• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    晚期糖基化終末產(chǎn)物抑制大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞及成骨細(xì)胞增殖的作用機(jī)制

    2021-04-22 01:35:58洪天配王浩杰高展翼
    關(guān)鍵詞:牙周組織磷酸化通路

    李 崢,王 霄△,洪天配,王浩杰,高展翼,萬(wàn) 蒙

    (北京大學(xué)第三醫(yī)院 1.口腔科,2.內(nèi)分泌科,北京 100191)

    糖尿病和牙周病在全球范圍內(nèi)均屬于與生活方式相關(guān)的慢性疾病[1],一系列流行病學(xué)研究以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的Meta分析均支持糖尿病可影響牙周組織健康的結(jié)論[2-4],其比較經(jīng)典的病因?qū)W解釋如下[5]:(1)伴隨著血糖水平的升高,口腔內(nèi)唾液和齦溝液葡萄糖水平也相應(yīng)增加,牙周袋內(nèi)菌斑生物膜可受此影響,導(dǎo)致位于袋底的厭氧菌群過(guò)度活躍生長(zhǎng),從而誘導(dǎo)和加劇局部牙周組織的炎癥反應(yīng);(2)高血糖狀況下,晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)合成增加,或者直接影響正常蛋白質(zhì)功能,或者與不同細(xì)胞膜表面AGEs受體(receptor for AGEs,RAGE)結(jié)合,級(jí)聯(lián)表達(dá)各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,從而介導(dǎo)包括牙周組織在內(nèi)的結(jié)締組織降解的發(fā)生;(3)糖尿病患者牙周組織和齦溝液內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的增加,會(huì)加重牙周組織破壞程度并降低組織修復(fù)能力。上述致病機(jī)制可與齦下菌斑生物膜生態(tài)系改變以及糖尿病相關(guān)性肥胖和血脂異常所導(dǎo)致的脂肪細(xì)胞因子分泌增加發(fā)揮協(xié)同作用[6],最終導(dǎo)致牙周組織代謝平衡喪失,表現(xiàn)為牙周組織破壞增加、組織修復(fù)功能損傷,即造成進(jìn)展期的牙周組織炎癥。牙周炎病理表現(xiàn)涉及牙周軟硬組織喪失,包括結(jié)締組織膠原纖維降解以及牙槽骨吸收與改建,與機(jī)體的免疫反應(yīng)以及骨調(diào)節(jié)機(jī)制緊密相關(guān)。AGEs作為糖尿病特征性表達(dá),在高血糖引發(fā)的病理生理過(guò)程中處于核心地位。

    本研究以高血糖狀況下特征性的AGEs/RAGE作用軸為出發(fā)點(diǎn),設(shè)計(jì)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),檢測(cè)AGEs對(duì)體外分離培養(yǎng)的大鼠下頜成骨細(xì)胞(osteoblasts,OB)以及大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)增殖的影響,探索AGEs/RAGE作用軸中核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與材料

    DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、青霉素、鏈霉素、Trizol均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,逆轉(zhuǎn)錄及qR-TPCR試劑購(gòu)自天根生物科技有限公司??偟鞍准昂说鞍滋崛≡噭┖匈?gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司,BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自凱基生物技術(shù)有限公司,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)所涉及的一抗、二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

    1.2 AGEs試劑的配制

    取牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,50 g/L)2.5 g、D-葡萄糖(500 mmol/L)4.045 g、青霉素(100 IU/mL)0.003 g、鏈霉素(100 IU/mL)0.005 g、苯甲基磺酰氟(1.5 mmol/L)0.013 g、乙二胺四乙酸二鈉(0.5 mmol/L)0.009 g,使用磷酸鹽緩沖液[phosphate buffered saline(PBS), 0.2 mmol/L,pH 7.4]充分溶解后定容至50 mL,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后置于無(wú)菌試管中。在同一條件下配制不含D-葡萄糖的BSA溶液作為對(duì)照。將無(wú)菌試管中配置完成的AGEs/BSA溶液封口后,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育90 d獲取棕色產(chǎn)物。孵育結(jié)束后經(jīng)PBS透析48 h,以除去未與BSA結(jié)合的D-葡萄糖,再經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩8鶕?jù)AGEs特有的熒光特性(370 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光可激發(fā)產(chǎn)生440 nm發(fā)射波長(zhǎng)的熒光),采用FLX-800型熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光值,鑒定AGEs/BSA和對(duì)照物。

    1.3 PBMCs 的體外培養(yǎng)

    1.3.1PBMCs的原代培養(yǎng) 按照單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒的步驟進(jìn)行操作。取大鼠新鮮全血2 mL,乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝,PBS等體積稀釋,室溫差速離心25 min后出現(xiàn)明顯分層,將第二層與第三層小心吸取至15 mL新的無(wú)菌離心管中,加入10 mL洗滌液,顛倒混勻,再次離心10 min,棄上清。5 mL洗滌液重懸細(xì)胞后重復(fù)離心,棄上清,用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸,計(jì)數(shù)。每個(gè)培養(yǎng)瓶中約106個(gè)/mL細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),4 h后換新的培養(yǎng)基,此時(shí)的貼壁細(xì)胞即為單個(gè)核細(xì)胞。

