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    晚期糖基化終末產(chǎn)物抑制大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞及成骨細(xì)胞增殖的作用機(jī)制

    2021-04-22 01:35:58洪天配王浩杰高展翼
    關(guān)鍵詞:牙周組織磷酸化通路

    李 崢,王 霄△,洪天配,王浩杰,高展翼,萬(wàn) 蒙

    (北京大學(xué)第三醫(yī)院 1.口腔科,2.內(nèi)分泌科,北京 100191)

    糖尿病和牙周病在全球范圍內(nèi)均屬于與生活方式相關(guān)的慢性疾病[1],一系列流行病學(xué)研究以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的Meta分析均支持糖尿病可影響牙周組織健康的結(jié)論[2-4],其比較經(jīng)典的病因?qū)W解釋如下[5]:(1)伴隨著血糖水平的升高,口腔內(nèi)唾液和齦溝液葡萄糖水平也相應(yīng)增加,牙周袋內(nèi)菌斑生物膜可受此影響,導(dǎo)致位于袋底的厭氧菌群過(guò)度活躍生長(zhǎng),從而誘導(dǎo)和加劇局部牙周組織的炎癥反應(yīng);(2)高血糖狀況下,晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)合成增加,或者直接影響正常蛋白質(zhì)功能,或者與不同細(xì)胞膜表面AGEs受體(receptor for AGEs,RAGE)結(jié)合,級(jí)聯(lián)表達(dá)各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,從而介導(dǎo)包括牙周組織在內(nèi)的結(jié)締組織降解的發(fā)生;(3)糖尿病患者牙周組織和齦溝液內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的增加,會(huì)加重牙周組織破壞程度并降低組織修復(fù)能力。上述致病機(jī)制可與齦下菌斑生物膜生態(tài)系改變以及糖尿病相關(guān)性肥胖和血脂異常所導(dǎo)致的脂肪細(xì)胞因子分泌增加發(fā)揮協(xié)同作用[6],最終導(dǎo)致牙周組織代謝平衡喪失,表現(xiàn)為牙周組織破壞增加、組織修復(fù)功能損傷,即造成進(jìn)展期的牙周組織炎癥。牙周炎病理表現(xiàn)涉及牙周軟硬組織喪失,包括結(jié)締組織膠原纖維降解以及牙槽骨吸收與改建,與機(jī)體的免疫反應(yīng)以及骨調(diào)節(jié)機(jī)制緊密相關(guān)。AGEs作為糖尿病特征性表達(dá),在高血糖引發(fā)的病理生理過(guò)程中處于核心地位。

    本研究以高血糖狀況下特征性的AGEs/RAGE作用軸為出發(fā)點(diǎn),設(shè)計(jì)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),檢測(cè)AGEs對(duì)體外分離培養(yǎng)的大鼠下頜成骨細(xì)胞(osteoblasts,OB)以及大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)增殖的影響,探索AGEs/RAGE作用軸中核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與材料

    DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、青霉素、鏈霉素、Trizol均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,逆轉(zhuǎn)錄及qR-TPCR試劑購(gòu)自天根生物科技有限公司??偟鞍准昂说鞍滋崛≡噭┖匈?gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司,BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自凱基生物技術(shù)有限公司,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)所涉及的一抗、二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

    1.2 AGEs試劑的配制

    取牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,50 g/L)2.5 g、D-葡萄糖(500 mmol/L)4.045 g、青霉素(100 IU/mL)0.003 g、鏈霉素(100 IU/mL)0.005 g、苯甲基磺酰氟(1.5 mmol/L)0.013 g、乙二胺四乙酸二鈉(0.5 mmol/L)0.009 g,使用磷酸鹽緩沖液[phosphate buffered saline(PBS), 0.2 mmol/L,pH 7.4]充分溶解后定容至50 mL,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后置于無(wú)菌試管中。在同一條件下配制不含D-葡萄糖的BSA溶液作為對(duì)照。將無(wú)菌試管中配置完成的AGEs/BSA溶液封口后,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育90 d獲取棕色產(chǎn)物。孵育結(jié)束后經(jīng)PBS透析48 h,以除去未與BSA結(jié)合的D-葡萄糖,再經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩8鶕?jù)AGEs特有的熒光特性(370 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光可激發(fā)產(chǎn)生440 nm發(fā)射波長(zhǎng)的熒光),采用FLX-800型熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光值,鑒定AGEs/BSA和對(duì)照物。

