蕎麥芽菜黃酮類物質(zhì)含量和胰蛋白酶抑制率變化研究

李靜舒賀東亮

(1.山西開放大學，山西 太原 030027；2.太原工業(yè)學院，山西 太原 030008)

蕎麥作為一種兼具食用和藥用雙重功能的作物，近年來受到越來越多研究人員的關(guān)注。蕎麥不僅含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、維生素、纖維素等[1]，還含有一些功能性物質(zhì)，如黃酮類、多酚類和甾醇類等，這些物質(zhì)具有抗癌、抗氧化、抗菌消炎、降糖降脂、抗高血壓、減肥等藥理活性[2-4]。

但是蕎麥籽粒中含有蛋白酶抑制劑，會鈍化蛋白酶的活性，使得胰蛋白酶在完成對蛋白質(zhì)的消化時受阻，造成人體消化功能紊亂，而且蕎麥中很多蛋白對蛋白酶低度敏感，如果蕎麥直接被人體食用的話，就會使蕎麥蛋白質(zhì)在人體中的消化吸收率遠遠低于其它麥類和豆類，有報道稱，某些人食用蕎麥后，會產(chǎn)生如腹脹等消化不良的癥狀。

黃酮類化合物是蕎麥特有，而其它禾谷類糧食作物中沒有的一種功能性成分。作為蕎麥屬植物已知主要活性成分之一，其具有很高的藥用價值，在生物抗氧化、抗腫瘤以及降血糖、血脂等方面有重要作用[5,6]?？嗍w麥中黃酮類化合物的主要成分是蘆丁，由于蘆丁易溶于水，所以其在多水的條件中加工時，很容易被蘆丁降解酶所分解，降低蕎麥的保健功能。

有報道證明，蕎麥經(jīng)過萌發(fā)處理能夠改善并提高其營養(yǎng)價值[7,8]。不僅蛋白類和黃酮類物質(zhì)含量發(fā)生變化，還產(chǎn)生了易于吸收的單糖，脂肪酸趨于平衡，維生素、多酚類和礦物質(zhì)的含量也會有所提高，各種營養(yǎng)成分更利于人體吸收利用[9,10]。同時，由于化學成分發(fā)生變化，蕎麥所含營養(yǎng)物質(zhì)和口感較籽粒時期有大幅度提高[11]。蕎麥芽菜，作為一種新型的蔬菜，與蕎麥相比，具有更高質(zhì)量的蛋白質(zhì)、更合理的氨基酸組成、更多的不飽和脂肪酸以及更高生物性的黃酮類化合物，營養(yǎng)成分更易被人體吸收利用。而且，蕎麥芽菜的口感要比普通市面上的豆芽更為軟嫩，沒有豆腥味道，很容易被大多數(shù)人所接受[12]。

本試驗以甜蕎和苦蕎2個栽培品種為研究目標，擬研究萌發(fā)后期的蕎麥芽中活性物質(zhì)，如胰蛋白酶抑制率、黃酮類物質(zhì)，隨萌發(fā)天數(shù)增長的變化趨勢，開展對蕎麥相關(guān)功能因子的動態(tài)化分析，為深入探究蕎麥活性物質(zhì)的生理作用，開展蕎麥的精深加工、開發(fā)蕎麥產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)，對于貧困山區(qū)農(nóng)民群眾脫貧致富，將地區(qū)資源優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟優(yōu)勢具有深遠意義。

1 試驗材料

1.1 試驗條件

試驗于2019年3—6月在山西省太原市進行。山西省太原市屬北溫帶大陸性氣候，年平均氣溫9.5℃，年降雨量500mm，無霜期140～190d。

1.2 試驗材料

供試品種為“晉蕎1號”(甜蕎)和“晉蕎2號”(苦蕎)，由山西省農(nóng)業(yè)科學院提供。

1.3 試驗試劑

蘆丁標準品購自上海試劑二廠；胰蛋白酶購自Solarbio公司；苯甲酰—DL—精氨酸對硝基苯胺(BApNA)購自Sigma公司。其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

2 試驗方法

本試驗采用半人工控制條件下培養(yǎng)蕎麥芽菜，即僅僅人工控制土壤含水量這一條件，光照、溫度等均為自然條件。

2.1 苦蕎和甜蕎萌發(fā)

選取大小、顏色、成熟度均勻的蕎麥種子，于純凈水中浸泡24h后，瀝干水分。方形不銹鋼盤中放入滅菌紗布，將種子置于其上，用噴壺于每天8∶00、15∶00、22∶00各噴水1次，保持盤中水分。待苦蕎和甜蕎種子發(fā)芽后記為采樣起點，每天定時定量采樣。取樣后烘干，粉碎，貼好標簽于4℃冰箱中保存。連續(xù)采集10d。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

蕎麥中的黃酮類物質(zhì)主要是蘆丁，總黃酮含量以蘆丁計算。稱取蘆丁標準品1mg溶于10mL的30%乙醇溶液中，得到濃度為0.1mg·mL-1的蘆丁標準品溶液，深色玻璃瓶保存于4℃冰箱。取蘆丁標準品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL分別加入10mL試管中，編號①、②、③、④、⑤，加5%亞硝酸鈉水溶液0.6mL，靜置5min，加10%硝酸鋁水溶液0.6mL，搖勻后靜置5min，加1.0mol·L-1氫氧化鈉水溶液5．0mL，靜置10min，加30%乙醇至刻度，靜置15min，利用紫外分光光度計，測定其在500nm處的吸收值[13]。