    1.3.2PBMCs后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分組培養(yǎng) 將細(xì)胞傳代至第3代作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞,接種于96孔板中。實(shí)驗(yàn)分為3組,具體如下:第1組為0.25 g/L AGEs作用組;第2組為AGEs+NF-κB通路阻斷劑(Bay117082)組,先用阻斷劑處理細(xì)胞0.5 h,再用0.25 g/L AGEs處理;第3組為空白對(duì)照。4 h后采用ELISA方法測(cè)定腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表達(dá),Western blot測(cè)定NF-κB p65磷酸化水平。

    1.4 OB的體外培養(yǎng)

    1.4.1OB的原代培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取出3周齡SD大鼠的下頜骨,置入冷PBS中,盡量剔除附著的結(jié)締組織。用PBS清洗3次,置入盛有DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,剪成0.5 mm×0.5 mm的小塊,約30塊,加入0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶5 mL,置入孵箱中消化。20 min后血清終止消化,棄上清液,加入1.0 g/L Ⅰ型膠原酶10 mL,置于孵箱中再次消化。90 min后,1 000 r/min離心10 min,去上清,用PBS洗滌細(xì)胞2次,200目濾網(wǎng)過(guò)濾去除碎骨片。使用含10%(體積分?jǐn)?shù))的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,吹打均勻后,接種至多個(gè)25 cm2的培養(yǎng)瓶,放于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)48 h后換液,以后隔日換液,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),培養(yǎng)至第3代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.4.2OB后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分組培養(yǎng) 待OB狀態(tài)良好時(shí),分3組處理細(xì)胞,第1組用AGEs刺激細(xì)胞,分別在培養(yǎng)30 min、12 h、1 d、3 d、5 d時(shí)收集細(xì)胞;第2組在AGEs刺激前加入JNK抑制劑(SP600125),分別在培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)收集細(xì)胞;第3組在AGEs刺激前加入p38 MAPK抑制劑(SB203580),分別在培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)收集細(xì)胞。其中AGEs的刺激濃度均為0.25 g/L,均設(shè)置空白對(duì)照組。將每次收集的細(xì)胞分為兩份,一份進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn),在mRNA水平檢測(cè)NF-κB p65、IκB、p38、JNK的表達(dá)變化;另一份進(jìn)行Western blot蛋白電泳實(shí)驗(yàn),在蛋白水平檢測(cè)NF-κB p65、IκB、p38、JNK磷酸化以及非磷酸化的表達(dá)變化。

    1.5 鈣化結(jié)節(jié)(茜素紅法)染色

    盡量棄去OB培養(yǎng)瓶中的上清液,PBS清洗2次,70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇固定60 min后用蒸餾水小心清洗3次。在培養(yǎng)瓶中加入1 mL配制好的0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))茜紅素(pH 8.3)進(jìn)行細(xì)胞染色,將其放入37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育,30 min后取出細(xì)胞,再次用蒸餾水清洗,在顯微鏡下進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)觀察并照相。

    1.6 堿性磷酸酶染色

    將OB接種到細(xì)胞爬片上,培養(yǎng)7 d后用95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇固定15 min,用Gomori鈣鈷法進(jìn)行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色:將固定好的蓋玻片經(jīng)蒸餾水漂洗后,入孵育液[3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))β-甘油磷酸鈉5 mL,2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))巴比妥鈉5 mL,2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸鈣10 mL,2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硫酸鎂 5 mL,蒸餾水25 mL],37 ℃孵育2 h,清水沖洗數(shù)次,然后在2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸鈷中孵育1 min,沖洗,自然干燥,封固,倒置顯微鏡下觀察拍照。

    1.7 CCK-8

    取第3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OB、PBMCs,按每孔5×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行種植。AGEs設(shè)置5個(gè)濃度梯度,分別為2、1、0.5、0.25、0.125 g/L。相同條件設(shè)BSA對(duì)照組,每組均設(shè)4個(gè)重復(fù),置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在24、48、72 h進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處光密度值,并計(jì)算IC50。

    1.8 qRT-PCR

    總RNA提取采用Trizol法,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR過(guò)程及相關(guān)程序參考說(shuō)明書,相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行目的基因相對(duì)定量分析。

    表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

    1.9 Western blot

    蛋白的提取以及定量均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。80 V恒壓電泳30 min后,改為120 V恒壓分離;300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶室溫封閉1.5 h。一抗、二抗均按照說(shuō)明書推薦的最佳濃度進(jìn)行稀釋,一抗4 ℃孵育過(guò)夜,二抗放置搖床室溫1 h,TBST緩沖液洗3遍后顯色曝光,拍照分析。采用Tanon Gis軟件測(cè)定膠片電泳條帶灰度值,定量分析蛋白水平變化。

    1.10 統(tǒng)計(jì)分析

    2 結(jié)果

    2.1 AGEs試劑鑒定

    將AGEs原液(圖1A)稀釋到原來(lái)體積的1/100,采用熒光分光光度計(jì)。在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度,發(fā)射波長(zhǎng)440 nm處出現(xiàn)最大吸收峰。結(jié)果顯示,分析圖譜吸收峰單一,AGEs的峰與對(duì)照組相比有明顯差異,其中AGEs溶液的熒光強(qiáng)度為88.56 U/mg,對(duì)照BSA溶液的熒光強(qiáng)度為2.34 U/mg(圖1B),符合AGEs自發(fā)熒光特征,表明本實(shí)驗(yàn)所用AGEs配制成功。