    1.3 PBMCs 的體外培養(yǎng)

    1.3.1PBMCs的原代培養(yǎng) 按照單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒的步驟進(jìn)行操作。取大鼠新鮮全血2 mL,乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝,PBS等體積稀釋,室溫差速離心25 min后出現(xiàn)明顯分層,將第二層與第三層小心吸取至15 mL新的無(wú)菌離心管中,加入10 mL洗滌液,顛倒混勻,再次離心10 min,棄上清。5 mL洗滌液重懸細(xì)胞后重復(fù)離心,棄上清,用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸,計(jì)數(shù)。每個(gè)培養(yǎng)瓶中約106個(gè)/mL細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),4 h后換新的培養(yǎng)基,此時(shí)的貼壁細(xì)胞即為單個(gè)核細(xì)胞。

    1.3.2PBMCs后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分組培養(yǎng) 將細(xì)胞傳代至第3代作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞,接種于96孔板中。實(shí)驗(yàn)分為3組,具體如下:第1組為0.25 g/L AGEs作用組;第2組為AGEs+NF-κB通路阻斷劑(Bay117082)組,先用阻斷劑處理細(xì)胞0.5 h,再用0.25 g/L AGEs處理;第3組為空白對(duì)照。4 h后采用ELISA方法測(cè)定腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表達(dá),Western blot測(cè)定NF-κB p65磷酸化水平。

    1.4 OB的體外培養(yǎng)

    1.4.1OB的原代培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取出3周齡SD大鼠的下頜骨,置入冷PBS中,盡量剔除附著的結(jié)締組織。用PBS清洗3次,置入盛有DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,剪成0.5 mm×0.5 mm的小塊,約30塊,加入0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶5 mL,置入孵箱中消化。20 min后血清終止消化,棄上清液,加入1.0 g/L Ⅰ型膠原酶10 mL,置于孵箱中再次消化。90 min后,1 000 r/min離心10 min,去上清,用PBS洗滌細(xì)胞2次,200目濾網(wǎng)過(guò)濾去除碎骨片。使用含10%(體積分?jǐn)?shù))的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,吹打均勻后,接種至多個(gè)25 cm2的培養(yǎng)瓶,放于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)48 h后換液,以后隔日換液,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),培養(yǎng)至第3代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.4.2OB后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分組培養(yǎng) 待OB狀態(tài)良好時(shí),分3組處理細(xì)胞,第1組用AGEs刺激細(xì)胞,分別在培養(yǎng)30 min、12 h、1 d、3 d、5 d時(shí)收集細(xì)胞;第2組在AGEs刺激前加入JNK抑制劑(SP600125),分別在培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)收集細(xì)胞;第3組在AGEs刺激前加入p38 MAPK抑制劑(SB203580),分別在培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)收集細(xì)胞。其中AGEs的刺激濃度均為0.25 g/L,均設(shè)置空白對(duì)照組。將每次收集的細(xì)胞分為兩份,一份進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn),在mRNA水平檢測(cè)NF-κB p65、IκB、p38、JNK的表達(dá)變化;另一份進(jìn)行Western blot蛋白電泳實(shí)驗(yàn),在蛋白水平檢測(cè)NF-κB p65、IκB、p38、JNK磷酸化以及非磷酸化的表達(dá)變化。

    1.5 鈣化結(jié)節(jié)(茜素紅法)染色

    盡量棄去OB培養(yǎng)瓶中的上清液,PBS清洗2次,70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇固定60 min后用蒸餾水小心清洗3次。在培養(yǎng)瓶中加入1 mL配制好的0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))茜紅素(pH 8.3)進(jìn)行細(xì)胞染色,將其放入37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育,30 min后取出細(xì)胞,再次用蒸餾水清洗,在顯微鏡下進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)觀察并照相。

    1.6 堿性磷酸酶染色

    將OB接種到細(xì)胞爬片上,培養(yǎng)7 d后用95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇固定15 min,用Gomori鈣鈷法進(jìn)行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色:將固定好的蓋玻片經(jīng)蒸餾水漂洗后,入孵育液[3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))β-甘油磷酸鈉5 mL,2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))巴比妥鈉5 mL,2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸鈣10 mL,2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硫酸鎂 5 mL,蒸餾水25 mL],37 ℃孵育2 h,清水沖洗數(shù)次,然后在2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸鈷中孵育1 min,沖洗,自然干燥,封固,倒置顯微鏡下觀察拍照。

