蓮衣粉多酚提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

劉洋坪 王建輝 劉冬敏 劉永樂 黃軼群 王發(fā)祥 李向紅 俞 健

(長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南 長沙 410114)

蓮是睡蓮科(Herbaceous plant)植物蓮屬(NelumbonuciferaGaertn)多年生水生草本植物，其成熟果實稱為蓮子[1]。我國是產(chǎn)蓮大國，2018年我國蓮子產(chǎn)量達15.48萬t。目前，蓮子主要經(jīng)干燥、去殼(果皮)、去皮(種皮)、去芯(胚芽)等初加工后應用于食品行業(yè)。紅蓮機械磨皮(去種皮)過程中會產(chǎn)生大量蓮衣粉(lotus seed peel wagte, LSPW)，又稱為蓮子磨皮粉、紅衣粉、紅皮粉或外皮粉，主要由蓮衣(種皮)和部分蓮子仁組成，約占蓮子總質量的15%～20%，尚無有效利用途徑，但其可能富含黃酮、酚酸等多酚類物質，可作為多酚的潛在來源[2-4]。

多酚提取的傳統(tǒng)方法有索氏抽提法、浸提法和滲濾法等，新興方法則以超聲輔助法、微波輔助法、超聲-微波協(xié)同輔助法、加壓液體萃取法和超臨界流體萃取法等為主[5]。但目前采用傳統(tǒng)浸提法提取植物多酚仍較多[6]。對于富含淀粉的植物原料，因疏水相互作用形成的淀粉-多酚包合物會阻礙浸提溶液的有效浸入，從而降低浸提效率，而酸性溶液能夠促使淀粉水解，促進多酚從淀粉-多酚包合物中溶出[7-8]。乙醇作為安全性高的有機浸提溶劑，已被廣泛用于提取植物多酚[9]。研究表明，利用鹽酸或乙酸-乙醇水溶液能高效浸提植物多酚，其中乙酸-乙醇水溶液浸提法更適用于食品工業(yè)[10-12]。

迄今，國內外對蓮衣粉多酚提取工藝優(yōu)化的研究較少。高航等[13]利用微波輔助60%乙醇提取蓮衣粉多酚，僅耗時9.5 min，但其物料處理量相對較低。彭芳剛等[14]利用響應面法優(yōu)化了蓮衣粉原花青素的提取工藝，但使用的丙酮溶劑毒性大，且對酚酸類多酚的提取能力較弱[15]。前人研究均未考慮蓮衣粉富含淀粉的物料特性，因此，本研究擬采用乙酸-乙醇水溶液浸提蓮衣粉多酚，通過單因素試驗及響應面Box-Behnken試驗設計優(yōu)化蓮衣粉多酚提取工藝，測定蓮衣粉多酚提取物(polyphenols extract from LSPW，PEL)的基本組成及其抗氧化活性，挖掘其抗氧化潛能，旨在為蓮衣粉的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮衣粉，湖南宏興隆湘蓮食品有限公司，含水量為9.87%±0.03%，淀粉含量為31.48%±0.28%(干基)，其中直鏈淀粉占淀粉總質量的39.45%。過80目篩，于-18℃冷藏備用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 2- diohenyl- 2- trinitrophenylhydrazine，DPPH)，西格瑪奧德里奇公司；三吡啶三嗪(tripyridine triazine，TPTZ)，上海麥克林生化科技有限公司；亞油酸(60%～74%)，2-硫代巴比妥酸(生物試劑)，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、冰乙酸、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、無水乙酸鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、硫酸氰胺、三氯乙酸、一水合沒食子酸、福林酚、苯酚、硫酸、抗壞血酸鈉、磷酸二氫鈉、氯化亞鐵、鹽酸，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設備

DZKW-4型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；LD5-10型低速離心機，北京京立離心機有限公司；TU-1901型紫外-可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司； RE-2000B型旋轉蒸發(fā)器，鄭州予華儀器制造有限公司；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機、SB-5200型臺式雙頻超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；AUY120型分析天平，日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蓮衣粉多酚的測定 采用Folin酚比色法[16]，按照公式計算多酚得率：

m=C×V×d×10-6

(1)

