黃花蒿葉醇提取物除草活性物質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)鑒定

滕春紅，馮曦茹，徐永清，譚洪鶴，馬藝倩，陶 波*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

我國是世界農(nóng)藥生產(chǎn)大國也是農(nóng)藥應(yīng)用大國，化學(xué)除草是農(nóng)田雜草防治中的主要手段。大量使用化學(xué)除草劑導(dǎo)致除草劑藥效降低、用藥量增加、雜草抗藥性嚴重。截至2020年3月9日，全球總計有262種雜草對已知26種作用機制中的23種作用機制的除草劑產(chǎn)生了抗藥性?；瘜W(xué)除草劑在使用過程中也會對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生威脅[1,2]。

與化學(xué)除草劑相比，植物源除草劑不僅對環(huán)境友好，而且往往具有新穎的靶標(biāo)和作用機制[3]。目前，已經(jīng)有30個科的2000多種植物被報道含有具有除草活性的次生代謝物質(zhì)[4]，其中有些已被成功開發(fā)為除草劑，如環(huán)庚草醚、假蒟亭堿等[5-7]。這些天然物質(zhì)能夠影響植物的萌發(fā)、生長發(fā)育及密度和分布，是研發(fā)植物源除草劑的重要庫源之一[8]。廣泛篩選植物中有除草活性的天然產(chǎn)物，作為農(nóng)藥先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的重要來源，進行結(jié)構(gòu)衍生及優(yōu)化，已成為新農(nóng)藥創(chuàng)制研究的前沿與熱點領(lǐng)域，也是獲得具有良好的環(huán)境相容性農(nóng)藥的有效途徑之一[9]。

黃花蒿ArtemisiaannuaLinn.為菊科蒿屬一年生草本植物，具有很強的生境適應(yīng)性。黃花蒿在生長過程中不斷釋放除草活性物質(zhì)抑制其他植物或雜草的萌發(fā)和生長，因而在它們所形成的群落中，很少有其他植物或雜草生長。目前已從黃花蒿中分離得到多種化合物，這些化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境中易降解，對人、畜低毒，符合綠色環(huán)保新型除草劑開發(fā)的要求，可進一步合成植物源除草劑。

沈慧敏等[10]研究表明黃花蒿水抽提物對指示植物蘿卜、黃瓜、小麥和玉米的株高及鮮重具有抑制作用。趙紅梅等[11]采用GC-MS聯(lián)用儀從黃花蒿揮發(fā)油中分離鑒定出56種化合物。

為了進一步明確黃花蒿化感物質(zhì)在雜草防除中的作用，本試驗采用室內(nèi)生物測定法對黃花蒿葉醇提物的除草活性進行測定，采用系統(tǒng)溶劑分離和柱層析分離法對黃花蒿除草活性物質(zhì)進行分離，通過生物活性示蹤測定出除草活性最強的流份，并利用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對樣品進行結(jié)構(gòu)鑒定，初步確定黃花蒿除草活性物質(zhì)的主要成分。

1 材料與方法

1.1 供試植物

黃花蒿ArtemisiaannuaLinn.于6月采于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，采集后將根、莖和葉分開，置于陰涼處，粉粹后密封保存。

受體植物：蘿卜RaphanussativusL.種子。

供試雜草：反枝莧AmaranthusretroflexusL.、苘麻AbutilontheophrastiMedic.、狗尾草Setariaviirdis(L.)Beauv.和稗Echinachlaocrusgali(L.) Beauv.采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園。

1.2 供試儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備：GC-2010型氣相色譜儀，GCMS-QP2010型質(zhì)譜儀，WND-400A型中藥粉粹機，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，THC-5B型超聲波提取器，LRH-250-G型隔水式恒溫光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)皿，剪刀，研缽等。

1.3 黃花蒿除草活性物質(zhì)的提取

稱取20.0 g采集于6月的蒿葉部干粉，按照1:20質(zhì)量比加入400 mL的80%乙醇，超聲功率800 w，超聲提取溫度50 ℃，超聲提取3次合并濾液，抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至膏狀，得黃花蒿葉醇提物[12,13]，于4 ℃冰箱中保存用于生物測定。

1.4 黃花蒿化感除草活性的生物測定方法

稱取一定量的黃花蒿葉醇提物，以蒸餾水為溶劑，配制成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L的溶液，以蘿卜為指示植物，采用種子萌發(fā)法，進行除草活性測定[12-15]。每個處理設(shè)置4次重復(fù)。在人工智能培養(yǎng)箱中（25±1）℃恒溫保濕光照培養(yǎng)，光照12 h（7：00～19：00），黑暗12 h。120 h后計算對蘿卜種子萌發(fā)的抑制率、根長的抑制率、根鮮質(zhì)量的抑制率和綜合抑制效應(yīng)。

以稗、狗尾草、反枝莧和苘麻為受體，方法同上，向每個培養(yǎng)皿中播入30粒雜草種子，分別加入5 mL濃度為5.0 mg/mL黃花蒿葉醇提物。雜草種子在生測前進行滅菌消毒，之后分別加入蒸餾水催芽直至露白。7 d后計算對雜草種子萌發(fā)的影響。

