茶樹3個MAPKKK基因的克隆及其在采后加工中的表達

沈潮如 楊潤梅 岳 川 曹紅利

(福建農(nóng)林大學園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002)

在茶葉加工過程中，萎凋是白茶品質形成的關鍵工序，做青是烏龍茶形成天然花果香的關鍵。在萎凋、做青等工序中，鮮葉受光照、高溫、脫水、翻(抖)動等脅迫產(chǎn)生應激響應，水分逐漸散失，茶葉中的酶發(fā)揮作用，咖啡堿、茶多酚等物質發(fā)生轉化，茶葉品質逐漸形成。研究表明這些加工應激響應過程是構成茶葉品質風味形成的關鍵因素[1]。目前關于白茶萎凋和烏龍茶做青的研究已有較多報道，多集中在不同萎凋方式和條件、不同做青工序等條件下理化成分變化以及香氣形成機理[2-3]。隨著技術的發(fā)展近年來的研究熱點集中在利用多組學對白茶萎凋及烏龍茶做青過程品質形成機理進行探究[4-5]。大量研究發(fā)現(xiàn)，茶葉中與香氣等品質相關的基因表達會在白茶萎凋和烏龍茶加工中具有顯著變化，推測這些基因參與了茶葉采后加工的品質形成[6-9]。然而，加工過程中外界刺激與品質形成間的分子響應調控模式仍未知，因此，在明確與品質相關基因在加工過程中的表達模式后，有必要進一步深入研究茶葉品質形成調控的信號轉導通路。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)級聯(lián)是動植物中廣泛存在的保守信號轉導通路，主要由MAPKKK、MAPKK和MAPK的依次磷酸化作用將信號級聯(lián)放大，通過逐級磷酸化將外界刺激信號轉導至細胞內部，以級聯(lián)順序磷酸化和活化不同的上游受體和下游靶基因來響應脅迫[10-12]。MAPKKK是一類絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)激酶，位于MAPK級聯(lián)上游，數(shù)量最龐大，通過磷酸化下游MAPKK活化環(huán)S/T-XXXXX-S/T基序中S/T殘基激活MAPKK。根據(jù)MAPKKK催化結構域的不同，植物中MAPKKK分為MEKK亞族、Raf亞族和ZIK亞族，其保守域分別為G(T/S)Px(W/Y/F)MAPEV、GTxx(W/Y)MAPE和GTPEFMAPE(L/V)(Y/F)[13-14]，研究發(fā)現(xiàn)MEKK亞族的蛋白質結構保守性與ZIK亞族和Raf亞族相比相對較低[15]。大量研究表明，MAPKKK基因家族在植物應對干旱、高鹽、低溫等逆境中發(fā)揮重要作用[16-17]，在氣孔發(fā)育[18]、細胞分裂[19]等過程中也發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。MAPKKK的研究主要集中于模式植物和大田作物，如水稻(Oryzaativa)[14]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[18]、玉米(Zeamays)[20]、棉花(Gossypiumhirsutum)[21]、大豆(Glycinemax)[22]等。目前，茶樹(Camelliasinensis)中關于MAPK級聯(lián)途徑基因的報道較少，本研究前期發(fā)現(xiàn)CsMAPK3參與茶樹非生物脅迫響應[23]，但茶樹中大量的相關基因有待挖掘，同時它們在茶葉采后加工過程中刺激響應與茶葉品質形成的調控作用有待揭示。

本研究以福鼎大白茶茶樹和鐵觀音茶樹品種為材料，克隆獲得3個MAPKKK基因cDNA全長序列，對其生物信息學進行全面分析，采用熒光定量PCR檢測其因的組織表達特異性以及在白茶萎凋和烏龍茶做青過程中的表達，旨在為揭示茶葉采后加工品質形成的調控機理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以福建農(nóng)林大學園藝學院南區(qū)教學茶場福鼎大白茶為材料，于2018年5月采取一芽二葉為原料，放置室內自然萎凋，室溫控制在22～25℃，空氣相對濕度70%左右。在萎凋過程的0、0.25、1、4、12、24、36和48 h進行取樣。以鐵觀音中小開面二三葉嫩梢為材料，按照閩南清香型烏龍茶加工工藝進行制作(表1)，在此過程中取鮮葉、曬青葉、一搖、二搖、三搖和殺青前等各工序的在制品為樣品。于2018年10月分別采取盆栽福鼎大白茶茶樹植株的根、莖、葉、花、果實，作為分析不同組織基因表達材料。所有上述樣品設置3次生物學重復，取樣后用錫箔紙包裹液氮速凍，放-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 烏龍茶加工工藝

