桑里白粉病菌重寄生真菌的分離與鑒定

韓寧寧，王正賢，黃奕蔓，廖詠梅

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530005）

關(guān) 鍵 字：桑里白粉病菌；重寄生真菌；尖孢枝孢；刀孢蠟蚧菌

桑白粉病是桑樹上的一種重要病害，根據(jù)其發(fā)生部位不同可分為桑里白粉病（桑生球針殼Phyllactinia moricola）和桑表白粉?。ㄉ０追劬鶨rysiphemori）[1]。桑白粉病的發(fā)生導(dǎo)致桑葉產(chǎn)量降低、質(zhì)量變劣，喂食感染白粉病桑葉的家蠶體質(zhì)弱，易誘發(fā)蠶病，蠶繭量、繭層量、繭層率均降低，嚴(yán)重影響蠶絲產(chǎn)業(yè)[2]。目前，對(duì)桑白粉病的防治主要以化學(xué)防治為主，但化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期使用不僅會(huì)造成環(huán)境污染，還會(huì)使桑白粉病菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致化學(xué)藥劑施用劑量增大，對(duì)非靶標(biāo)生物也產(chǎn)生殺傷作用，致使桑白粉病的自然控制力降低甚至消失；由于桑白粉病在晚秋時(shí)形成封閉的閉囊殼越冬，化學(xué)藥劑無法直接接觸子囊及子囊孢子而降低了防治效果。重寄生真菌在植物病害生物防治中是非常重要的菌物資源，已經(jīng)越來越受到各國(guó)植物病理學(xué)家的重視。李利等[3]綜述了白粉菌的重寄生真菌在國(guó)外的應(yīng)用情況，其中白粉寄生孢Ampelomyces quisqualis已被成功地用來防治多種植物白粉病，Tilletiopsisminor（擔(dān)子菌門Basidiomycota，外擔(dān)菌綱Exobasidiomycetes的一種真菌）和球狀莖點(diǎn)霉Phomaglomerata被用來生物防治溫室作物的白粉病。李利[4]從陜西關(guān)中西部地區(qū)采集到的10科16屬被白粉菌侵染的238個(gè)植物標(biāo)樣中，分離到白粉菌重寄生真菌3種，包括白粉寄生孢、A.humuli（與白粉寄生孢同一屬的另一種真菌）和球狀莖點(diǎn)霉，但未指出該3種重寄生真菌的寄主種類。李利[4]在關(guān)于白粉菌生防菌的文獻(xiàn)綜合中談及國(guó)外學(xué)者 Raghavendra Rao &Pavgi于1978年報(bào)道了尖孢枝孢Cladosporiumoxysporum是桑樹上一種球針殼菌P.corylea的重寄生真菌，該菌的現(xiàn)用名為榛球針殼P.guttata[5]，榛球針殼可以寄生包括桑科（Moraceae）在內(nèi)的8科11種木本植物的白粉病菌上[6]。國(guó)內(nèi)邱欣[7]報(bào)道，在云南分離出一株可以捕食桑里白粉病菌分生孢子的類酵母真菌Pseudozymaaphidis。

本文開展桑里白粉病菌重寄生真菌的分離，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行種類鑒定，為進(jìn)一步利用重寄生真菌防治桑里白粉病提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

于 2018年不同月份，在兩個(gè)桑園中采集病桑葉作為試驗(yàn)材料。桑園一位于廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院（南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)下均路 10號(hào)）的桑種質(zhì)資源圃，栽培管理過程不施任何化學(xué)藥劑。桑園二位于廣西大學(xué)農(nóng)場(chǎng)（南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)大學(xué)路100號(hào)）的生產(chǎn)桑葉用桑園，該桑園按常規(guī)方法管理，每年7月和12月同時(shí)噴灑石硫合劑、甲基托布津和敵百蟲以防治桑樹的病蟲害。在3月和5月采集的病桑葉背僅有分生孢子，1月和12月采集的病桑葉背有分生孢子和閉囊殼。將1月采集的病桑葉單張平鋪在室內(nèi)陰干1個(gè)月后收集于紙盒中，在室內(nèi)條件下存放。