    AGEs, advanced glycation end products; BSA, bovine serum albumin.圖1 制備的AGEs溶液和對(duì)照BSA溶液(A)及其對(duì)應(yīng)的熒光光譜(B)Figure 1 The prepared AGEs and BSA reagents (A),analysis of BSA and AGEs by fluorescence spectrophotometer (B)

    2.2 PBMCs的體外培養(yǎng)及鑒定

    體外培養(yǎng)原代及第3代PBMCs,顯微鏡下觀察其形態(tài)呈典型貼壁細(xì)胞,細(xì)胞伸展,粘附牢固,呈規(guī)則圓形,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,無(wú)明顯增殖表現(xiàn),符合PBMCs的特征(圖2)。

    2.3 OB體外培養(yǎng)及鑒定

    體外培養(yǎng)原代及第3代OB,原代OB從骨板爬出生長(zhǎng),24 h細(xì)胞開始貼壁,48 h完全貼壁,細(xì)胞為單核,呈多角形或梭形,約1周后細(xì)胞融合成鋪路石樣(圖3A、B)。對(duì)OB進(jìn)行茜素紅染色呈陽(yáng)性,可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)紅染的鈣化結(jié)節(jié)(圖3C);ALP染色呈陽(yáng)性,可見(jiàn)胞漿內(nèi)ALP與顯色劑結(jié)合后的棕黑色顆粒(圖3D)。

    圖2 光學(xué)顯微鏡下原代(A)及第3代(B)PBMCs的形態(tài) 圖3 原代(A)及第3代(B)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞OB及其茜素紅染色(C)和ALP染色(D)Figure 2 The cultured PBMCs of the primary (A) and the third generation (B), observed by optical microscope Figure 3 The cultured OB of the primary (A) and the third generation (B) and the staining of alizarin red (C) and ALP (D)

    2.4 AGEs對(duì)PBMCs、OB增殖活力的影響

    不同濃度AGEs分別作用PBMCs和OB 48 h,光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)PBMCs、OB的細(xì)胞存活量及細(xì)胞狀態(tài)隨著AGEs作用濃度的增加而逐漸降低(圖4A、B)。CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PBMCs在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí), OB在培養(yǎng)48、72 h時(shí)細(xì)胞活力隨AGEs作用濃度的增加而逐漸降低(圖4C、D),與未處理對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),該檢測(cè)結(jié)果與光學(xué)顯微鏡下的變化趨勢(shì)一致。重復(fù)測(cè)量的GLM分析表明,兩種細(xì)胞的活力與AGEs的濃度、作用時(shí)間以及二者交互作用均顯著相關(guān)(P<0.001),且當(dāng)AGEs作用濃度超過(guò)0.5 g/L時(shí)兩種細(xì)胞活力均隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降(圖4E、F)。這一結(jié)果提示,考慮到AGEs對(duì)細(xì)胞增殖的影響,應(yīng)選擇既能最大化刺激細(xì)胞,又不造成過(guò)半細(xì)胞殺傷的作用濃度值,因此,本研究選擇AGEs的作用濃度為0.25 g/L,該濃度對(duì)PBMCs和OB均適宜。

    A, B, scale bar is 200 μm. *P<0.001, vs. control; AGEs, advanced glycation end products. E, PBMCs: Times, P=0.001; Concentrations, P<0.001; Time×Concentration, P<0.001 (GLM, F value: 14.1-1 851.4). F, OB: Times, P<0.001; Concentrations: P<0.001; Time×Concentration, P<0.001 (GLM, F: 64.4-373.1).圖4 不同濃度AGEs干預(yù)48 h時(shí),光學(xué)顯微鏡觀察PBMCs(A)、OB(B)的細(xì)胞形態(tài);CCK-8檢測(cè)不同濃度AGEs作用24、48、72 h時(shí)對(duì)PBMCs(C)、OB(D)細(xì)胞活力的影響,及濃度與作用時(shí)間交互作用的相關(guān)性(E、F) Figure 4 The AGEs stimulated cell morphology of PBMCs (A) and OB (B) observed by optical microscope for 48 h; the effects of AGEs at different concentrations for 24, 48, 72 h on cell PBMCs (C) and OB (D) viability and the interaction (E, F) between different concentrations and action times by CCK-8 test

    2.5 NF-κB信號(hào)通路在AGEs干預(yù)PBMCs后的作用機(jī)制

    0.25 g/L AGEs作用于PBMCs,Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,NF-κB p65的蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01,圖5A)。同時(shí),ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β含量均顯著增加(P<0.01),當(dāng)加入NF-κB信號(hào)通路阻斷劑后,TNF-α、IL-1β水平均顯著降低(P<0.01,圖5B)。