GeIDoc-ItTS3Imager凝膠成像儀、CFX96 Touch熒光定量PCR儀、T100TMThermal Cycler PCR儀，美國Bio-Rad公司；瓊脂糖水平電泳儀和電泳槽，北京六一公司；AIRTECH 紫外超凈工作臺，蘇州安泰公司；NanoDrop ND2000 超微量分光光度計，上海Thermo Scientific公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA 的合成 按照RNAprep Pure 多糖多酚植物RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明，取0.1 g樣品在液氮中低溫研磨后，提取茶樹總RNA。采用PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(日本TaKaRa公司)合成cDNA用于后續(xù)反轉錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)；采用Easy Script @One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)合成cDNA模板用于實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)試驗。

1.2.2CsMAPKKK基因cDNA全長克隆 根據(jù)前期轉錄組數(shù)據(jù)的注釋結果[24]，篩選茶樹MAPKKK基因序列，序列經(jīng)拼接后再進行Blastx同源比對，并結合DNAMAN軟件查找開放閱讀框(open reading frame, ORF)。在ORF上下游設計引物(表2)，以1.2.1節(jié)所得cDNA為模板，進行PCR擴增。按照PrimeSTAR HS試劑盒(日本TaKaRa公司)操作步驟進行，程序為98℃預變性5 min；98℃變性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸3 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)檢測和記錄結果。擴增產(chǎn)物回收，轉入大腸桿菌，篩選陽性克隆進行基因測序，測序結果通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對，最終獲得基因的完整編碼序列。

1.2.3 CsMAPKKK生物信息學分析 采用ProtParam(http://expasy.org/tools)在線軟件分析預測蛋白理化性質、跨膜結構域。用Signal P5.0預測信號肽利用WoLF PSORTS(https://www.genscript.com/)進行亞細胞定位。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)預測保守元件。使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)和Swiss Model(https://swissmodel.expasy.org/)分析三級結構。通過NCBI-CDD和SMART分析保守結構域，使用DNAMAN 8.0軟件進行多序列比對。利用MEGA7.0軟件，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.4CsMAPKKK基因表達分析 以茶樹不同組織、不同萎凋和做青過程的樣品總RNA為模板，用Easyscript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis superMix 試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)合成cDNA，以茶樹CsPTB為內參基因，設計qRT-PCR引物(表2)，測定目標基因的表達水平變化。采用Bio-Rad的CFX96 Touch熒光定量PCR儀進行擴增，反應體系參照transstart Tip Green qPCR superMix試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)方法，程序：94℃預變性30 s；94℃變性5 s；60℃退火30 s；40個循環(huán)。結果采用2-ΔΔCt算法進行分析。采用Excel 2016軟件分析數(shù)據(jù)及作圖，SPSS 22.0進行顯著性差異分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 CsMAPKKK基因克隆與理化性質分析