1.2 桑里白粉病菌重寄生現(xiàn)象的觀察

用毛筆將病桑葉背面的分生孢子和閉囊殼輕輕掃下，收集于2 mL離心管中，加入75%酒精消毒1 min，10000 g/min離心30 s，棄掉上清液（酒精）；加入無菌水清洗1 min，10000 g/min離心30 s，棄掉上清液（無菌水），重復(fù)3次清洗，加入1 mL無菌水懸浮沉淀。鏡檢發(fā)現(xiàn)，懸浮液中主要是閉囊殼。將無菌的濾紙置于培養(yǎng)皿中，用微量可調(diào)移液器吸取200 μL閉囊殼懸浮液，滴到無菌濾紙上，用封口膠封閉培養(yǎng)皿口，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)，每隔一周在濾紙邊緣加入2 mL無菌水以保持濕度，持續(xù)6周，觀察培養(yǎng)皿中濾紙上是否有真菌菌落生長(zhǎng)。

1.3 桑里白粉病菌重寄生真菌的分離

用毛筆將病桑葉背面的分生孢子和閉囊殼掃下，收集于離心管中，加入1 mL無菌水制成菌液，將菌液稀釋10和100倍，用微量可調(diào)移液器吸取200 μL不同稀釋菌液加在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基平板上，并涂布均勻，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)皿中菌落的生長(zhǎng)情況。

挑取1.2中濾紙上和上述PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的形態(tài)、顏色及透明度等菌落特征不同的真菌單菌落，置于新的PDA培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)，待菌落直徑達(dá)3 cm左右時(shí)，用接種針在菌落邊緣挑取少許菌絲體置于新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，完成 2～3次的純化后標(biāo)注純化菌株編號(hào)，移到2 mL離心管中的PDA培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)2 d后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 桑里白粉病菌重寄生真菌寄生性驗(yàn)證

于2018年12月，在桑園二（廣西大學(xué)農(nóng)場(chǎng)）采集感染桑里白粉病的桑葉（按照1.2的方法觀察的結(jié)果表明，由于該桑園每年噴灑兩次廣譜殺菌劑及殺蟲劑，未發(fā)現(xiàn)病桑葉上的閉囊殼有重寄生現(xiàn)象），按照1.2的方法收集閉囊殼于2 mL離心管中，經(jīng)表面消毒后制成閉囊殼懸浮液。刮下分離到的候選重寄生真菌菌絲體（菌絲體濕重2 g）置于2 mL的離心管中，加入1 mL無菌水制成濃度為2 g/mL的菌絲體懸浮液。用移液器吸取200 μL閉囊殼懸浮液加在培養(yǎng)皿中的無菌濾紙上，再吸取200 μL候選重寄生真菌菌絲體懸浮液加在閉囊殼表面，用封口膠封閉培養(yǎng)皿并標(biāo)記，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)，每隔一周在濾紙邊緣加入適量無菌水以保持濕度，同時(shí)挑取部分閉囊殼進(jìn)行鏡檢，觀察閉囊殼被寄生情況，持續(xù)觀察6周。以加無菌水到閉囊殼表面為對(duì)照。

1.5 桑里白粉菌重寄生真菌的種類鑒定

將分離到寄生閉囊殼的重寄生真菌菌株，于 PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，觀察重寄生真菌的菌落特征，用光學(xué)顯微鏡鏡檢其營(yíng)養(yǎng)體和繁殖體的形態(tài)特征，初步鑒定重寄生真菌的分類地位；同時(shí)通過PCR技術(shù)擴(kuò)增重寄生真菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS），通過測(cè)序和分析ITS區(qū)域的核苷酸序列，作為重寄生真菌種類鑒定的依據(jù)之一。用接種環(huán)刮下PDA平板上的重寄生真菌的菌絲體，用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit（杭州博日科技有限公司）提取真菌基因組DNA，用ITS1和ITS4引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，引物序列 ITS1為5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4為5'-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3'[8]。

