海稻86響應(yīng)堿脅迫調(diào)節(jié)氮代謝的生理與分子機(jī)制

車永梅 徐 青 楊德翠 趙方貴 盧松沖 劉 新

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

我國現(xiàn)有鹽堿地約15億畝，其中海岸灘涂鹽堿地多達(dá)1億畝，由于不合理灌溉及化學(xué)肥料過量使用，土壤鹽堿化有進(jìn)一步加劇的趨勢[1]，導(dǎo)致土壤鹽堿化成為世界范圍內(nèi)影響植物分布和農(nóng)作物產(chǎn)量的主要非生物逆境之一。一般將以NaCl和Na2SO4等中性鹽為主的土壤稱為鹽土，以碳酸氫鹽(HCO3-)和碳酸鹽(CO32-)為主的土壤為堿土，堿脅迫對植物的傷害較鹽脅迫更嚴(yán)重、更復(fù)雜[2-5]。水稻是世界范圍內(nèi)廣泛種植的主要糧食作物，但目前大部分水稻栽培品種對堿脅迫比較敏感，海稻86是原生長于廣東湛江遂溪海灘的水稻品種，具有極強(qiáng)的耐堿性[6]，闡明其耐堿機(jī)制，可為培育耐堿脅迫的水稻品種提供重要理論指導(dǎo)，對于沿海灘涂鹽堿地的開發(fā)利用具有重大意義。

氮元素是植物必需的大量元素，是構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸等重要物質(zhì)的組成成分，被稱為植物生命元素。研究發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫會(huì)降低植株氮元素含量，干擾植物氮的代謝過程[7-8]，如引起甜菜葉片以及番茄根和葉片硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)和谷氨酸合酶(glutamate synthetase，GOGAT)活性以及硝態(tài)氮(NO3--N)含量降低，提高銨態(tài)氮(NH4+-N)含量和谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenases，GDH)活性[9-10]。堿脅迫條件下，敏感型水稻品種日本晴根部NO3-含量顯著降低，葉片和根部NR、GOGAT和GS基因表達(dá)量下調(diào)[11]。不同抗性的植物品種對堿脅迫的反應(yīng)存在差異，堿脅迫和鹽堿脅迫下抗鹽堿性強(qiáng)的水稻和甜菜品種比敏感品種能保持較高NR等氮代謝相關(guān)酶活性或基因表達(dá)量[9,12]。但目前關(guān)于堿脅迫對植物氮代謝影響的研究尚不深入。本研究以抗堿性水稻品種海稻86和堿敏感水稻品種珍汕97為材料，研究堿脅迫下水稻根和葉中氮代謝的變化，以探究其耐堿的生理和分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)

試驗(yàn)材料為抗堿性水稻(Oryzasativa)品種海稻86以及堿敏感品種珍汕97。試驗(yàn)在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

水稻種子用0.1%(w/v)的HgCl2消毒10 min，蒸餾水沖洗干凈，于蒸餾水中浸泡12 h后，播于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽至萌發(fā)。

將萌發(fā)后的種子播于96孔板中進(jìn)行水培，于14 h光照/10 h黑暗、29℃/25℃(白天/夜晚)條件下培養(yǎng)，12 d后進(jìn)行堿脅迫處理。

1.2 試驗(yàn)材料的處理

水稻幼苗用Na+濃度為50 mmol·L-1的堿處理液(含Na2CO3、NaHCO3和Na2SO4的混合液，pH值9.0的1/4 Hoagland營養(yǎng)液)或pH值6.0的1/4 Hoagland營養(yǎng)液(對照植株，CK)處理24 h，取根和葉，用于測定基因相對表達(dá)量，4 d后，取根和葉，用于生理指標(biāo)的測定。每天更換一次培養(yǎng)液。

1.3 不同含氮物質(zhì)含量的測定

氨態(tài)氮含量測定參照劉萍等[13]的方法；硝態(tài)氮含量測定采用水楊酸-硫酸顯色法[14]；可溶性蛋白含量測定參考Zhao等[15]的方法并稍作改進(jìn)；脯氨酸含量采用高俊鳳[16]的方法。