如圖1所示，通過ORF上下游引物進行qRT-PCR擴增獲得3個CsMAPKKK基因全長。在NCBI數(shù)據(jù)庫比對出它們有完整的ORF，且與其他物種的MAPKKK18、MAPKKK-NPK1具有較高的相似性，將3個CsMAPKKK基因分別命名為CsMAPKKK18、CsMAPKKK18-like和CsMAPKKK-NPK1，cDNA全長序列分別為1 005、1 209和1 077 bp。 在ProtParam中對3個CsMAPKKK氨基酸序列進行預測分析，結果顯示如表2所示。CsMAPKKK18、CsMAPKKK18-like及CsMAPKKK-NPK1分別編碼334、402和358個氨基酸；分子量分別為36.59、44.03和39.56 kDa；不穩(wěn)定系數(shù)分別為46.55、44.64和47.28，均大于40，表明3個CsMAPKKK蛋白均為不穩(wěn)定蛋白；親水性(grand average of hydropathy, GRAVY)系數(shù)分別為-0.381、-0.298和-0.307，表明均為疏水性蛋白；理論等電點(pI)分別為6.01、5.16和7.09，CsMAPKKK18和CsMAPKKK18-like蛋白的pI小于7.0，為酸性蛋白。TMTHMM跨膜結構預測顯示CsMAPKKK18、CsMAPKKK18-like與CsMAPKKK-NPK1均不含有跨膜結構域；信號肽輸出位點預測顯示只有CsMAPKKK18和CsMAPKKK18-like有信號肽輸出位點；磷酸化位點預測顯示分別含有31、46和32個Ser、Thr或Tyr位點；WoLF PSORTⅡ預測亞細胞定位結果表明最大可能分別定位于液泡、線粒體和細胞核。

表2 基因引物序列

注：1：CsMAPKKK18-like；2：CsMAPKKK18-NPK1；3：CsMAPKKK18；M: Marker 2 000。

表3 CsMAPKKKs基本理化信息

2.2 CsMAPKKK保守結構域分析

氨基酸多重比對分析結果如圖2所示，CsMAPKKK同蓖麻、李、榴蓮、葡萄具有較高的保守性，均具有MEKK特征性保守區(qū)域G(T/S)Px(W/Y/F)MAPEV(圖中黑色框)，其中CsMAPKKK18與CsMAPKKK18-like保守域序列均為GTPMFMAPEV，CsMAPKKK-NPK1保守域序列為GTPLWMAPEV。除了特征性保守域，還利用MEME軟件對其他結構域進行預測，結果顯示(圖3)，CsMAPKKK18與CsMAPKKK18-like在結構上更相似，分別含有8個和10個保守域，CsMAPKKK-NPK1含有9個保守域。

圖3 茶樹3個CsMAPKKK蛋白的MEME保守元件預測

2.3 CsMAPKKK三級結構預測分析

用SWISS-MODEL對MAPKKK蛋白的三級結構進行模擬(圖4)，根據(jù)擬南芥MEKK蛋白為模板建模，其序列一致性在35%～40%之間，且全球模型質量估計值(global model quality estimation, GMQE)值為0.5～0.6，具有理想的預測效果。3個CsMAPKKK蛋白三級結構高度相似，均具有MAPKKK典型的三級結構，圖中黑色箭頭分別指示其MEKK特征結構域。

注：黑色箭頭指示保守結構域G(T/S)PX(W/Y/F)MAPEV。

2.4 GsMAPKKK的進化樹分析

以蓖麻(Ricinuscommunis)、可可(Theobromacacao)、葡萄(Vitisvinifera)、番茄(Solanumlycopersicum)、甜椒(Capsicumannuum)等11個植物的同源MAPKKK蛋白和3個茶樹的CsMAPKKK蛋白構建進化樹分析，結果顯示(圖5)，CsMAPKKK-NPK1與蓖麻、葡萄、栓皮櫟樹、榴蓮、可可、梅、李聚為一類，與蓖麻和葡萄關系最近；CsMAPKKK18-like與CsMAPKKK18聚為一類，相似性達85%，這兩個蛋白與番茄、甜椒等親緣關系較近。

圖5 茶樹3個MAPKKK蛋白與其他植物MAPKKK基因編碼的氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

2.5 CsMAPKKK基因茶樹不同組織部位中的表達分析

由圖6可知，CsMAPKKK18在根部的表達量最高，其次是花，都顯著高于莖、葉和果中的表達量，其中葉和果中的表達無顯著差異且表達量都很低。CsMAPKKK18-like的表達模式與CsMAPKKK18相似，根中表達量最高，其次是花，莖、葉、果中的表達無顯著差異且三者的表達量極低。CsMAPKKK-NPK1同樣在根中的表達最高，顯著高于莖、葉、花和果中的表達量，且在莖、葉、花和果中的表達無顯著差異。