    1.7 CCK-8

    取第3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OB、PBMCs,按每孔5×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行種植。AGEs設(shè)置5個(gè)濃度梯度,分別為2、1、0.5、0.25、0.125 g/L。相同條件設(shè)BSA對(duì)照組,每組均設(shè)4個(gè)重復(fù),置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在24、48、72 h進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處光密度值,并計(jì)算IC50。

    1.8 qRT-PCR

    總RNA提取采用Trizol法,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR過(guò)程及相關(guān)程序參考說(shuō)明書,相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行目的基因相對(duì)定量分析。

    表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

    1.9 Western blot

    蛋白的提取以及定量均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。80 V恒壓電泳30 min后,改為120 V恒壓分離;300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶室溫封閉1.5 h。一抗、二抗均按照說(shuō)明書推薦的最佳濃度進(jìn)行稀釋,一抗4 ℃孵育過(guò)夜,二抗放置搖床室溫1 h,TBST緩沖液洗3遍后顯色曝光,拍照分析。采用Tanon Gis軟件測(cè)定膠片電泳條帶灰度值,定量分析蛋白水平變化。

    1.10 統(tǒng)計(jì)分析

    2 結(jié)果

    2.1 AGEs試劑鑒定

    將AGEs原液(圖1A)稀釋到原來(lái)體積的1/100,采用熒光分光光度計(jì)。在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度,發(fā)射波長(zhǎng)440 nm處出現(xiàn)最大吸收峰。結(jié)果顯示,分析圖譜吸收峰單一,AGEs的峰與對(duì)照組相比有明顯差異,其中AGEs溶液的熒光強(qiáng)度為88.56 U/mg,對(duì)照BSA溶液的熒光強(qiáng)度為2.34 U/mg(圖1B),符合AGEs自發(fā)熒光特征,表明本實(shí)驗(yàn)所用AGEs配制成功。

    AGEs, advanced glycation end products; BSA, bovine serum albumin.圖1 制備的AGEs溶液和對(duì)照BSA溶液(A)及其對(duì)應(yīng)的熒光光譜(B)Figure 1 The prepared AGEs and BSA reagents (A),analysis of BSA and AGEs by fluorescence spectrophotometer (B)

    2.2 PBMCs的體外培養(yǎng)及鑒定

    體外培養(yǎng)原代及第3代PBMCs,顯微鏡下觀察其形態(tài)呈典型貼壁細(xì)胞,細(xì)胞伸展,粘附牢固,呈規(guī)則圓形,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,無(wú)明顯增殖表現(xiàn),符合PBMCs的特征(圖2)。

    2.3 OB體外培養(yǎng)及鑒定

    體外培養(yǎng)原代及第3代OB,原代OB從骨板爬出生長(zhǎng),24 h細(xì)胞開始貼壁,48 h完全貼壁,細(xì)胞為單核,呈多角形或梭形,約1周后細(xì)胞融合成鋪路石樣(圖3A、B)。對(duì)OB進(jìn)行茜素紅染色呈陽(yáng)性,可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)紅染的鈣化結(jié)節(jié)(圖3C);ALP染色呈陽(yáng)性,可見(jiàn)胞漿內(nèi)ALP與顯色劑結(jié)合后的棕黑色顆粒(圖3D)。

    圖2 光學(xué)顯微鏡下原代(A)及第3代(B)PBMCs的形態(tài) 圖3 原代(A)及第3代(B)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞OB及其茜素紅染色(C)和ALP染色(D)Figure 2 The cultured PBMCs of the primary (A) and the third generation (B), observed by optical microscope Figure 3 The cultured OB of the primary (A) and the third generation (B) and the staining of alizarin red (C) and ALP (D)

    2.4 AGEs對(duì)PBMCs、OB增殖活力的影響

    不同濃度AGEs分別作用PBMCs和OB 48 h,光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)PBMCs、OB的細(xì)胞存活量及細(xì)胞狀態(tài)隨著AGEs作用濃度的增加而逐漸降低(圖4A、B)。CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PBMCs在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí), OB在培養(yǎng)48、72 h時(shí)細(xì)胞活力隨AGEs作用濃度的增加而逐漸降低(圖4C、D),與未處理對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),該檢測(cè)結(jié)果與光學(xué)顯微鏡下的變化趨勢(shì)一致。重復(fù)測(cè)量的GLM分析表明,兩種細(xì)胞的活力與AGEs的濃度、作用時(shí)間以及二者交互作用均顯著相關(guān)(P<0.001),且當(dāng)AGEs作用濃度超過(guò)0.5 g/L時(shí)兩種細(xì)胞活力均隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降(圖4E、F)。這一結(jié)果提示,考慮到AGEs對(duì)細(xì)胞增殖的影響,應(yīng)選擇既能最大化刺激細(xì)胞,又不造成過(guò)半細(xì)胞殺傷的作用濃度值,因此,本研究選擇AGEs的作用濃度為0.25 g/L,該濃度對(duì)PBMCs和OB均適宜。

