多花水仙種球膨大期對乙烯的響應(yīng)研究

姜 琳 孫 興 羅可欣 郭志雄,2 陳桂信,2 佘文琴,2 潘東明,2 潘騰飛,2,*

(1 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2 福建農(nóng)林大學(xué)園藝產(chǎn)品貯運保鮮研究所，福建 福州 350002)

乙烯是一種重要的植物激素，廣泛存在于高等植物中，對生長發(fā)育起重要作用[1]。細胞的分化如種子萌發(fā)[2]、鱗莖膨大[3]等過程均受乙烯的調(diào)控，尤其是對半水生植物，乙烯能夠刺激葉片萌發(fā)[4]，以上反應(yīng)是乙烯通過信號傳導(dǎo)途徑進行響應(yīng)的[5]。

乙烯響應(yīng)因子(ethylene response factor，ERF)為植物特有轉(zhuǎn)錄因子，是乙烯傳導(dǎo)途徑中最下游元件[6]，屬AP2/ERF大家族中的其中一個亞家族[7]。AP2/ERF基因家族龐大，每種植物有100 種以上ERF 轉(zhuǎn)錄因子[8-9]。ERF作為乙烯信號傳導(dǎo)途徑的最后一個受體蛋白，能夠激活目標(biāo)基因的表達，通常參與生物及非生物脅迫的響應(yīng)過程[10]。在眾多的ERF轉(zhuǎn)錄因子中，只有少數(shù)參與乙烯介導(dǎo)的生長調(diào)控，表現(xiàn)出正調(diào)控和負調(diào)控功能[11-12]。吳凡等[13]在牡丹(Paeoniasuffruticosa)花瓣的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到3個ERF轉(zhuǎn)錄因子，并通過試驗表明PsERF1參與乙烯響應(yīng)途徑，PsERF2和PsERF3卻參與多種信號調(diào)控途徑。

水仙[NarcissustazettaL. var.chinensis(M. Roem.)]是典型的夏休眠球根類花卉，3—5月為球根類花卉鱗莖膨大期，在此期間，種球迅速膨大，是營養(yǎng)生長期，為7月下旬的花芽分化積累養(yǎng)分[14-15]。研究表明，一定濃度的乙烯能夠促進洋蔥(Alliumcepa)種球的生長[16]，糖和乙烯共同調(diào)控乙烯信號傳導(dǎo)途徑中CTR1轉(zhuǎn)錄因子的表達[17]，但對ERF轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控尚未明確，乙烯對水仙種球的營養(yǎng)生長的作用也鮮見報道。為研究乙烯在水仙鱗莖膨大過程中的作用，本試驗擬通過測定種球膨大期乙烯含量的變化，研究ERF基因的表達規(guī)律，探討其與種球生長的關(guān)系，以期為進一步了解水仙種球的生長發(fā)育提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以漳州市龍文區(qū)蔡坂村第二年栽培的漳州多花水仙種球為試驗材料，種球露地栽培。取樣時期從2018年3月14日至2018年5月13日，每隔10 d取樣一次，分別選取鱗片，內(nèi)芽的組織樣品(取樣部位如圖1所示)，用于乙烯釋放量測定和基因表達量分析。所有樣品均設(shè)置3個生物重復(fù)。

圖1 多花水仙種球縱切圖

從福建農(nóng)林大學(xué)園藝產(chǎn)品貯藏保鮮研究所獲得的水仙種球內(nèi)芽和鱗片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選得到7個在種球膨大期間有差異表達(FDR<0.01且Fold Change≥2)的NtERFs基因。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 多花水仙總RNA提取采用Trizol試劑法；cDNA合成采用PrimeScript RT reagent Kit試劑盒(大連TaKaRa公司),具體操作參照試劑盒說明書進行。

1.2.2 乙烯氣體釋放量測定 采用ETD-300乙烯測定儀(荷蘭Sensor Sense公司)測定多花水仙乙烯釋放量。乙烯檢測儀通電預(yù)熱60 min后，打開烴分解器預(yù)熱5 min，分別將鱗片和內(nèi)芽裝進樣品室后連接到閥門控制箱，閥門控制箱壓強控制在0.1 MPa，選擇積累測定模式，測定流速5 L·h-1。乙烯氣體在樣品室中積累30 min后測定乙烯釋放量，每組處理重復(fù)測定3次。

1.2.3 實時熒光定量PCR 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到的NtERFs基因序列設(shè)計實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)引物。采用Beacon Designer軟件設(shè)計引物，驗證基因可行性，引物序列見表1，選用actin為內(nèi)參基因。

表1 ERFs基因qRT-PCR引物序列

1.2.4 qRT-PCR反應(yīng)體系及程序 參照SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNase plus)(大連TaKaRa公司)說明書，使用qtower 3.0定量PCR儀(德國耶拿公司)進行定量分析，PCR反應(yīng)條件為PCR反應(yīng)激活95℃預(yù)變性30 s，95℃ 變性5 s，60℃ 退火延伸30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT的計算方法分析相對表達量，以第一個時期的表達量為對照。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)使用軟件SPSS 21.0進行統(tǒng)計。采用Duncan檢驗進行樣品間的差異顯著性分析，用Excel制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水仙各部位乙烯釋放量的變化