注：不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)。下同。

2.6 CsMAPKKK白茶不同萎凋時間的表達分析

在白茶萎凋過程中的表達結果顯示(圖7)，以鮮葉(0 h)為對照，CsMAPKKK18在其他各萎凋階段均顯著上調，且在萎凋1 h表達量顯著上調至64.9，但在4 h時表達量迅速下調至5.8，而12 h 時表達量又迅速上調至64.3，之后表達量下降，但表達水平都顯著高于0 h。CsMAPKKK18-like表達量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當萎凋時間為1 h 時表達量最高，達3.44，而后表達量迅速下降，到24 h以后表達量顯著低于鮮葉(0 h)。CsMAPKKK-NPK1在萎凋前期(4 h以前)表達量上調緩慢，在萎凋12 h以后表達量迅速上調，到48 h 時表達量最高，約為0 h的30倍。綜上說明CsMAPKKK18和CsMAPKKK-NPK1在白茶萎凋0～48 h的過程中受誘導上調表達，而CsMAPKKK18-like在萎凋前期誘導，后期抑制表達。

圖7 茶樹3個CsMAPKKK在白茶萎凋過程中的表達

2.7 CsMAPKKK基因在烏龍茶做青過程中的表達分析

在烏龍茶做青過程中，以鮮葉為對照，熒光定量PCR表達結果顯示(圖8)，CsMAPKKK18表達量在曬青后顯著下調為0.3，而一搖、二搖、三搖和殺青前的表達量都是顯著上調，且在二搖和三搖分別上調至23.1和26.2；CsMAPKKK18-like在三搖表達量顯著上調為1.6，但在曬青、二搖和殺青前顯著下調表達，表達量分別為0.4、0.5和0.5；CsMAPKKK-NPK1在曬青顯著下調到0.3，在一搖、二搖和三搖都顯著逐漸上調，其表達量分別為1.7、2.1和3.2，推測CsMAPKKK18和CsMAPKKK-NPK1與烏龍茶做青過程中機械力脅迫誘導下茶葉品質的形成密切相關。

圖8 茶樹3個CsMAPKKK在烏龍茶做青過程中的表達

3 討論

MAPKKK家族是MAPK級聯(lián)途徑中成員最多的一個基因家族，多種植物已從全基因組數(shù)據(jù)中鑒定出完整的MAPKKK家族成員，如擬南芥中含80個[13]，水稻中含75個[25]，小麥中含155個[26]，玉米中含74個[20]，葡萄中含45個[27-28]，棉花中含78個[21]，番茄中含89個[29]，黃瓜中含59個[30]。目前，僅報道茶樹1個CsMAPK3基因[23]，而茶樹MAPKK和MAPKKK基因鮮見報道。因此，茶樹中還有大量MAPKKK家族成員待進一步挖掘鑒定。本研究獲得3個茶樹MAPKKK基因，它們均具有MEKK特征性保守區(qū)域G(T/S)PX(W/Y/F)MAPEV，屬于MEKK亞家族。研究表明，大部分ZIK亞族在N端具有激活域，幾乎所有的Raf亞族在C端具有激活域，N端具有調節(jié)域，而MEKK亞族的激活域有可能在N端、C端或中央[31]，CsMAPKKK激活域有待進一步研究。亞細胞定位預測顯示，3個CsMAPKKK蛋白都定位于不同亞細胞結構上，推測這3個基因在功能上有差異。

本研究檢測了這3個CsMAPKKK在茶樹不同組織部位的表達，結果顯示，3個CsMAPKKK在茶樹根、莖、葉、花以及果等組織中均有表達，且均是在根中表達量最高。該結果與番茄[29]、黃瓜[30]、小麥[26]等研究中的MAPKKK組織特異性表達結果一致。其中CsMAPKKK18與CsMAPKKK18-like的組織表達模式具有相似性，根和花的表達量顯著高于其他組織，推測CsMAPKKK18與CsMAPKKK18-like具有功能上的相似性。