1.4 氮代謝相關(guān)酶活性的測定

NR活性測定采用亞硝酸離子顯色法[17]；GS活性測定采用FeCl3絡(luò)合顯色比色法[18]；GDH活性測定參照葉利庭等[19]的方法；GOGAT活性測定參照李澤松等[20]的方法。

1.5 氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量測定

采用改良Trizol法提取水稻總RNA[21]。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測基因表達(dá)量，在NCBI找到基因序列，用Primer Blast設(shè)計(jì)引物，所用引物見表1。

PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(日本TaKaRa Bio公司)反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板。實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。以Actin為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

試驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Tukey法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫對海稻86和珍汕97含氮物質(zhì)含量的影響

由圖1-A、B可知，非脅迫條件下海稻86根和葉中脯氨酸的含量與珍汕97無顯著差異(P>0.05)；堿脅迫條件下兩個(gè)品種根和葉片脯氨酸含量均較非脅迫條件下顯著升高，其中海稻86根中脯氨酸含量較非脅迫下CK升高4.67倍，升高幅度明顯大于珍汕97的3.48倍。非脅迫條件下海稻86根中可溶性蛋白含量與珍汕97無顯著差異，葉片可溶性蛋白含量顯著大于珍汕97(P<0.05)；堿脅迫條件下海稻86根和葉片可溶性蛋白含量與非脅迫條件下無顯著變化，珍汕97葉片中可溶性蛋白含量則較非脅迫條件下顯著降低(P<0.05)(圖1-C、D)。與非脅迫條件相比，堿脅迫顯著減低了海稻86和珍汕97根和葉片硝態(tài)氮含量(P<0.05)，其中珍汕97根中硝態(tài)氮含量較非脅迫下的CK降低74.09%，海稻86降低49.73%(圖1-E、F)。非脅迫條件下海稻86與珍汕97根中氨態(tài)氮含量無顯著差異，海稻86葉片氨態(tài)氮含量低于珍汕97；堿脅迫條件下，海稻86根和葉片氨態(tài)氮含量無顯著差異，珍汕97根中氨態(tài)氮含量顯著升高(P<0.05)(圖1-G、H)。

注: 不同小寫字母表示不同數(shù)據(jù)間顯著性差異(P<0.05)。下同。

圖2 堿脅迫對海稻86和珍汕97根和葉片NR活性和OsNR1表達(dá)量的影響

圖3 堿脅迫對海稻86和珍汕97根和葉片GS活性以及OsGS1;2和 OsGS2表達(dá)量的影響

2.2 堿脅迫對海稻86和珍汕97 NR活性和基因表達(dá)量的影響

NR是植物氮代謝的關(guān)鍵酶，催化NO3-還原為NO2-。由圖2-A、B可知，非脅迫條件海稻86根和葉片NR活性均顯著高于珍汕97，堿脅迫下海稻86及珍汕97根中NR活性均較非脅迫條件無顯著變化，葉片NR活性則顯著降低(P<0.05)，珍汕97降低幅度高于海稻86。堿脅迫誘導(dǎo)NR基因OsNR1表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)，珍汕97下調(diào)幅度高于海稻86(圖2-C、D)。NR活性和OsNR1表達(dá)量變化較一致。

2.3 堿脅迫對海稻86和珍汕97 GS活性和基因表達(dá)量的影響

水稻主要通過GS/GOGAT途徑同化NH4+。由圖3-A、 B可知，非脅迫條件下海稻86根部GS活性顯著高于珍汕97(P<0.05)，兩個(gè)水稻品種葉片GS活性無顯著差異；堿脅迫對海稻86 GS活性無顯著影響，但顯著降低了珍汕97 GS活性(P<0.05)。

OsGS1;2和OsGS2分別是在水稻根部和葉片中表達(dá)的主要OsGS家族基因，非脅迫條件下海稻86和珍汕97根部OsGS1;2表達(dá)量無顯著差異，海稻86葉片OsGS1;2表達(dá)量顯著高于珍汕97(P<0.05)；堿脅迫誘導(dǎo)珍汕97OsGS1;2表達(dá)量上調(diào)，但對海稻86OsGS1;2表達(dá)量無顯著影響(圖3-C、D)；堿脅迫條件下，海稻86和珍汕97根和葉片中OsGS2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖3-E、F)。