    A, B, scale bar is 200 μm. *P<0.001, vs. control; AGEs, advanced glycation end products. E, PBMCs: Times, P=0.001; Concentrations, P<0.001; Time×Concentration, P<0.001 (GLM, F value: 14.1-1 851.4). F, OB: Times, P<0.001; Concentrations: P<0.001; Time×Concentration, P<0.001 (GLM, F: 64.4-373.1).圖4 不同濃度AGEs干預(yù)48 h時(shí),光學(xué)顯微鏡觀察PBMCs(A)、OB(B)的細(xì)胞形態(tài);CCK-8檢測(cè)不同濃度AGEs作用24、48、72 h時(shí)對(duì)PBMCs(C)、OB(D)細(xì)胞活力的影響,及濃度與作用時(shí)間交互作用的相關(guān)性(E、F) Figure 4 The AGEs stimulated cell morphology of PBMCs (A) and OB (B) observed by optical microscope for 48 h; the effects of AGEs at different concentrations for 24, 48, 72 h on cell PBMCs (C) and OB (D) viability and the interaction (E, F) between different concentrations and action times by CCK-8 test

    2.5 NF-κB信號(hào)通路在AGEs干預(yù)PBMCs后的作用機(jī)制

    0.25 g/L AGEs作用于PBMCs,Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,NF-κB p65的蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01,圖5A)。同時(shí),ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β含量均顯著增加(P<0.01),當(dāng)加入NF-κB信號(hào)通路阻斷劑后,TNF-α、IL-1β水平均顯著降低(P<0.01,圖5B)。

    * P<0.01, vs. control; # P<0.01, vs. AGEs group. Bay117082, NF-κB signaling pathway inhibitor.圖5 AGEs作用于PBMCs后,Western blot檢測(cè)NF-κB p65的表達(dá)(A),ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β的含量變化(B)Figure 5 NF-κB p65 expression examined by Western blot (A) and TNF-α and IL-1β level examined by ELISA (B) after AGEs treatment with PBMCs

    2.6 JNK/p38、NF-κB、PI3K/PKB信號(hào)通路在AGEs干預(yù)OB后的作用機(jī)制

    第1組細(xì)胞處理后,分別檢測(cè)NF-κB p65、IκB、p38、JNK、Akt蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)變化。Western blot結(jié)果顯示,隨作用時(shí)間延長(zhǎng),AGEs可使OB中NF-κB p65、JNK、p38磷酸化和非磷酸化蛋白顯著升高(P<0.05),而IκB磷酸化蛋白表達(dá)顯著升高的同時(shí)還伴有非磷酸化蛋白表達(dá)下降(P<0.01),Akt磷酸化及非磷酸化蛋白未見(jiàn)明顯變化(P>0.05,圖6A~E)。隨AGEs作用時(shí)間延長(zhǎng),NF-κB p65、JNK、p38 在mRNA水平的表達(dá)顯著升高,IκB mRNA表達(dá)顯著下降,尤其在AGEs作用120 h時(shí),而Akt mRNA表達(dá)并無(wú)明顯變化(P>0.05,圖6F)。

    P-NF-κB p65, P-IκB, P-p38, P-JNK, P-Akt are the phosphorylation products of NF-κB p65, IκB, p38, JNK, Akt, respectively. *P<0.05, #P<0.01, △P<0.001, vs. control respectively.圖6 AGEs作用于OB不同時(shí)間后,NF-κB、PI3K/PKB、MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的Western blot檢測(cè)(A~E)和qRT-PCR檢測(cè)(F)Figure 6 The related gene expression of NF-κB, PI3K/PKB, MAPK signaling pathways examined by Western blot (A-E) and qRT-PCR (F) after the AGEs stimulated OB