進一步分析了3個基因在白茶萎凋和烏龍茶做青過程中的表達模式，為深入揭示茶葉采后加工品質形成機理提供參考。在白茶0～48 h萎凋過程中，3個CsMAPKKK均受誘導表達。CsMAPKKK18和CsMAPKKK18-like在萎凋前期(1 h)的表達量最高，其中CsMAPKKK18在4 h表達量驟降，12 h表達量又上升到高水平，此后表達量降低但保持穩(wěn)定，而CsMAPKKK18-like在4 h后表達量顯著下調。CsMAPKKK-NPK1在白茶萎凋前期表達量上調緩慢，12 h后表達量增加最多達30倍。在烏龍茶做青過程的5個時間點，3個CsMAPKKK都有不同程度的誘導。其中CsMAPKKK18表達量上調最大達26倍；CsMAPKKK18-like在三搖顯著上調，而曬青、二搖和殺青前均為顯著下調；CsMAPKKK-NPK1在曬青顯著下調，在一搖、二搖和三搖都顯著上調?？梢娺@3個基因的表達水平變化與茶葉采后加工的進程密切相關。白茶萎凋和烏龍茶做青過程中，茶葉所受的刺激模式不盡相同，白茶萎凋主要以水分散失導致的滲透脅迫為主，而烏龍茶做青中既有失水產(chǎn)生的脅迫，也有機械力的作用。MAPK級聯(lián)在滲透脅迫和機械力脅迫中發(fā)揮著重要的作用，因此，這些基因的上調表達能夠增強茶葉自身對外界刺激的響應。同時，蛋白激酶等編碼基因的上調表達，也可能在茶葉品質形成中發(fā)揮重要的調控作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，烏龍茶做青和白茶萎凋中，多種與茶葉品質相關的基因的表達均上調，如β-淀粉酶基因(CsBAMs)、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因(CsCCDs)、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(CsNCED2)等[6-7,32]。做青機械振動能顯著提高茶樹橙花叔醇合成酶CsNES基因和芳樟醇合成酶CsLIS的表達[33-34]，茶樹萜烯類合成相關基因CsMVK，CsDXS和CsGGPS在白茶萎凋過程中顯著上調[9]。茶葉加工過程中，茶葉會產(chǎn)生不同程度的滲透脅迫，逐漸失水，膜系統(tǒng)逐漸破壞，此過程中基因表達非常活躍，不同程度的非生物脅迫和生物脅迫產(chǎn)生的防御作用是影響萜類物質合成的主要因素，而萜類物質是構成茶葉香氣、滋味等品質的重要作用因子[35]。然而，與品質相關的基因在加工過程中如何被刺激，即外界刺激如何調控茶葉鮮葉在制品品質形成的信號通路仍有待研究。MAPK級聯(lián)與植物的抗逆響應密切相關，茶葉對外界脅迫的響應促進了茶葉品質的形成，因此，推測由MAPK級聯(lián)調控的應激響應通路對茶葉采后加工品質的形成發(fā)揮了重要作用。在MAPK級聯(lián)作用下，調控下游與茶葉品質形成密切相關的基因的表達。

4 結論

本研究克隆到3個茶樹CsMAPKKK基因家族成員CsMAPKKK18、CsMAPKKK18-like和CsMAPKKK-NPK1，生物信息學分析顯示3個基因均屬于MEKK亞家族成員，預測定位在不同的亞細胞結構。進化樹分析顯示CsMAPKKK18與CsMAPKKK18-like與番茄、甜椒親緣關系較近，MAPKKK-NPK1與蓖麻和葡萄關系更近。3個基因在茶樹根中表達較高，且在茶葉采后加工的白茶萎凋和烏龍茶做青過程中表達活躍。本研究結果為進一步研究MAPK級聯(lián)途徑在茶葉采后加工過程中的功能和品質機理形成提供了參考。