    * P<0.01, vs. control; # P<0.01, vs. AGEs group. Bay117082, NF-κB signaling pathway inhibitor.圖5 AGEs作用于PBMCs后,Western blot檢測(cè)NF-κB p65的表達(dá)(A),ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β的含量變化(B)Figure 5 NF-κB p65 expression examined by Western blot (A) and TNF-α and IL-1β level examined by ELISA (B) after AGEs treatment with PBMCs

    2.6 JNK/p38、NF-κB、PI3K/PKB信號(hào)通路在AGEs干預(yù)OB后的作用機(jī)制

    第1組細(xì)胞處理后,分別檢測(cè)NF-κB p65、IκB、p38、JNK、Akt蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)變化。Western blot結(jié)果顯示,隨作用時(shí)間延長(zhǎng),AGEs可使OB中NF-κB p65、JNK、p38磷酸化和非磷酸化蛋白顯著升高(P<0.05),而IκB磷酸化蛋白表達(dá)顯著升高的同時(shí)還伴有非磷酸化蛋白表達(dá)下降(P<0.01),Akt磷酸化及非磷酸化蛋白未見(jiàn)明顯變化(P>0.05,圖6A~E)。隨AGEs作用時(shí)間延長(zhǎng),NF-κB p65、JNK、p38 在mRNA水平的表達(dá)顯著升高,IκB mRNA表達(dá)顯著下降,尤其在AGEs作用120 h時(shí),而Akt mRNA表達(dá)并無(wú)明顯變化(P>0.05,圖6F)。

    P-NF-κB p65, P-IκB, P-p38, P-JNK, P-Akt are the phosphorylation products of NF-κB p65, IκB, p38, JNK, Akt, respectively. *P<0.05, #P<0.01, △P<0.001, vs. control respectively.圖6 AGEs作用于OB不同時(shí)間后,NF-κB、PI3K/PKB、MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的Western blot檢測(cè)(A~E)和qRT-PCR檢測(cè)(F)Figure 6 The related gene expression of NF-κB, PI3K/PKB, MAPK signaling pathways examined by Western blot (A-E) and qRT-PCR (F) after the AGEs stimulated OB

    第2組、第3組細(xì)胞處理后,采用Western blot、qRT-PCR分別檢測(cè)NF-κB p65、IκB、p38、JNK、Akt蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)變化。Western blot結(jié)果顯示,與只加入AGEs組相比,加入JNK抑制劑(圖7A~E)、p38(圖8A~E)抑制劑后,NF-κB p65、p38、JNK磷酸化和非磷酸化蛋白表達(dá)均顯著降低,IκB磷酸化蛋白顯著降低,而非磷酸化蛋白顯著升高(P<0.05),Akt表達(dá)未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,與只加入AGEs組相比,加入JNK通路阻斷劑后的IκB表達(dá)顯著升高(P<0.05),NF-κB p65、p38、JNK表達(dá)呈下降趨勢(shì),但差異不明顯(P>0.05),Akt表達(dá)未見(jiàn)明顯變化(P>0.05,圖7F);加入p38信號(hào)通路阻斷劑后,NF-κB p65、p38、JNK表達(dá)顯著降低(P<0.05),IκB表達(dá)顯著升高(P<0.05),Akt表達(dá)未見(jiàn)明顯變化(P>0.05,圖8F)。

    P-NF-κB p65, P-IκB, P-p38, P-JNK, P-Akt are the phosphorylation products of NF- κB p65, IκB, p38, JNK, Akt, respectively. *P<0.05, vs. JNK inhibitor at the same time.圖7 加入JNK阻斷劑后,AGEs對(duì)OB NF-κB、PI3K/PKB、MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的Western blot檢測(cè)(A~E)和qRT-PCR檢測(cè)(F)Figure 7 The related gene expression of NF-κB, PI3K/PKB, MAPK signaling pathways examined by Western blot (A-E) and qRT-PCR (F) after blocking by JNK inhibitor

    P-NF-κB p65, P-IκB, P-p38, P-JNK, P-Akt are the phosphorylation products of NF-κB p65, IκB, p38, JNK, Akt, respectively. *P<0.05, vs. p38 inhibitor at the same time.圖8 加入p38阻斷劑后,AGEs對(duì)OB NF-κB、PI3K/PKB、MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的Western blot檢測(cè)(A~E)和qRT-PCR檢測(cè)(F)Figure 8 The related gene expression of NF-κB, PI3K/PKB, MAPK signaling pathways examined by Western blot (A-E) and qRT-PCR (F) after blocking by p38 inhibitor