    第2組、第3組細(xì)胞處理后,采用Western blot、qRT-PCR分別檢測(cè)NF-κB p65、IκB、p38、JNK、Akt蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)變化。Western blot結(jié)果顯示,與只加入AGEs組相比,加入JNK抑制劑(圖7A~E)、p38(圖8A~E)抑制劑后,NF-κB p65、p38、JNK磷酸化和非磷酸化蛋白表達(dá)均顯著降低,IκB磷酸化蛋白顯著降低,而非磷酸化蛋白顯著升高(P<0.05),Akt表達(dá)未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,與只加入AGEs組相比,加入JNK通路阻斷劑后的IκB表達(dá)顯著升高(P<0.05),NF-κB p65、p38、JNK表達(dá)呈下降趨勢(shì),但差異不明顯(P>0.05),Akt表達(dá)未見(jiàn)明顯變化(P>0.05,圖7F);加入p38信號(hào)通路阻斷劑后,NF-κB p65、p38、JNK表達(dá)顯著降低(P<0.05),IκB表達(dá)顯著升高(P<0.05),Akt表達(dá)未見(jiàn)明顯變化(P>0.05,圖8F)。

    P-NF-κB p65, P-IκB, P-p38, P-JNK, P-Akt are the phosphorylation products of NF- κB p65, IκB, p38, JNK, Akt, respectively. *P<0.05, vs. JNK inhibitor at the same time.圖7 加入JNK阻斷劑后,AGEs對(duì)OB NF-κB、PI3K/PKB、MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的Western blot檢測(cè)(A~E)和qRT-PCR檢測(cè)(F)Figure 7 The related gene expression of NF-κB, PI3K/PKB, MAPK signaling pathways examined by Western blot (A-E) and qRT-PCR (F) after blocking by JNK inhibitor

    P-NF-κB p65, P-IκB, P-p38, P-JNK, P-Akt are the phosphorylation products of NF-κB p65, IκB, p38, JNK, Akt, respectively. *P<0.05, vs. p38 inhibitor at the same time.圖8 加入p38阻斷劑后,AGEs對(duì)OB NF-κB、PI3K/PKB、MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的Western blot檢測(cè)(A~E)和qRT-PCR檢測(cè)(F)Figure 8 The related gene expression of NF-κB, PI3K/PKB, MAPK signaling pathways examined by Western blot (A-E) and qRT-PCR (F) after blocking by p38 inhibitor

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    AGEs是通過(guò)非酶糖化反應(yīng)途徑,由還原性單糖的醛基或酮基與氨基酸、核酸或脂質(zhì)等大分子中的氨基之間形成希夫(Schiff)鍵,再經(jīng)緩慢而復(fù)雜的重排,最終形成的不可逆聚合物[7]。AGEs的作用機(jī)制復(fù)雜,包括由于糖基化修飾直接引起的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的改變,以及通過(guò)其受體及其他結(jié)合蛋白介導(dǎo)的發(fā)生在不同組織細(xì)胞的一系列間接病理變化[8]。RAGE是能與AGEs結(jié)合發(fā)揮其作用的重要受體分子之一,作為一種膜蛋白,其分為胞外域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)段,屬于免疫球蛋白超家族成員[9]。RAGE在許多細(xì)胞表面都有表達(dá),如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等,當(dāng)細(xì)胞處于激活或應(yīng)激狀態(tài)時(shí)(高血糖、炎癥),細(xì)胞RAGE表達(dá)顯著增強(qiáng)。AGEs與RAGE作用后,能觸發(fā)多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,如NADPH氧化酶-活性氧通路、PKB/Akt通路、MAPK通路等,涉及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶ERK、p38、JNK等上游因子,進(jìn)一步激活NF-κB級(jí)聯(lián)發(fā)揮生物學(xué)作用[10]。另外,一些研究證實(shí)RAGE是一種類似于Toll樣受體的模式識(shí)別受體,在炎癥免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[11],所以從免疫調(diào)節(jié)機(jī)制方面研究AGEs致病作用是一個(gè)嶄新的課題。

    本研究旨在檢測(cè)糖尿病AGEs對(duì)PBMCs及OB增殖的影響,初步了解AGEs和RAGE相互作用在牙周免疫反應(yīng)以及骨細(xì)胞代謝中的作用,并分析AGEs/RAGE作用軸中NF-κB信號(hào)通路及其上游PI3K/PKB、MAPK信號(hào)通路的作用機(jī)制。本研究證實(shí),AGEs隨作用濃度和時(shí)間的增加能夠顯著抑制PBMCs、OB的增殖。當(dāng)AGEs作用濃度超過(guò)0.5 g/L時(shí),細(xì)胞活力隨作用時(shí)間增加而逐漸降低,這是本研究選取<0.5 g/L AGEs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