Y=m/M×100%

(2)

式中，m為總提取液中多酚的質量，g；C為依據(jù)標準曲線計算的多酚濃度，μg·mL-1；V為總提取液體積，mL；d為總提取液的稀釋倍數(shù)；M為蓮衣粉的干基質量，g。

1.3.2 蓮衣粉多酚提取及響應面設計

1.3.2.1 蓮衣粉多酚提取工藝 按一定的液料比向蓮衣粉中添加乙酸-乙醇水溶液，水浴保溫，每5 min振蕩混勻一次。浸提液于4 500 r·min-1離心10 min，取上清液，于4℃靜置30 min，再于4 500 r·min-1二次離心10 min，取上清液，定容，測定多酚含量。

1.3.2.2 單因素試驗 以乙醇濃度40%、提取溫度75℃、提取時間35 min、液料比25 mL·g-1、乙酸添加量1.00 mL·100 mL-1[V乙酸:(V乙醇+V水)]為固定水平，分別考察乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%)、提取溫度(60、65、70、75、80℃)、提取時間(5、20、35、50、65、80 min)、液料比(15、25、35、45、55、65、75 mL·g-1)及乙酸添加量(0、0.30、1.00、1.70、2.40、3.10 mL·100mL-1)對蓮衣粉多酚得率的影響，進行初步優(yōu)化。

1.3.2.3 響應面Box-Behnken試驗設計 根據(jù)單因素試驗結果，采用Design-Expert 10軟件進行三因素三水平Box-Behnken試驗設計，見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計

1.3.3 蓮衣粉多酚提取物的制備 將最佳提取工藝條件下的提取液于45℃旋蒸濃縮去除乙醇，經(jīng)真空冷凍干燥(≤10 Pa，-46℃，48 h)，即得PEL。

1.3.4 PEL基本成分含量測定 多酚含量測定同1.3.1；總糖含量采用DNS法測定[17]；粗蛋白含量采用GB 5009.5-2016凱氏定氮法測定[18]；灰分含量按照GB 5009.4-2016測定[19]；水分含量采用GB 5009.3-2016直接干燥法測定[20]。

1.3.5 乙醇法沉淀可溶性多糖 參考楊軍國等[21]的方法，稍作修改。利用70%乙醇水溶液按100 mL·g-1的液料比沉淀PEL中的可溶性多糖，240 r·min-1室溫振蕩2 h，再4 500 r·min-1離心10 min，上清液45℃旋蒸濃縮去除乙醇。最后將濃縮液和沉淀進行真空冷凍干燥，獲得2個組分：醇溶物(70- dissolved fraction，70-DF)和沉淀(70- precipitation fraction，70-PF)。

多酚含量的測定：同1.3.1；可溶性多糖含量的測定：苯酚-硫酸法[22]。利用多酚和葡萄糖的標準曲線分別計算PEL、70-DF和70-PF中多酚和可溶性多糖的含量。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定 參考Liu等[23]的方法。DPPH自由基清除率(AA)按照公式計算：

AA=[1-(As-Ab)]/Ac×100%

(3)

式中，As為2.0 mL樣液+2.0 mL DPPH工作液的吸光度值；Ab為2.0 mL樣液+2.0 mL無水乙醇的吸光度值；Ac為2.0 mL無水乙醇+2.0 mL DPPH工作液吸光度值。試劑空白為2.0 mL去離子水+2.0 mL無水乙醇。

1.3.7 Fe3+還原能力的測定 參考Deng等[24]的方法，稍作修改。以FeSO4為標準品作標準曲線，F(xiàn)e3+還原能力以FRAP值(ferric ion reducing antioxidant power)表示，μmol·L-1Fe2+。