    3 討論

    AGEs是通過(guò)非酶糖化反應(yīng)途徑,由還原性單糖的醛基或酮基與氨基酸、核酸或脂質(zhì)等大分子中的氨基之間形成希夫(Schiff)鍵,再經(jīng)緩慢而復(fù)雜的重排,最終形成的不可逆聚合物[7]。AGEs的作用機(jī)制復(fù)雜,包括由于糖基化修飾直接引起的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的改變,以及通過(guò)其受體及其他結(jié)合蛋白介導(dǎo)的發(fā)生在不同組織細(xì)胞的一系列間接病理變化[8]。RAGE是能與AGEs結(jié)合發(fā)揮其作用的重要受體分子之一,作為一種膜蛋白,其分為胞外域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)段,屬于免疫球蛋白超家族成員[9]。RAGE在許多細(xì)胞表面都有表達(dá),如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等,當(dāng)細(xì)胞處于激活或應(yīng)激狀態(tài)時(shí)(高血糖、炎癥),細(xì)胞RAGE表達(dá)顯著增強(qiáng)。AGEs與RAGE作用后,能觸發(fā)多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,如NADPH氧化酶-活性氧通路、PKB/Akt通路、MAPK通路等,涉及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶ERK、p38、JNK等上游因子,進(jìn)一步激活NF-κB級(jí)聯(lián)發(fā)揮生物學(xué)作用[10]。另外,一些研究證實(shí)RAGE是一種類似于Toll樣受體的模式識(shí)別受體,在炎癥免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[11],所以從免疫調(diào)節(jié)機(jī)制方面研究AGEs致病作用是一個(gè)嶄新的課題。

    本研究旨在檢測(cè)糖尿病AGEs對(duì)PBMCs及OB增殖的影響,初步了解AGEs和RAGE相互作用在牙周免疫反應(yīng)以及骨細(xì)胞代謝中的作用,并分析AGEs/RAGE作用軸中NF-κB信號(hào)通路及其上游PI3K/PKB、MAPK信號(hào)通路的作用機(jī)制。本研究證實(shí),AGEs隨作用濃度和時(shí)間的增加能夠顯著抑制PBMCs、OB的增殖。當(dāng)AGEs作用濃度超過(guò)0.5 g/L時(shí),細(xì)胞活力隨作用時(shí)間增加而逐漸降低,這是本研究選取<0.5 g/L AGEs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

    我們首先關(guān)注了牙周炎癥進(jìn)展中處于一線防御地位的單核巨噬細(xì)胞在AGEs作用下的表現(xiàn)。AGEs與單核巨噬細(xì)胞的作用存在雙重影響:一方面,單核巨噬細(xì)胞通過(guò)其細(xì)胞表面的RAGE,識(shí)別、內(nèi)吞并降解清除AGEs;另一方面,AGEs可以誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞的趨化性,當(dāng)游離的單核巨噬細(xì)胞與組織中或血管壁上的AGEs結(jié)合后,可被激活,合成并釋放血小板源生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等生長(zhǎng)因子以及IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子,從而引起炎癥反應(yīng)并刺激細(xì)胞異常增殖[12]。本研究也部分證實(shí)了上述觀點(diǎn),即AGEs作用下,PBMCs中TNF-α、IL-1β分泌增加,同時(shí)伴有NF-κB表達(dá)增加,而在阻斷NF-κB通路后,上述炎性細(xì)胞因子水平顯著下降,證實(shí)了NF-κB信號(hào)通路參與AGEs致PBMCs加劇炎癥反應(yīng)的過(guò)程。未來(lái)還可進(jìn)一步定位RAGE在單核細(xì)胞中的表達(dá),并明確更多信號(hào)通路參與AGEs/RAGE軸作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。

    鑒于牙周炎癥實(shí)質(zhì)是牙槽骨的吸收,本研究接下來(lái)關(guān)注了AGEs對(duì)牙周OB以及骨髓基質(zhì)細(xì)胞(結(jié)果另文發(fā)表)的影響,結(jié)果證實(shí),0.25 g/L AGEs作用下,OB的NF-κB激活,其上游通路中JNK、p38磷酸化、非磷酸化蛋白表達(dá)增加,而Akt磷酸化及非磷酸化蛋白表達(dá)無(wú)差異,提示AGEs作用過(guò)程中JNK、p38參與調(diào)控,而與PI3K/PKB信號(hào)通路無(wú)關(guān)。另外,在這一過(guò)程中,IκB磷酸化蛋白增加驗(yàn)證了上述AGEs/RAGE介導(dǎo)的NF-κB激活機(jī)制[13]:AGEs刺激作用下,IκB發(fā)生磷酸化,NF-κB三聚體降解,釋放NF-κB,級(jí)聯(lián)發(fā)揮生物學(xué)作用。JNK和p38被稱為“應(yīng)激誘導(dǎo)”的MAPK,可被多種應(yīng)激刺激激活,如脂多糖、炎癥因子、滲透壓改變、輻射等。JNK和p38可同時(shí)被JNK激酶1激活,這種交叉作用使兩條通路在信號(hào)分子及生物學(xué)效應(yīng)方面存在諸多相似性。本研究在OB的實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了上述觀點(diǎn),可以認(rèn)為AGEs通過(guò)p38、JNK及下游NF-κB信號(hào)通路影響OB代謝。另外,鑒于p38信號(hào)通路阻斷可使NF-κB p65表達(dá)顯著減低,推斷AGEs作用過(guò)程中p38信號(hào)通路相對(duì)JNK通路對(duì)OB的影響更為密切。再者,根據(jù)NF-κB、p38、JNK mRNA在阻斷后表達(dá)明顯降低,可以推斷AGEs對(duì)OB的影響要弱于對(duì)具有干細(xì)胞分化潛能的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的作用(結(jié)果另文發(fā)表),這也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇更為敏感的靶細(xì)胞提供了思路。PI3K/PKB信號(hào)作為RAGE下游的信號(hào)通路途徑之一,是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在細(xì)胞存活、凋亡中發(fā)揮重要作用[14]。本研究表明,AGEs干預(yù)OB后,Akt mRNA及蛋白水平表達(dá)并無(wú)明顯規(guī)律性或顯著性改變,提示AGEs并不通過(guò)PI3K/PKB通路影響OB中NF-κB的表達(dá)。