由圖2可知，從3月份至5月下旬，水仙種球的重量逐漸增加，說明該時期為水仙的營養(yǎng)生長期，種球在不斷增大。在整個膨大期，不同部位的乙烯釋放量各不相同(圖3)。水仙鱗片的乙烯釋放量在3月下旬至5月上旬之間無顯著差異，5月中旬乙烯釋放量顯著上升，釋放量為0.39 nL·h-1·g-1。內(nèi)芽釋放的乙烯量明顯高于鱗片，乙烯釋放高峰出現(xiàn)在4月下旬(釋放量為7.27 nL·h-1·g-1)，比鱗片提前出現(xiàn)釋放高峰，隨后又呈現(xiàn)下降的趨勢，到5月中旬略有上升的趨勢。根據(jù)內(nèi)芽乙烯的釋放規(guī)律推測，內(nèi)芽釋放的乙烯可能與種球的膨大有關(guān)，且能夠誘導(dǎo)鱗片乙烯的釋放。在漳州地區(qū)，水仙種球的地上部在5月份出現(xiàn)黃化萎蔫，說明水仙種球鱗片乙烯釋放與地上部的衰老有關(guān)。

注：不同小寫字母表示不用時期的樣品差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 水仙膨大期鱗片NtERFs的表達規(guī)律分析

定量分析結(jié)果表明，水仙NtERFs基因在膨大期鱗片中的表達差異顯著(圖4)。其中，NtERF1、NtERF3、NtERF4、NtERF22和NtERF118的表達量在5月下旬顯著高于其他時期，NtERF1、NtERF4和NtERF118的表達量在種球膨大期間呈現(xiàn)顯著上升的趨勢，而NtERF3和NtERF22則表現(xiàn)上升-下降-上升的變化趨勢，分別在4月上旬和3月下旬出現(xiàn)第一次釋放高峰。NtERF2的表達量表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢，在4月中旬出現(xiàn)表達高峰。NtERF26的表達量在3月份最高，而后下降，在4月下旬又顯著升高。NtERF2和NtERF26的表達量均在4月23日內(nèi)芽乙烯釋放高峰期顯著升高，這2個NtERFs可能是鱗片對內(nèi)芽釋放的乙烯的響應(yīng)因子。從相對表達量變化來看，NtERF4和NtERF118的相對表達量從3月中旬到5月中旬分別升高2.2倍和2.4倍；NtERF1的相對表達量高于其他的NtERFs基因的相對表達量，5月中旬的相對表達量是3月中旬的5.1倍，且NtERF1表達與鱗片的乙烯釋放規(guī)律一致，因此推測，NtERF1、NtERF4和NtERF118參與了鱗片乙烯信號的響應(yīng)以及水仙種球的生長，NtERF1可能是關(guān)鍵的因子。

注：A: 水仙鱗片乙烯釋放量；B:水仙內(nèi)芽乙烯釋放量。

2.3 水仙膨大期內(nèi)芽NtERFs的表達規(guī)律分析

水仙種球內(nèi)芽NtERFs的定量分析結(jié)果表明(圖5)，NtERF1基因在4月3日出現(xiàn)表達高峰，表達量是其他時期的2.5～9.0倍；NtERF2在4月23日的表達量是其他時期的7倍左右，其他時期的表達量維持在較低水平，且無顯著性差異，NtERF2的表達高峰與內(nèi)芽的第二次乙烯釋放高峰期相吻合，因此推測NtERF2基因可能是參與內(nèi)芽乙烯信號響應(yīng)的重要因子。NtERF3和NtERF4表達規(guī)律與內(nèi)芽乙烯的釋放規(guī)律基本相符，說明NtERF3和NtERF4也可能參與了內(nèi)芽對乙烯的響應(yīng)；NtERF22的表達量在5月初顯著高于其他時期，NtERF26和NtERF118的表達量在4月底顯著升高，但這5個NtERFs的相對表達量較低，可能不是內(nèi)芽乙烯釋放和響應(yīng)的主要因子。

注：1～7分別表示3月14日、3月24日、4月3日、4月13日、4月23日、5月3日、5月13日。下同。

圖5 水仙膨大期內(nèi)芽NtERFs基因的表達量變化

3 討論

研究表明，乙烯抑制植物的生長，如在根系發(fā)育早期，乙烯抑制了根系伸長[18-20]。然而，根據(jù)Pierik等[21]提出的雙相乙烯反應(yīng)模型，乙烯對根系伸長既有抑制作用又有促進作用。Abts等[22]研究表明在甜菜根發(fā)育早期，生長素促進乙烯的合成，從而促進了根的生長發(fā)育，這可能是由于乙烯對木質(zhì)部的生長起到促進的作用[23]，外源乙烯的處理證實了乙烯能夠刺激形成層和不定根的生長[24-25]。對乙烯敏感型的番茄，乙烯能夠影響其營養(yǎng)生長，在乙烯缺乏的情況下，番茄成年植株顯示出與乙烯相關(guān)的典型變化，如葉片變白、花期提前和果實脫落加速等[26]。乙烯也能影響鱗莖的生長發(fā)育。在洋蔥鱗莖分化過程中，乙烯作為鱗莖形成的直接誘導(dǎo)物質(zhì)參與其中[27]。方少忠等[3]研究表明乙烯可誘導(dǎo)百合試管鱗莖的形成和膨大。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)芽乙烯的釋放高峰出現(xiàn)在4月下旬，在同一時期種球處于迅速生長階段，說明乙烯可能參與了水仙鱗莖的發(fā)育生長過程，這與前人的研究結(jié)果一致。