1.3.8 抗脂質氧化能力的測定 參考Sharma等[25]的方法，稍作修改。于試管中加入4.0 mL完全溶解的樣液(1 000 μg·mL-1)、4.1 mL 2.51%亞油酸(無水乙醇配制)、8.0 mL 0.02 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)、3.9 mL去離子水，混勻，水浴(45℃)避光6 d，再分別用硫氰酸鐵法(ferric thiocyanate method，F(xiàn)TC法)(500 nm處)、硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid method，TBA法)(532 nm處)測定樣液的抗脂質氧化能力，空白組用0.1 mL去離子水代替樣液。以脂質氧化抑制率(inhibition rate of lipid oxidation，IR)表示抗脂質氧化能力，按照公式計算IR：

IR=(Ac-As)/Ac×100%

(4)

式中，Ac為空白組的吸光度值；As為樣液的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

利用Origin 9.0軟件制圖，SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析；采用Design-Expert 10軟件進行響應面Box-Behnken試驗數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對蓮衣粉多酚得率的影響 由圖1-A可知，隨著乙醇濃度的增加，蓮衣粉多酚得率先增后降(P<0.05)，乙醇濃度為40%時其得率最高(7.96%)。根據(jù)相似相溶原理，40%乙醇溶液的極性可能最接近蓮衣粉多酚，使其溶解效果最佳[26]。故選用40%作為蓮衣粉多酚提取的最佳乙醇濃度。

2.1.2 提取溫度對蓮衣粉多酚得率的影響 由圖1-B可知，提取溫度對蓮衣粉多酚得率無顯著影響(P>0.05)。當提取溫度大于70℃時，蓮衣粉多酚得率的增長率逐漸變小。這可能是由于隨著提取溫度的升高傳質效率提高，雖有利于多酚浸出[27]，但由于蓮衣粉富含淀粉，溫度升高會伴隨淀粉糊化程度加劇，導致有效浸提溶液體積減少，在一定程度上阻礙了多酚的浸出[28]。故選用70℃作為后續(xù)試驗的提取溫度。

2.1.3 提取時間對蓮衣粉多酚得率的影響 由圖1-C可知，提取時間對蓮衣粉多酚得率無顯著影響(P>0.05)。當提取時間大于20 min時，隨提取時間的延長，多酚得率趨于平穩(wěn)。說明當提取時間為20 min時，蓮衣粉中的多酚與溶劑達到溶出平衡。故選用20 min作為后續(xù)試驗的提取時間。

2.1.4 液料比對蓮衣粉多酚得率的影響 由圖1-D可知，在15～55 mL·g-1液料比范圍內，隨著液料比的增加，蓮衣粉多酚得率顯著增加(P<0.05)，當液料比大于55 mL·g-1時，蓮衣粉多酚得率趨于平穩(wěn)。這主要是由于液料比增大導致物料與溶劑的接觸面積增加，溶質分子在固-液兩相中的濃度差維持能力增強，溶質擴散速度得以提高，蓮衣粉多酚得率增加。但繼續(xù)增大液料比，濃度差維持能力增幅變小，溶質得率趨于平緩[29]。故選用55 mL·g-1作為蓮衣粉多酚提取的最佳液料比。

2.1.5 乙酸添加量對蓮衣粉多酚得率的影響 由圖1-E可知，當乙酸添加量高于0.30 mL·100mL-1時，蓮衣粉多酚得率先顯著增加(P<0.05)，乙酸添加量達1.00 mL·100mL-1后得率再無顯著差異(P>0.05)。這可能是由于添加乙酸降低了溶液的pH，有利于多酚的穩(wěn)定[30]。而淀粉的酸水解則促進了蓮衣粉中結合酚的釋放和溶出[7]。但由于乙酸的電離度有限，最終導致蓮衣粉多酚得率趨于穩(wěn)定。故選用1.00 mL·100mL-1作為蓮衣粉多酚提取的最佳乙酸添加量。

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 Box-Behnken試驗設計方案及結果 選取乙醇濃度、液料比和乙酸添加量3個因素，按表2進行Box-Behnken試驗設計，試驗結果同表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設計方案及結果

2.2.2 回歸方程模型的建立及顯著性檢驗 運用Design-Expert 10軟件對表2的數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得到二次回歸方程模型：