    鑒于RAGE作為模式識(shí)別受體的一種新形式,會(huì)在炎癥免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,未來(lái)可進(jìn)一步分析AGEs/RAGE軸對(duì)牙周炎癥相關(guān)細(xì)胞的影響,著重研究不同靶細(xì)胞RAGE的分布及類型,通過(guò)使用可溶性RAGE、RAGE抗體或基因沉默等方法,結(jié)合信號(hào)通路分析,深入了解AGEs促進(jìn)牙周組織炎癥的作用及其機(jī)制,為疾病治療及應(yīng)用于臨床提供思路。

    猜你喜歡
    牙周組織磷酸化通路
    牙周組織再生術(shù)與正畸聯(lián)合治療牙周炎患者臨床效果分析
    ITSN1蛋白磷酸化的研究進(jìn)展
    Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路促使性早熟形成的作用觀察
    MAPK抑制因子對(duì)HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核轉(zhuǎn)位的影響
    牙周組織再生術(shù)聯(lián)合正畸治療牙周炎的臨床效果
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細(xì)胞增殖
    高金合金和鎳鉻合金冠橋修復(fù)體對(duì)牙周組織遠(yuǎn)期影響的比較
    通路快建林翰:對(duì)重模式應(yīng)有再認(rèn)識(shí)
    中藥緩釋藥條對(duì)大鼠牙周組織再生的研究
    組蛋白磷酸化修飾與精子發(fā)生
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:59:01
    两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 黄片大片在线免费观看| 欧美zozozo另类| 亚洲av免费在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产精品一区二区免费欧美| 一本一本综合久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美午夜高清在线| 91久久精品电影网| 国产一级毛片七仙女欲春2| 免费无遮挡裸体视频| 国产乱人视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 国产亚洲精品综合一区在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 毛片女人毛片| 亚洲第一电影网av| 久久香蕉精品热| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 最新在线观看一区二区三区| 国产午夜精品论理片| 日韩人妻高清精品专区| 麻豆国产97在线/欧美| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日本在线视频免费播放| 女同久久另类99精品国产91| 精品乱码久久久久久99久播| 国产真实乱freesex| 国产高清三级在线| 精品一区二区三区人妻视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 给我免费播放毛片高清在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲精品在线观看二区| 观看美女的网站| 国产日本99.免费观看| 一级毛片高清免费大全| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 亚洲av免费高清在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 99久久九九国产精品国产免费| 精品久久久久久,| 舔av片在线| 热99re8久久精品国产| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 香蕉av资源在线| 中亚洲国语对白在线视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲午夜理论影院| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 人妻久久中文字幕网| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 久久久久久九九精品二区国产| 免费在线观看影片大全网站| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 村上凉子中文字幕在线| 精品国产美女av久久久久小说| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| xxxwww97欧美| 久久久久免费精品人妻一区二区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| а√天堂www在线а√下载| 久久久国产成人精品二区| 国产亚洲精品一区二区www| 日韩欧美国产一区二区入口| 51午夜福利影视在线观看| 久久草成人影院| 国产探花极品一区二区| 亚洲美女视频黄频| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲在线观看片| 国内精品美女久久久久久| www.999成人在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 99热这里只有是精品50| 又紧又爽又黄一区二区| 日本与韩国留学比较| 欧美性感艳星| www国产在线视频色| 岛国在线观看网站| 国产主播在线观看一区二区| 久9热在线精品视频| 免费人成在线观看视频色| 日韩免费av在线播放| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 成人性生交大片免费视频hd| 特级一级黄色大片| 丰满的人妻完整版| av女优亚洲男人天堂| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲精品亚洲一区二区| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲人成网站在线播| 网址你懂的国产日韩在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美zozozo另类| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 免费av不卡在线播放| 欧美午夜高清在线| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲国产精品合色在线| 88av欧美| 可以在线观看的亚洲视频| 久久久久久久久中文| 免费看a级黄色片| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 制服人妻中文乱码| 日韩人妻高清精品专区| 欧美性感艳星| 日韩欧美在线二视频| 在线天堂最新版资源| 中文字幕人妻丝袜一区二区| e午夜精品久久久久久久| 亚洲国产欧美网| 久久久精品大字幕| 午夜福利高清视频| 搡老岳熟女国产| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 毛片女人毛片| 国产精品 欧美亚洲| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 午夜福利高清视频| 村上凉子中文字幕在线| 啦啦啦免费观看视频1| 在线观看av片永久免费下载| 精品久久久久久,| 国产欧美日韩一区二区三| 日韩免费av在线播放| 国产av不卡久久| 欧美黑人巨大hd| 亚洲一区高清亚洲精品| 熟女电影av网| 久久久久久国产a免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲最大成人中文| 美女黄网站色视频| 一级黄片播放器| 国产探花极品一区二区| 国产精品一区二区三区四区久久| 成年免费大片在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 99在线人妻在线中文字幕| 美女高潮的动态| 成人国产综合亚洲| 欧美黄色片欧美黄色片| av片东京热男人的天堂| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 首页视频小说图片口味搜索| 九九在线视频观看精品| 最近视频中文字幕2019在线8| 91麻豆av在线| 欧美日韩黄片免| 成年女人永久免费观看视频| 十八禁人妻一区二区| 99久国产av精品| 国产伦在线观看视频一区| 91久久精品电影网| 岛国视频午夜一区免费看| 岛国在线免费视频观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 