    我們首先關(guān)注了牙周炎癥進(jìn)展中處于一線防御地位的單核巨噬細(xì)胞在AGEs作用下的表現(xiàn)。AGEs與單核巨噬細(xì)胞的作用存在雙重影響:一方面,單核巨噬細(xì)胞通過(guò)其細(xì)胞表面的RAGE,識(shí)別、內(nèi)吞并降解清除AGEs;另一方面,AGEs可以誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞的趨化性,當(dāng)游離的單核巨噬細(xì)胞與組織中或血管壁上的AGEs結(jié)合后,可被激活,合成并釋放血小板源生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等生長(zhǎng)因子以及IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子,從而引起炎癥反應(yīng)并刺激細(xì)胞異常增殖[12]。本研究也部分證實(shí)了上述觀點(diǎn),即AGEs作用下,PBMCs中TNF-α、IL-1β分泌增加,同時(shí)伴有NF-κB表達(dá)增加,而在阻斷NF-κB通路后,上述炎性細(xì)胞因子水平顯著下降,證實(shí)了NF-κB信號(hào)通路參與AGEs致PBMCs加劇炎癥反應(yīng)的過(guò)程。未來(lái)還可進(jìn)一步定位RAGE在單核細(xì)胞中的表達(dá),并明確更多信號(hào)通路參與AGEs/RAGE軸作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。

    鑒于牙周炎癥實(shí)質(zhì)是牙槽骨的吸收,本研究接下來(lái)關(guān)注了AGEs對(duì)牙周OB以及骨髓基質(zhì)細(xì)胞(結(jié)果另文發(fā)表)的影響,結(jié)果證實(shí),0.25 g/L AGEs作用下,OB的NF-κB激活,其上游通路中JNK、p38磷酸化、非磷酸化蛋白表達(dá)增加,而Akt磷酸化及非磷酸化蛋白表達(dá)無(wú)差異,提示AGEs作用過(guò)程中JNK、p38參與調(diào)控,而與PI3K/PKB信號(hào)通路無(wú)關(guān)。另外,在這一過(guò)程中,IκB磷酸化蛋白增加驗(yàn)證了上述AGEs/RAGE介導(dǎo)的NF-κB激活機(jī)制[13]:AGEs刺激作用下,IκB發(fā)生磷酸化,NF-κB三聚體降解,釋放NF-κB,級(jí)聯(lián)發(fā)揮生物學(xué)作用。JNK和p38被稱為“應(yīng)激誘導(dǎo)”的MAPK,可被多種應(yīng)激刺激激活,如脂多糖、炎癥因子、滲透壓改變、輻射等。JNK和p38可同時(shí)被JNK激酶1激活,這種交叉作用使兩條通路在信號(hào)分子及生物學(xué)效應(yīng)方面存在諸多相似性。本研究在OB的實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了上述觀點(diǎn),可以認(rèn)為AGEs通過(guò)p38、JNK及下游NF-κB信號(hào)通路影響OB代謝。另外,鑒于p38信號(hào)通路阻斷可使NF-κB p65表達(dá)顯著減低,推斷AGEs作用過(guò)程中p38信號(hào)通路相對(duì)JNK通路對(duì)OB的影響更為密切。再者,根據(jù)NF-κB、p38、JNK mRNA在阻斷后表達(dá)明顯降低,可以推斷AGEs對(duì)OB的影響要弱于對(duì)具有干細(xì)胞分化潛能的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的作用(結(jié)果另文發(fā)表),這也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇更為敏感的靶細(xì)胞提供了思路。PI3K/PKB信號(hào)作為RAGE下游的信號(hào)通路途徑之一,是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在細(xì)胞存活、凋亡中發(fā)揮重要作用[14]。本研究表明,AGEs干預(yù)OB后,Akt mRNA及蛋白水平表達(dá)并無(wú)明顯規(guī)律性或顯著性改變,提示AGEs并不通過(guò)PI3K/PKB通路影響OB中NF-κB的表達(dá)。

    鑒于RAGE作為模式識(shí)別受體的一種新形式,會(huì)在炎癥免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,未來(lái)可進(jìn)一步分析AGEs/RAGE軸對(duì)牙周炎癥相關(guān)細(xì)胞的影響,著重研究不同靶細(xì)胞RAGE的分布及類型,通過(guò)使用可溶性RAGE、RAGE抗體或基因沉默等方法,結(jié)合信號(hào)通路分析,深入了解AGEs促進(jìn)牙周組織炎癥的作用及其機(jī)制,為疾病治療及應(yīng)用于臨床提供思路。

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