PCR 反應(yīng)體系 20 μL：模板 DNA 1.0 μL（20 ng/μL）、上下游引物各 1.0 μL（10 μmol/L）、2×EsTaqMaster Mix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）10.0 μL、ddH2O 7.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，獲得清晰的單一預(yù)期條帶后直接送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將所獲序列在NCBI的 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與已知序列進(jìn)行 Blast比對(duì)。利用 Mega 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，用鄰接法（Neighbor-joining method，N-J法）構(gòu)建ITS的系統(tǒng)進(jìn)化樹[9]。

1.6 桑里白粉病菌的高通量測(cè)序

2018年1月自桑園二采集感染桑里白粉病的病桑葉，置于室內(nèi)陰干后保存4個(gè)月后，用毛筆把病桑葉背面的桑里白粉病菌輕輕掃下，用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit（杭州博日科技有限公司）提取桑里白粉病菌的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察到完整DNA并無降解現(xiàn)象時(shí)，送廣西普斐生物信息科技有限公司，針對(duì)樣品總DNA中真菌的ITS1-ITS2區(qū)域，基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序（Paired-End）的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。通過對(duì)Reads拼接過濾，OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑里白粉病菌的重寄生現(xiàn)象

刮取感染桑里白粉病桑葉背面的分生孢子和閉囊殼，進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，桑里白粉病菌上存在多種重寄生現(xiàn)象（圖1）。有些重寄生真菌寄生在桑里白粉病菌的分生孢子上（圖 1A～E），分生孢子的表面長(zhǎng)出菌絲體（圖1A，B），或分生孢子表面或內(nèi)部產(chǎn)生大量孢子（圖1C～E）；有些重寄生真菌寄生在桑里白粉病菌的閉囊殼上（圖1 F～H），閉囊殼上長(zhǎng)出菌絲體（圖1F），且菌絲體可長(zhǎng)滿整個(gè)閉囊殼（圖1 G，H）。

圖1 桑里白粉病菌的重寄生現(xiàn)象Fig.1 The hyperparasitism of P.moricola on mulberry

其中采自桑園一（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院桑種質(zhì)資源圃，管理過程不施任何化學(xué)藥劑）的閉囊殼表面長(zhǎng)有大量真菌菌絲體，而采自桑園二（廣西大學(xué)農(nóng)場(chǎng)生產(chǎn)桑園，管理過程每年2次噴施殺菌劑和殺蟲劑）的閉囊殼表面未見長(zhǎng)出真菌菌絲體?？梢?，施用化學(xué)藥劑會(huì)影響桑里白粉病菌的重寄生。

2.2 桑里白粉病菌重寄生真菌的分離及其寄生性測(cè)定

自閉囊殼表面分離純化得到9個(gè)屬共23個(gè)真菌菌株（HP1-HP23），經(jīng)針對(duì)閉囊殼的致病性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除菌株HP6-HP17可以寄生桑里白粉病菌的閉囊殼、在閉囊殼表面產(chǎn)生大量的菌絲體外，分離到的其他菌株均未發(fā)現(xiàn)重寄生現(xiàn)象。加無菌水的對(duì)照閉囊殼上也未發(fā)現(xiàn)重寄生現(xiàn)象。其中菌株 HP6-HP8的菌落（灰綠色）及分生孢子特征一致，菌株HP9-HP17的菌落（白色）及分生孢子特征一致。選取菌株HP8和HP9為代表菌株，進(jìn)行該兩類真菌的致病性測(cè)定和種類鑒定。

光學(xué)顯微鏡下觀察，在28 ℃放置4周后，被菌株HP8寄生的閉囊殼變成空殼，閉囊殼內(nèi)子囊孢子全部消失，閉囊殼失去活性（圖2A，B）；在28 ℃放置6周后，被菌株HP9寄生的閉囊殼，子囊及子囊孢子均被破壞，變成一團(tuán)，失去原來的形態(tài)，閉囊殼也失去了活力（圖2D，E）。

圖2 重寄生真菌寄生桑里白粉病菌閉囊殼Fig.2 Hyperparasitic fungi parasitized on cleistothecia of P.moricola