成人一区二区视频在线观看| 午夜福利高清视频| 中文字幕熟女人妻在线| 毛片女人毛片| 国产精品久久久久久久久免 | 在线视频色国产色| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久6这里有精品| 国产中年淑女户外野战色| 啦啦啦韩国在线观看视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 搡老岳熟女国产| 美女cb高潮喷水在线观看| 成人精品一区二区免费| 久久99热这里只有精品18| 久久性视频一级片| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 97超视频在线观看视频| 久久草成人影院| 一区二区三区激情视频| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲在线自拍视频| 无遮挡黄片免费观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品成人久久久久久| 日本免费a在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美bdsm另类| 久久久国产精品麻豆| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产探花极品一区二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲国产高清在线一区二区三| av国产免费在线观看| 欧美激情在线99| 成人18禁在线播放| 国产精品国产高清国产av| 免费观看的影片在线观看| 欧美乱妇无乱码| 少妇人妻精品综合一区二区 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 最好的美女福利视频网| 日本免费a在线| 校园春色视频在线观看| 麻豆一二三区av精品| av福利片在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 色综合站精品国产| 国产精品久久视频播放| www.熟女人妻精品国产| 在线天堂最新版资源| 国产黄a三级三级三级人| 一级作爱视频免费观看| 18+在线观看网站| 国产真人三级小视频在线观看| 免费看十八禁软件| 99riav亚洲国产免费| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 一本一本综合久久| 少妇的逼水好多| 亚洲国产精品999在线| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲五月婷婷丁香| 午夜久久久久精精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| www日本黄色视频网| 香蕉丝袜av| 国产成人欧美在线观看| 中文资源天堂在线| 麻豆成人av在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 久久久久久大精品| 禁无遮挡网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 九九在线视频观看精品| 欧美黄色淫秽网站| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩欧美国产在线观看| 在线观看66精品国产| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 男女视频在线观看网站免费| 无人区码免费观看不卡| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 伊人久久精品亚洲午夜| 日本五十路高清| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 最新在线观看一区二区三区| 日本熟妇午夜| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲成av人片免费观看| 99热精品在线国产| 成人av一区二区三区在线看| 色综合站精品国产| 99精品久久久久人妻精品| 看黄色毛片网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 男女视频在线观看网站免费| 国产 一区 欧美 日韩| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 九色成人免费人妻av| 男插女下体视频免费在线播放| 男女那种视频在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 一个人免费在线观看电影| 老鸭窝网址在线观看| 精品人妻1区二区| 亚洲一区二区三区不卡视频| 在线播放国产精品三级| 又黄又粗又硬又大视频| 丰满的人妻完整版| 成人av在线播放网站| 丁香六月欧美| 亚洲精品一区av在线观看| 九九热线精品视视频播放| 免费在线观看亚洲国产| netflix在线观看网站| 日韩精品青青久久久久久| 欧美日韩乱码在线| 少妇的丰满在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 女警被强在线播放| 免费在线观看日本一区| 国产三级在线视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 日韩欧美在线乱码| 草草在线视频免费看| 欧美成人a在线观看| 高清在线国产一区| 久久国产精品影院| 久久精品国产清高在天天线| 成人av在线播放网站| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲激情在线av| www.www免费av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产97色在线日韩免费| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品一区二区三区四区久久| 在线观看免费午夜福利视频| 99久久精品一区二区三区| 成人特级黄色片久久久久久久| 天堂√8在线中文| 婷婷丁香在线五月| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 麻豆国产av国片精品| 日韩大尺度精品在线看网址| 男女午夜视频在线观看| 在线观看午夜福利视频| 99久久精品一区二区三区| 亚洲精品在线观看二区| 嫩草影院精品99| 99热这里只有精品一区| 女同久久另类99精品国产91| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲人与动物交配视频| 在线观看66精品国产| 高清日韩中文字幕在线| 国产日本99.免费观看| 成人国产综合亚洲| 亚洲美女视频黄频| 免费观看的影片在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜a级毛片| 国产真实乱freesex| 亚洲av五月六月丁香网| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 午夜激情福利司机影院| 国产极品精品免费视频能看的| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 成年免费大片在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 又紧又爽又黄一区二区| 成人特级av手机在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产高清有码在线观看视频| 免费在线观看亚洲国产| 又黄又爽又免费观看的视频| 色综合站精品国产| 欧美国产日韩亚洲一区| 精品电影一区二区在线| 男女视频在线观看网站免费| 中文字幕高清在线视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美三级亚洲精品| 亚洲黑人精品在线| 国产av麻豆久久久久久久| 日本 av在线| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美乱色亚洲激情| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美成人免费av一区二区三区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 69av精品久久久久久| 99热精品在线国产| 美女大奶头视频| 一本一本综合久久| 网址你懂的国产日韩在线| 有码 亚洲区| 国产av一区在线观看免费| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 免费一级毛片在线播放高清视频| 搡老岳熟女国产| 亚洲精品久久国产高清桃花| 韩国av一区二区三区四区| 