中MDA含量。綜合檢測數(shù)據(jù)，低劑量和中等劑量組的效果較好，較低劑量的風(fēng)柜斗草醇提物可以通過降低脂質(zhì)過氧化水平以及提高抗氧化酶活性起到保護肝臟損傷的作用[8]。高劑量風(fēng)柜斗草醇提物因濃度過高超過肝細胞耐受影響了藥效，原因可能是當(dāng)風(fēng)柜斗草提取物中黃酮的濃度在0.35～0.55 mg /mL 時，對羥自由基清除的效果好，但提高其濃度會降低對自由基的清除率[9]，當(dāng)風(fēng)柜斗草醇提取物濃度太高導(dǎo)致其中黃酮含量過高，使得抗氧化效果下降。在對肝組織進行病理學(xué)切片觀察，可以明顯地看出喂食低劑量和中劑量組風(fēng)柜斗草醇提物的小鼠，在其肝組織中脂滴數(shù)量明顯減少，肝細胞大小正常及排列整齊，脂肪變性程度降低。綜上所述，中、低劑量的風(fēng)柜斗草醇提物可以通過提高抗氧化酶水平、穩(wěn)定肝細胞膜結(jié)構(gòu)和降低脂質(zhì)過氧化水平，從而一定程度減輕小鼠短期大量攝入乙醇而導(dǎo)致的酒精性肝損傷，為臨床應(yīng)用急性肝損傷提供理論基礎(chǔ)。上述活性作用可能與其富含黃酮類、多酚、皂苷、還原糖、有機酸等活性成分有關(guān)[9-11]。關(guān)于風(fēng)柜斗草醇提物濃度達到何值會造成副作用的毒理學(xué)實驗以及風(fēng)柜斗草醇提物化學(xué)成分與藥效的關(guān)系有待進一步研究。