2.3 桑里白粉病菌重寄生真菌的種類鑒定

2.3.1 桑里白粉菌重寄生真菌的形態(tài)特征 菌株HP8在PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，菌落灰綠色，在菌落表面有環(huán)紋，直徑30 mm，菌落背面光滑，深綠色。光學(xué)顯微鏡下觀察，菌株HP8菌絲體細(xì)長(zhǎng)，少數(shù)微彎曲，褐色或無色，有隔膜，分生孢子梗結(jié)節(jié)狀膨大；分生孢子單胞，橢圓形，褐色或無色，大小為（3～10）μm×（2～10）μm（圖 3）。

圖3 重寄生真菌菌株HP8的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of hyperparasitic fungus strain HP8

菌株HP9在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)20 d后，菌落白色，在菌落表面有不明顯環(huán)紋，直徑70 mm，菌落背面光滑，淡黃色。光學(xué)顯微鏡下觀察，菌株HP9菌絲體細(xì)長(zhǎng)，無色，有隔膜；分生孢子單胞，無色，月牙形，大小為（3～5）μm×（2～3.5）μm（圖4）。

圖4 重寄生真菌菌株HP9的形態(tài)特征Fig.4 Morphological characteristics of hyperparasitic fungus strain HP9

2.3.2 桑里白粉病菌重寄生真菌的 ITS序列分析 用真菌通用引物ITS1/ITS4針對(duì)菌株HP8和菌株HP9的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約500 bp的單一條帶。測(cè)序結(jié)果表明，菌株HP8的ITS序列長(zhǎng)度為520 bp，菌株HP9的ITS序列長(zhǎng)度為586 bp。Blast結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株HP8的ITS序列（MT463536）與尖孢枝孢Cladosporiumoxysporum（MF135506）有100%的同源性，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，菌株HP8序列和尖孢枝孢（MF135506）的距離最近（圖5）；菌株HP9的ITS序列（MT463537）與刀孢蠟蚧菌Lecanicillium psalliotae（KC881072）有99%的同源性，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，菌株HP9與刀孢蠟蚧菌（KC881072）的距離最近（圖6）。結(jié)合形態(tài)特征及ITS序列的分析結(jié)果，鑒定菌株HP8為尖孢枝孢；鑒定菌株HP9為刀孢蠟蚧菌。

圖5 菌株HP8的ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of ITS sequence of strain HP8

圖6 菌株HP9的ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of ITS sequence of strain HP9

2.4 桑里白粉菌的高通量測(cè)序

室內(nèi)保存了 4個(gè)月的來自桑園二的桑里白粉病病葉上的分生孢子和閉囊殼的高通量測(cè)序，獲得優(yōu)質(zhì)reads共10.03萬條，可見數(shù)據(jù)量足夠大，能代表樣品中的真菌種群信息。序列分析發(fā)現(xiàn)，桑里白粉病菌相對(duì)豐度最高，為97.02%，其次是刀孢蠟蚧菌相對(duì)豐度為 2.10%，桑表白粉病菌相對(duì)豐度為0.24%，擬鳥巢菌屬的一種真菌Nidulariopsisiowensis的相對(duì)豐度為0.02%?？梢?，桑里白粉病菌的重寄生真菌主要是刀孢蠟蚧菌。圖7是高通量測(cè)序結(jié)果中相對(duì)豐度位居前6的屬。

圖7 桑里白粉病菌閉囊殼樣品中相對(duì)豐度前6個(gè)真菌屬Fig.7 Top six fungi genera of relative abundance in sample of P.moricola

3 討論

本文獲得2種桑生球針殼的重寄生真菌，包括尖孢枝孢和刀孢蠟蚧菌。尖孢枝孢的分類地位為子囊菌門 Ascomycota、座囊菌綱 Dothideomycetes、煤炱目 Capnodiales、煤炱菌科 Cladosporiaceae、枝孢屬Cladosporium；刀孢蠟蚧菌的分類地位為子囊菌門、糞殼菌綱Sordariomycetes、肉座菌目Hypocreales、蟲草菌科Cordycipitaceae、蠟蚧菌屬Lecanicillium。