2.2.2 蕎麥芽菜黃酮類物質(zhì)提取液的制備

取一定量蕎麥芽樣品，加入65%乙醇，于60℃下提取3h后，10000r·min-1下離心10min，棄去沉淀，取1mL上清于10mL試管中，同2.2.1中方法，測定吸收值，試驗重復3次。

2.2.3 蕎麥芽菜黃酮類物質(zhì)濃度

根據(jù)所測吸光度，代入2.2.1中所得標準曲線，得出總黃酮類物質(zhì)的濃度。

2.3 胰蛋白酶抑制劑活性測定

2.3.1 蕎麥芽菜蛋白提取液的制備

取一定量蕎麥芽樣品，加入Tris-HCl緩沖液(0.05mol·L-1，含0.15mol·L-1NaCl，pH7.8)，4℃下研磨提取1h，10000r·min-1離心10min，棄去沉淀，保留上清液，胰蛋白酶抑制劑活性待測。

2.3.2 胰蛋白酶抑制劑活性測定

胰蛋白酶抑制劑活性測定參考Stauffer C E[14]的方法，有少許調(diào)整改進。以BApNA為底物，二甲基亞砜為溶劑。底物BApNA在胰蛋白酶的作用下水解，會產(chǎn)生黃色產(chǎn)物PNA，該產(chǎn)物在410nm處有吸收。

取2.3.1中制備的提取液1mL，加入20μL的胰蛋白酶(1mg·L-1)和2.5mL測活緩沖液，混勻，37℃下水浴鍋中保溫10min，快速加入底物BApNA(150mmol·L-1)15μL，同溫度下繼續(xù)保溫10min，加入0.5mL(300g·L-1)的乙酸終止反應。以測活體系中加入緩沖液為對照，測定410nm的波長下反應體系中由產(chǎn)物PNA所產(chǎn)生的吸收值，試驗重復3次。

2.3.3 抑制率計算

式中，A0為對照吸光度；A1為樣品吸光度。

3 試驗結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標準曲線

以加入標品溶液的濃度(mg·mL-1)為橫坐標，吸光值(OD500)為縱坐標，得到線性回歸，求得標準曲線：

Y=4.571X-0.001，R2=0.9924

3.2 蕎麥芽總黃酮物質(zhì)含量變化

甜蕎籽粒在播種5d后發(fā)芽。甜蕎籽粒萌發(fā)后，隨著時間的增加，甜蕎芽菜中黃酮類含量呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢，如圖1所示。在發(fā)芽1～7d，黃酮類含量呈上升趨勢；在8～10d，黃酮類含量保持平穩(wěn)，略有降低，差異不顯著，在第7天時到達甜蕎幼苗總黃酮含量的頂點，為1.46mg·g-1。

圖1 甜蕎芽總黃酮含量的變化曲線

苦蕎籽粒在播種3d后發(fā)芽。由圖2可以看出，苦蕎籽粒萌發(fā)后，隨著時間的增加，苦蕎芽中總黃酮類含量呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢。在發(fā)芽后1～6d，黃酮類含量呈上升趨勢；在7～10d，黃酮類含量呈平穩(wěn)趨勢，在第6天到達苦蕎芽菜總黃酮含量的頂點，為41.02mg·g-1。

圖2 苦蕎芽總黃酮含量的變化曲線

3.3 蕎麥芽胰蛋白酶抑制劑含量變化

由圖3可以看出，甜蕎籽粒發(fā)芽后第1天時，胰蛋白酶抑制率為10.2%；到第10天時胰蛋白酶抑制劑活性降到很低，幾乎檢測不出來。

圖3 甜蕎芽胰蛋白酶抑制率的變化曲線

由圖4可以看出，苦蕎籽粒發(fā)芽后第1天時，胰蛋白酶抑制率為17.15%；到第10天時胰蛋白酶抑制率降到1.94%。

圖4 苦蕎芽胰蛋白酶抑制率的變化曲線

4 結(jié)果與討論

蕎麥中含有一種特殊的生物活性物質(zhì)，即黃酮類物質(zhì)，這是其它普通糧谷類作物如小麥、水稻等所不具備的。黃酮類物質(zhì)的食療及保健功能日益受到人們的重視。甜蕎和苦蕎籽粒萌發(fā)后形成蕎麥芽，黃酮類物質(zhì)含量均有所增加，說明萌發(fā)可提高蕎麥的保健價值。但是隨著發(fā)芽時間的延長，總黃酮含量有所下降。甜蕎出芽后第6～10天，苦蕎出芽后第5～7天的總黃酮含量較高。蕎麥籽粒的蛋白質(zhì)雖然有著合理的氨基酸配比，但該蛋白的胰蛋白酶抑制劑活性也較高，影響人體對蕎麥蛋白的吸收利用。研究表明，在蕎麥籽粒出芽的初期，甜蕎苗和苦蕎苗均表現(xiàn)出一定的胰蛋白酶抑制活性，但隨著萌發(fā)天數(shù)的增加，其活性逐漸降低。在出芽后第10天，幾乎檢測不出胰蛋白酶抑制劑活性。萌發(fā)處理使得蕎麥籽粒的胰蛋白酶抑制劑活性降低，從而使蛋白的消化利用率有所提高。

蕎麥芽菜是蕎麥種子經(jīng)過萌發(fā)后，生長成的芽苗。作為一種新型蔬菜，其既能夠使蕎麥中的營養(yǎng)成分得到改善，又能夠使蕎麥資源得到充分開發(fā)利用。該試驗結(jié)果可以幫助確定蕎麥芽菜的最佳采摘時間，為蕎麥芽菜的生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。