ERF蛋白存在于表現(xiàn)出乙烯三重反應(yīng)的植物中，與乙烯的生物合成和信號傳導(dǎo)有關(guān)[28]。ERFs是乙烯信號傳遞途徑的最后一個下游受體，其傳遞的信號與ERF基因的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)[29]，且與乙烯調(diào)控的生長控制有關(guān)，具有正調(diào)控和負調(diào)控功能[30]。前人研究表明，ERF蛋白通過調(diào)控乙烯生物合成基因的表達參與乙烯生成的反饋調(diào)節(jié)[31]。抑制ERF蛋白的活性能夠下調(diào)氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶(Aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)和氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO)基因的表達量，減少乙烯生成量[26]。ERF1是ERF家族成員之一，含有ERF DNA結(jié)合區(qū)域[32]。Yu等[33]研究發(fā)現(xiàn)ERF1正調(diào)控乙烯信號，與生長發(fā)育呈正相關(guān)。本研究通過分析NtERF1的表達規(guī)律，推測該基因可能在鱗莖發(fā)育的過程中也起到正調(diào)控作用。ERF2蛋白在煙草或番茄中能夠激活乙烯合成途徑基因的表達[34]，過表達SlERF2基因能夠引起乙烯的釋放，導(dǎo)致番茄(Solanumlycopersicum)果實早熟，刺激種子萌發(fā)[35]，MdERF2能夠受到乙烯的調(diào)節(jié)而在蘋果(Malusdomestica)果實中特異表達[36]，但MdERF2是通過抑制MdACS1基因的表達而負調(diào)控乙烯的生物合成[31]。相反，MdERF3作為MdACS1基因的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)其表達，MdERF2和MdERF3相互作用，共同調(diào)節(jié)乙烯的生物合成[31]。本研究發(fā)現(xiàn)鱗片中的NtERF2和NtERF3基因的表達水平也存在著此消彼長的關(guān)系，在5月中旬，NtERF2表達受到抑制，NtERF3的表達量顯著升高，從而產(chǎn)生大量乙烯，但是在內(nèi)芽中，NtERF2的表達量則與乙烯的釋放量呈正相關(guān)。因此，本研究認(rèn)為NtERF2和NtERF3基因調(diào)控乙烯生物合成的功能具有組織特異性，2個基因之間在種球中的相互關(guān)系還有待進一步研究。

乙烯通過乙烯信號途徑刺激維管細胞的分化[37]，也能通過與其他激素的相互作用，刺激細胞的生長[38]。研究表明，ERF3是根冠生長的的重要因子，通過調(diào)節(jié)參與細胞分裂素信號的基因表達，促進根冠的伸長生長[39]，ERF1和ERF4表達受乙烯和生長素的影響，與月季花瓣的生長和脫落有關(guān)[40]，在木本植物中，ERF118和ERF119是木質(zhì)部細胞的膨脹和次生細胞壁形成的重要調(diào)控因子，參與了茉莉酸和生長素介導(dǎo)的生理反應(yīng)[41]，關(guān)于ERF26的功能則鮮見報道。水仙種球中的水楊酸和玉米素與芽的生長有關(guān)[42]，本研究發(fā)現(xiàn)，在種球膨大期間，NtERFs基因能夠在鱗片和內(nèi)芽中響應(yīng)乙烯信號，但是這些基因的表達是否受到其他激素信號的影響還需要進一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在多花水仙種球膨大期，種球重量逐漸增加，鱗片釋放的乙烯與地上部的衰老有關(guān)，內(nèi)芽釋放大量的乙烯，所釋放的乙烯與種球的膨大有關(guān)，并且能夠誘導(dǎo)鱗片乙烯的釋放。NtERF1、NtERF4和NtERF118基因可能參與鱗片對乙烯信號的響應(yīng)，NtERF2、NtERF3、NtERF4和NtERF26基因則可能參與內(nèi)芽乙烯信號的響應(yīng)，NtERF2可能是鱗片響應(yīng)內(nèi)芽乙烯信號的紐帶，在種球乙烯的生物合成中具有關(guān)鍵作用。本研究初步分析了乙烯在多花水仙種球膨大期間的作用，為進一步了解水仙種球的生長發(fā)育提供了研究基礎(chǔ)，但由于相關(guān)研究基礎(chǔ)較少，今后應(yīng)進一步挖掘乙烯信號途徑中的相關(guān)受體基因，明確乙烯在多花水仙種球生長發(fā)育過程中的作用及其信號傳遞過程。