尖孢枝孢除了是桑生球針殼的重寄生真菌，也是重要的植物病原菌。Baiswar等[10]報(bào)道，尖孢枝孢引起尼泊爾李Prunusnepalensis的葉枯病，苗木發(fā)病率達(dá)到40%。Willingham等[11]報(bào)道，尖孢枝孢是西番蓮果實(shí)瘡痂病的病原菌。黃欣陽(yáng)等[12]報(bào)道，尖孢枝孢可引起設(shè)施栽培辣椒上的葉斑病。寄生桑生球針殼上的尖孢枝孢是否對(duì)其他農(nóng)作物有致病性，尚需進(jìn)一步研究。

刀孢蠟蚧菌的異名是刀孢輪枝菌Verticilliumpsalliotae[5]。刀孢蠟蚧菌被普遍認(rèn)為是一種蟲生真菌，可以寄生薊馬[13]、蚜蟲、粉虱、蚧殼蟲[14]、柑橘木虱[15]等多種農(nóng)業(yè)害蟲，還可寄生根結(jié)線蟲、孢囊線蟲和腐生線蟲[16,17]，也通過重寄生的方式寄生銹菌[18,14]、疫霉菌等多種植物病原菌[14]，在農(nóng)業(yè)病蟲害生物防治中有巨大潛力。刀孢蠟蚧菌除了是多種寄主的致病菌，施用到植物上還可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。Senthil Kumar等[13]報(bào)道，在盆栽試驗(yàn)中，在小豆蔻Elettariacardamomum幼苗根區(qū)施用刀孢蠟蚧菌的菌劑，與不施菌劑的對(duì)照相比，顯著增加了豆蔻幼苗的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)、芽和根的生物量、次生根和葉的數(shù)量以及葉片葉綠素的含量。但未見刀孢蠟蚧菌引起植物病害的報(bào)道，值得進(jìn)一步在桑里白粉病的防治上開展應(yīng)用研究。

高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)保存4個(gè)月的病桑葉上桑里白粉病菌的主要重寄生真菌為刀孢蠟蚧菌，相對(duì)豐度為 2.10%。此外，還發(fā)現(xiàn)極少量的桑白粉病菌，相對(duì)豐度為0.24%，以及擬鳥巢菌屬Nidulariopsis中的一種擬鳥巢菌N.iowensis，相對(duì)豐度為 0.02%。擬鳥巢菌屬為擔(dān)子菌門 Basidiomycota傘菌綱Agaricomycetes真菌，一般在枯枝、落葉、糞肥、土壤等基質(zhì)上發(fā)現(xiàn)，能產(chǎn)生木質(zhì)素水解酶、纖維素水解酶，可自行完成木質(zhì)纖維素的降解過程，將作物秸稈轉(zhuǎn)化為真菌蛋白，被認(rèn)為是目前最理想的木質(zhì)纖維素降解菌[19]?？赡苁怯捎诓∩Ｈ~室內(nèi)保存4個(gè)月后，開始誘發(fā)可以降解葉片纖維素的擬鳥巢菌屬真菌的出現(xiàn)。

重寄生真菌尖孢枝孢和刀孢蠟蚧菌寄生桑里白粉病菌的閉囊殼后，閉囊殼內(nèi)的子囊及子囊孢子均消失，喪失萌發(fā)能力，可減少次年病害的初侵染來源。采樣及鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全年不施化學(xué)藥劑的桑園，重寄生現(xiàn)象普遍存在，但每年兩次施用殺菌劑和殺蟲劑的桑園，僅分生孢子上較容易出現(xiàn)重寄生現(xiàn)象，在采集病葉室內(nèi)保存2個(gè)月內(nèi)的閉囊殼上未發(fā)現(xiàn)有重寄生現(xiàn)象，室內(nèi)保存4個(gè)月后的高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重寄生真菌為刀孢蠟蚧菌。說明在自然界中，重寄生真菌與桑里白粉病菌是相互共存的，刀孢蠟蚧菌為桑里白粉病菌上普遍存在的一種重寄生真菌。桑葉是蠶的唯一葉用飼料，田間噴施化學(xué)藥劑防治桑白粉病引起的農(nóng)藥殘留，勢(shì)必會(huì)影響蠶的健康發(fā)育。應(yīng)用重寄生真菌開展病害的防治、通過改善栽培管理模式提高重寄生真菌對(duì)桑白粉病的自然控制能力，是值得進(jìn)一步研究的課題。