2.4 堿脅迫對海稻86和珍汕97 GOGAT活性和基因表達(dá)量的影響

GOGAT根據(jù)其電子供體的不同有NADH-GOGAT和Fd-GOGAT兩種類型，NADH-GOGAT主要存在于非光合組織，如根中，而Fd-GOGAT主要存在于光合組織中。正常條件下海稻86根和葉片NADH-GOGAT活性顯著高于珍汕97，堿脅迫誘導(dǎo)兩個(gè)水稻品種NADH-GOGAT活性顯著降低，珍汕97降幅大于海稻86(圖4-A、B)。堿脅迫對兩個(gè)水稻品種根中Fd-GOGAT無顯著影響，但誘導(dǎo)葉片F(xiàn)d-GOGAT活性升高(圖4-C、D)。水稻中NADH-GOGAT由OsNADH-GOGAT1和OsNADH-GOGAT2編碼，堿脅迫條件下兩個(gè)品種根和葉片OsNADH-GOGAT1和OsNADH-GOGAT2相對表達(dá)量均顯著升高，兩個(gè)水稻品種根中OsFd-GOGAT相對表達(dá)量有所降低，葉片中升高，海稻86顯著升高，珍汕97根中OsNADH-GOGAT1相對表達(dá)量顯著升高，葉中OsNADH-GOGAT1以及根和葉中OsNADH-GOGAT2相對表達(dá)量升高，但不顯著。

圖4 堿脅迫對海稻86和珍汕97根和葉片GOGAT活性以及OsFd-GOGAT和OsNADH-GOGAT表達(dá)量的影響

2.5 堿脅迫對海稻86和珍汕97 GDH活性和基因表達(dá)量的影響

GDH催化α-酮戊二酸與NH4+合成谷氨酸的可逆反應(yīng)。由圖5可知，堿脅迫對海稻86根和葉片NADH-GDH活性無顯著影響，但顯著提高珍汕97 NADH-GDH活性；堿脅迫下海稻86和珍汕97OsGDH1、OsGDH2、OsGDH3和OsGDH4表達(dá)量均有不同程度提高，珍汕97增幅大于海稻86。

3 討論

海稻86具有極強(qiáng)的耐鹽堿性[22-23]，但其耐堿脅迫的生理和分子基礎(chǔ)鮮見研究報(bào)道。氮元素是構(gòu)成核酸、蛋白質(zhì)和葉綠素等許多重要物質(zhì)的組成成分，維持氮代謝的穩(wěn)定對于植物適應(yīng)鹽堿脅迫至關(guān)重要[24]。本研究表明，在正常條件下海稻86和珍汕97兩個(gè)水稻品種根和葉片脯氨酸含量無顯著差別，堿脅迫誘導(dǎo)兩個(gè)品種脯氨酸含量顯著升高，海稻86根中脯氨酸含量增幅大于珍汕97(圖1-A、B)。脯氨酸是滲透脅迫條件下植物體內(nèi)合成的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，并具有清除活性氧，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)等作用[25-26]，根部與鹽堿直接接觸，受影響最直接，堿脅迫下，海稻86根中脯氨酸大量積累，表明其具有更強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力。同時(shí)，堿脅迫誘導(dǎo)珍汕97根和葉片可溶性蛋白和NO3-含量顯著降低，NH4+大量積累，海稻86可溶性蛋白和NO3-含量無顯著變化或下降幅度較小，根中NH4+積累量也顯著低于珍汕97(圖1-C、H)。NR、GS和GOGAT是參與硝酸鹽還原和氨同化的關(guān)鍵酶[27]，正常條件下海稻86根部和葉片NR、GS和GOGA顯著大于珍汕97，鹽堿脅迫顯著降低珍汕97的NR、GS和GOGA活性，海稻86酶活性無顯著變化或降幅顯著低于珍汕97，推測鹽堿脅迫下海稻86可溶性蛋白、NO3-和NH4+含量變化較小可能因其具有較高的氮代謝相關(guān)酶活性和較強(qiáng)的同化能力，珍汕97 NH4+大量積累可能與氨同化作用受抑制蛋白質(zhì)合成能力下降有關(guān)。堿脅迫下，海稻86 GDH活性無顯著變化，珍汕97則顯著升高。GDH對氨的親和力低，非脅迫條件下GDH不是參與氨同化的主要酶，水稻氨同化主要通過GS/GOGAT途徑進(jìn)行[27-28]，堿脅迫條件下珍汕97 GDH活性的顯著升高可能與氨的積累有關(guān)，可以部分緩解GOGAT/GS途徑減弱對氨同化的影響，防止游離態(tài)NH4+過多積累，這與Wang等[11,29-30]研究結(jié)果相似；他還發(fā)現(xiàn)鹽脅迫和堿脅迫條件下，鹽堿敏感的水稻品種日本晴(Nipponbare)和吉粳88(Jijing88)GDH基因表達(dá)量均顯著上調(diào)，認(rèn)為鹽堿脅迫導(dǎo)致其氮同化途徑發(fā)生改變，GOGAT/GS途徑減弱，GDH途徑加強(qiáng)。