Y=0.361 82A+0.234 83B+1.691 58C+0.000 13AB+0.005 4AC-0.022 86BC-0.004 66A2-0.001 74B2-0.180 61C2-5.915 20

表3 回歸方程模型的方差分析及顯著性檢驗

2.2.3 響應面分析 由圖2-A、C可知，當乙酸添加量為0.30 mL·100mL-1時，蓮衣粉多酚得率隨液料比的增加而明顯增加；當乙酸添加量≥1.00 mL·100mL-1時，蓮衣粉多酚得率先隨液料比的增加而明顯增加，之后趨于平緩；當液料比固定為45 mL·g-1時，蓮衣粉多酚得率隨乙酸添加量的增加而明顯增加；當液料比固定為55 mL·g-1時，蓮衣粉多酚得率隨乙酸添加量的增加先快速增加后緩慢變化；當液料比固定為65 mL·g-1時，蓮衣粉多酚得率隨乙酸添加量的增加先緩慢增加后無明顯變化。這可能是由于液料比或乙酸添加量的增加能有效維持傳質推動力[29]?？傮w上，二者對傳質推動力的影響表現(xiàn)為：液料比>乙酸添加量。

由圖2-B、C可知，BC交互作用對蓮衣粉多酚得率的影響明顯，該結果與模型的方差分析及顯著性檢驗結果一致。

2.2.4 最佳提取工藝條件預測及驗證試驗 利用Design-Expert 10軟件對模型進行預測，獲得蓮衣粉多酚提取工藝的最佳條件為：乙醇濃度40.508%，液料比58.868 mL·g-1，乙酸添加量1.559 mL·100 mL-1， 此條件下蓮衣粉多酚得率的預測值為9.64%。為提高工藝條件的操作可行性，驗證試驗將響應面優(yōu)化所得的各工藝參數(shù)設置為：乙醇濃度41%，液料比59 mL·g-1，乙酸添加量1.56 mL·100mL-1。 在此條件下重復試驗3次，蓮衣粉多酚平均得率為9.65%，與預測值的相對誤差為0.10%。說明該模型預測的最佳提取工藝條件可靠。

2.3 PEL的基本組成分析

PEL的水分含量為6.42%。由表4可知，PEL的多酚、總糖含量占比最高，分別為24.03%和45.28%(干基)。這說明乙酸-乙醇水溶液在浸提出蓮衣粉多酚的同時，也能高效浸提出蓮衣粉中的糖類。

表4 PEL的基本組成分析

圖2 Y=F(B, C)的交互作用圖(A)、響應面立體圖(B)及等高線圖(C)

2.4 乙醇法沉淀可溶性多糖的效果

由表5可知，PEL中可溶性多糖含量為34.04%，在總糖中占比達75.18%。70-DF中可溶性多糖含量顯著低于PEL，而多酚含量顯著高于PEL(P<0.05)。表明70%乙醇水溶液可析出PEL中較高比例的可溶性多糖，并使得70-DF中多酚含量有所提高。

表5 PEL、70-DF和70-PF中多酚、可溶性多糖的含量比較

2.5 體外抗氧化活性及其主效成分分析

由圖3可知，低濃度的維生素C(vitamin C，Vc)與DPPH自由基清除率、FRAP值存在良好的線性量效關系。PEL、70-DF清除DPPH自由基的半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)分別為0.032 和0.040 mg·mL-1，高于Vc的IC50(0.013 mg·mL-1)，但明顯低于前人研究中蓮衣粉乙醇提取物和甲醇提取物的IC50(0.073、0.078 mg·mL-1)[31]。表明PEL、70-DF均具有較強的DPPH自由基清除能力，但不及Vc。70-PF的IC50為0.084 mg·mL-1。 PEL、70-DF和70-PF還原Fe3+能力分別為268.6、237.68和173.19 mg AAE·g-1(以Vc的當量計)。當PEL、70-DF和70-PF的質量濃度均為1 000 μg·mL-1時，PEL的抗脂質氧化能力優(yōu)于70-DF和70-PF，其對脂質氧化的抑制率為36.82%(FTC法)或59.32%(TBA法)，分別相當于TBHQ、BHA的37.12%、39.20%(FTC法)或72.92%、67.60%(TBA法)。盡管70-DF擁有較高的多酚含量，但總體上PEL的體外抗氧化活性強于70-DF和70-PF。