免费高清视频大片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品一区av在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 九九在线视频观看精品| 久久久久久久精品吃奶| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲熟妇熟女久久| 九色国产91popny在线| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 在线观看免费午夜福利视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久久久久久久中文| 亚洲av成人av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 桃色一区二区三区在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久久色成人| 久久香蕉精品热| 国产精品 国内视频| 99久久精品一区二区三区| 男人舔奶头视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲一区二区三区不卡视频| 免费高清视频大片| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美成狂野欧美在线观看| 熟女电影av网| 日韩av在线大香蕉| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲av美国av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 两人在一起打扑克的视频| 波野结衣二区三区在线 | 69人妻影院| 成人av在线播放网站| 在线观看免费视频日本深夜| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产成人av激情在线播放| 五月伊人婷婷丁香| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲美女黄片视频| 免费观看的影片在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 叶爱在线成人免费视频播放| 成人精品一区二区免费| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲精品456在线播放app | 国产v大片淫在线免费观看| 12—13女人毛片做爰片一| 99riav亚洲国产免费| 亚洲av五月六月丁香网| 听说在线观看完整版免费高清| 国产色爽女视频免费观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲中文字幕日韩| 国产高清有码在线观看视频| 91九色精品人成在线观看| 免费高清视频大片| 亚洲男人的天堂狠狠| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲色图av天堂| 久久久久久久精品吃奶| 在线观看舔阴道视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲第一电影网av| eeuss影院久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 两个人的视频大全免费| 中国美女看黄片| 欧美日韩精品网址| 69av精品久久久久久| 91在线观看av| 少妇的逼好多水| 国产伦精品一区二区三区四那| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产av一区在线观看免费| 成人三级黄色视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 久久亚洲精品不卡| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 麻豆国产97在线/欧美| 国产精品99久久久久久久久| 久久精品91无色码中文字幕| 成人av一区二区三区在线看| 国产v大片淫在线免费观看| 宅男免费午夜| 亚洲成av人片在线播放无| 69人妻影院| 精品国产亚洲在线| 日本黄色片子视频| 午夜免费观看网址| 久久久精品大字幕| 亚洲美女视频黄频| 国产 一区 欧美 日韩| 久久久久久大精品| 国语自产精品视频在线第100页| 99在线视频只有这里精品首页| 国产三级中文精品| 色尼玛亚洲综合影院| 天堂动漫精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久久久国内视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 天堂√8在线中文| 日韩国内少妇激情av| 青草久久国产| 在线视频色国产色| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av电影在线进入| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲av免费高清在线观看| 色在线成人网| 亚洲人成网站高清观看| a级毛片a级免费在线| 国产毛片a区久久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产三级在线视频| 真实男女啪啪啪动态图| 超碰av人人做人人爽久久 | 日韩av在线大香蕉| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲av不卡在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲成av人片免费观看| 美女大奶头视频| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 男人和女人高潮做爰伦理| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲精品久久国产高清桃花| ponron亚洲| 欧美一级毛片孕妇| avwww免费| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 69av精品久久久久久| 久久国产精品影院| 日本一二三区视频观看| 亚洲avbb在线观看| 成年版毛片免费区| 亚洲五月天丁香| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 最近最新免费中文字幕在线| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲av成人精品一区久久| 一二三四社区在线视频社区8| 美女被艹到高潮喷水动态| 欧美性猛交黑人性爽| 国产成人av激情在线播放| 免费高清视频大片| 99热这里只有是精品50| 有码 亚洲区| 国产伦在线观看视频一区| 欧美乱妇无乱码| 五月伊人婷婷丁香| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美黑人巨大hd| 此物有八面人人有两片| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 欧美日韩乱码在线| 两个人的视频大全免费| 欧美中文综合在线视频| or卡值多少钱| 亚洲电影在线观看av| 国产v大片淫在线免费观看| 床上黄色一级片| 国产精品99久久99久久久不卡| 国内精品久久久久久久电影| 在线免费观看的www视频| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲欧美日韩高清专用| avwww免费| 99久久99久久久精品蜜桃| 十八禁人妻一区二区| 日本与韩国留学比较| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 12—13女人毛片做爰片一| 国产久久久一区二区三区| 国产精品精品国产色婷婷| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费看日本二区| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产视频内射| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精品98久久久久久宅男小说| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产毛片a区久久久久| 精品无人区乱码1区二区| 久久久久久久久久黄片| 搞女人的毛片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美日韩一级在线毛片| 草草在线视频免费看| 国产午夜精品论理片| 成人性生交大片免费视频hd| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产精品乱码一区二三区的特点| 黄色片一级片一级黄色片| 香蕉av资源在线| 亚洲国产精品合色在线| 黄色片一级片一级黄色片|