進(jìn)一步檢測堿脅迫對氮同化相關(guān)酶基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，堿脅迫下，海稻86和珍汕97 NR以及GDH基因表達(dá)量與酶活性變化較一致，NR基因OsNR1表達(dá)呈下降趨勢，GDH基因OsGDH1、OsGDH2、OsGDH3及OsGDH4表達(dá)呈升高趨勢(圖2和圖5)；NADH-GOGAT基因表達(dá)變化與酶活性變化存在差異，NADH-GOGAT活性顯著降低，但OsNADH-GOGAT1和NADH-GOGAT2表達(dá)量顯著升高(圖4)，這與Shi等[27]研究結(jié)果類似，兩個(gè)氮利用效率不同的水稻品種，低氮條件下GS和NADH-GOGAT基因表達(dá)水平無顯著差別，但酶活性顯著不同，推測低氮條件下水稻幼苗根部GS和NADH-GOGAT活性的調(diào)節(jié)可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平；堿脅迫下海稻86和珍汕97 NADH-GOGAT活性變化與基因表達(dá)間的差異暗示存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，是否與mRNA的翻譯過程和酶蛋白的穩(wěn)定性有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。GS存在兩種形式GS1和GS2，GS1由OsGS1;1、OsGS1;2和OsGS1;3編碼，OsGS2編碼GS2，OsGS1;2和OsGS2分別是在水稻根部和葉片中表達(dá)的主要OsGS家族基因[11]。堿脅迫對兩個(gè)品種OsGS1;2和OsGS2表達(dá)的影響存在差異，堿脅迫下，海稻86和珍汕97根和葉片OsGS2表達(dá)量均顯著降低，海稻86根和葉片OsGS1;2無顯著變化，珍汕97根和葉片OsGS1;2表達(dá)量顯著升高，且表達(dá)量顯著高于海稻86，與兩個(gè)品種GS活性的表現(xiàn)不同，海稻86的GS活性顯著高于珍汕97(圖3)，猜測兩個(gè)水稻品種GS活性與基因表達(dá)變化的差異可能與堿脅迫誘導(dǎo)其他GS基因如OsGS1;1和OsGS1;3表達(dá)的變化有關(guān)。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)堿脅迫提高OsGS1;1和OsGS1;3在總表達(dá)量中的比例；Wang等[30]研究表明，鹽脅迫能誘導(dǎo)基因表達(dá)組織特異性發(fā)生改變，如非脅迫條件下OsGS1;3在小穗中特異表達(dá)，但鹽脅迫誘導(dǎo)其在老葉中表達(dá)，堿脅迫下GS基因的表達(dá)是否存在類似變化有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

海稻86具有強(qiáng)耐堿脅迫能力，本研究分析了堿脅迫下海稻86氮代謝的變化，表明海稻86具有強(qiáng)耐堿能力可能與其具有較高氮代謝活性，堿脅迫下氮代謝酶活性和相關(guān)基因表達(dá)量受影響小有關(guān)，可為進(jìn)一步研究海稻86耐堿脅迫機(jī)理和耐堿脅迫相關(guān)基因的挖掘提供理論基礎(chǔ)。但堿脅迫下海稻86氮代謝酶活性和相關(guān)基因表達(dá)量維持穩(wěn)定的分子機(jī)制有待深入研究。