注：TBHQ：叔丁基對苯二酚；BHA：叔丁基羥基茴香醚。

由表6可知，多酚含量與DPPH自由基清除率、FRAP值和脂質氧化抑制率呈顯著或極顯著正相關，而可溶性多糖含量與抗氧化能力之間的相關性不顯著。因此，推測多酚是PEL、70-DF和70-PF抗氧化的主效成分。

表6 多酚、可溶性多糖與抗氧化能力之間的相關性分析

3 討論

植物多酚提取方法的選取一般以高效、綠色和低成本作為優(yōu)選原則。林樅雨等[32]研究發(fā)現(xiàn)超聲輔助法提取甜玉米芯多酚的效果明顯優(yōu)于浸提法，其提取耗時60 min，多酚得率為1.62%。郭宏垚等[33]比較不同溶劑對花椒多酚得率的影響，發(fā)現(xiàn)丙酮>乙醇>甲醇，但由于丙酮危險性高，最終優(yōu)選乙醇作為其提取溶劑。本研究前期發(fā)現(xiàn)，相比于浸提法，超聲輔助法提取蓮衣粉多酚未能有效提高得率，考慮到綠色和低成本等因素，選用乙醇水溶液浸提蓮衣粉多酚。然而，多酚的提取工藝與原料特性密切相關，酸性溶液有利于富含淀粉原料中結合酚的提取[34]。基于此，本研究最終采用乙酸-乙醇水溶液浸提蓮衣粉多酚，綜合運用單因素試驗及響應面Box-Behnken試驗設計優(yōu)化得到蓮衣粉多酚的最佳提取工藝為乙醇濃度41%、液料比59 mL·g-1、乙酸添加量1.56 mL·100mL-1、提取溫度70℃、提取時間20 min，此條件下蓮衣粉多酚得率為9.65%。受限于試驗條件，本研究未能展開比較不同提取方法對提高蓮衣粉多酚得率的作用效果。

植物粗提物在食品中的應用往往取決于其中的主效成分。本研究發(fā)現(xiàn)PEL的體外抗氧化活性強于70-DF和70-PF。PEL清除DPPH自由基的能力優(yōu)于王超等[31]的蓮衣粉乙醇提取物和甲醇提取物，這可能是由于PEL的水分含量明顯低于蓮衣粉乙醇提取物和甲醇提取物，導致PEL中的多酚含量更高。PEL還原Fe3+的能力較強，且具有優(yōu)良的抗脂質氧化能力。通過抗氧化能力與多酚、可溶性多糖含量的相關性發(fā)現(xiàn)，PEL抗氧化的主效成分可能為多酚。有研究表明，蓮衣粉多糖提取物也具有較強的抗氧化活性[35]，結合本研究可推測其抗氧化活性可能與多酚存在一定的關聯(lián)。同時也表明，今后對于PEL的抗氧化活性研究仍有待進一步開展。

4 結論

本研究特征性地以乙酸-乙醇水溶液作為提取蓮衣粉多酚的浸提液，結果表明，蓮衣粉多酚的最佳提取工藝為：乙醇濃度41%、液料比59 mL·g-1、乙酸添加量1.56 mL·100mL-1、提取溫度70℃、提取時間20 min，此條件下蓮衣粉多酚得率為9.65%。PEL的多酚含量達24.03%，其清除DPPH自由基、還原Fe3+的能力較強，且具有一定的抗脂質氧化能力，有望作為食品中潛在的天然抗氧化劑。PEL中可溶性多糖含量為34.04%，但相關性分析表明其并非PEL抗氧化的主效成分，因此，可進一步研究去糖工藝來純化PEL中的多酚，明確PEL中各多酚組分的抗氧化功效，進一步拓展其在功能性食品中的應用。