1.5 黃花蒿化感除草活性物質(zhì)的分離與鑒定

黃花蒿葉部乙醇提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至膏狀，將浸膏溶解于蒸餾水，配制成一定濃度溶液。按極性遞增的順序依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇三種有機溶劑，按照有機溶劑與萃取溶液1:1等體積比萃取3次，合并3次相同溶劑的萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。稱量一定量的黃花蒿葉醇提物用蒸餾水溶解，配制成2.0 mg/mL的溶液，重復(fù)處理和培養(yǎng)方式同1.4。72 h后測定黃花蒿葉醇提物對蘿卜種子萌發(fā)的影響。

黃花蒿葉醇提物依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇三種有機溶劑萃取后進行生物活性追蹤，得到的抑制效果最好的石油醚層溶解后點樣，根據(jù)其在薄層板上的 Rf（比移值）大小確定最佳洗脫溶劑，直至Rf值在0.2～0.8時選擇此時的展開劑作為柱色譜相應(yīng)組分的最佳溶劑。

玻璃柱規(guī)格100 cm×5 cm，選擇100～200目的硅膠作為固定相，將除去氣泡的混均后的硅膠與洗脫液加入玻璃柱內(nèi)，液面稍高于硅膠表面時關(guān)閉活塞，然后將多余的洗脫液放出至頂部以保持1 cm高的液面時關(guān)閉活塞。

1.5.1 加樣 取適量黃花蒿葉醇提物浸膏，用少量極性稍大的有機溶劑溶解。將其溶解后加入吸附劑約為樣品的6倍量拌勻，在45 ℃～55 ℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器儀將其濃縮成干粉后加入到柱色譜的頂端，使樣品帶盡量保持平整，且在加完樣品后放一塊圓形濾紙。

1.5.2 洗脫 將Rf值在0.2～0.8時的溶劑作為柱色譜相應(yīng)組分的洗脫溶劑。用前期已選好的最佳洗脫劑，通過分液漏斗向玻璃柱中加入，打開活塞開關(guān)后讓洗脫劑慢慢地滴入，使流速保持速度為4滴/s，每錐形瓶一次收集50 mL洗脫液。根據(jù)TCL分析的結(jié)果進行合并。

1.5.3 薄層層析板的制備 參照Leather GR[16]的方法制備薄層層析板。

1.5.4 展開劑的制備 展開劑是洗脫劑的3.5倍量。展開劑所用的試劑與洗脫劑相同。

1.5.5 點樣 使用毛細管吸取樣品點樣后用電吹風(fēng)將其吹干并將薄層層析板放入展開劑中，溶劑前沿到距頂部約為1 cm時取出放于碘瓶中，待10 s左右即可以觀察到展開的結(jié)果和變化。

洗脫液使用不同體積比的石油醚:氯仿:甲醇（90:10:3、70:10:3、50:10:3、30:10:3、10:10:3）梯度淋洗且等體積50 mL/份，每個梯度收集6份共獲33個流分，編號然后對所獲流份采用生物測定跟蹤確定其活性強度[17]。

經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，分離獲得的流份用乙醇稀釋，利用氣質(zhì)聯(lián)用儀進行定性分析。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析條件為：初始溫度為50 ℃并保持3 min，以10 ℃/min速率升至280 ℃后保持3 min，柱箱溫度50 ℃、進樣量1.0 μL、進樣口和檢測器的溫度均280 ℃、掃描間隔為0.5 s、溶劑延遲時間3.5 min、掃描質(zhì)量范圍5～400 Amu[18,19]。

流份經(jīng)GC-MS檢測后，對其總離子的流量圖中出現(xiàn)的峰進行質(zhì)譜掃描，得到的質(zhì)譜圖采用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行相似度檢索，人工譜圖進行解析，按照每個色譜峰的質(zhì)譜裂片圖與相關(guān)的文獻進行核對，同時查閱有關(guān)質(zhì)譜的資料，將其基峰、質(zhì)荷比和相對豐度等與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進行對照比較，從而確定出樣品中的所有化合物的名稱。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗原始數(shù)據(jù)采用Excel進行整理，采用DPS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析。綜合抑制率（SE）是提取物對蘿卜3個測試項目(萌發(fā)、根長、芽長)的抑制百分率的算術(shù)平均值[20]。萌發(fā)抑制率（%）＝（對照發(fā)芽數(shù)—處理發(fā)芽數(shù)）/對照發(fā)芽數(shù)×100；根長抑制率（%）＝（對照根長—處理根長）/對照根長×100；芽長抑制率（%）＝（對照芽長—處理芽長）/對照芽長×100；發(fā)芽率（GR%）＝7 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)；發(fā)芽勢（CE%）＝3 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)；發(fā)芽指數(shù)（GI）＝Σ（Gt/Dt），Gt表示在第t天種子的發(fā)芽數(shù)，Dt代表相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花蒿葉醇提物對蘿卜種子萌發(fā)的影響

黃花蒿葉醇提物對蘿卜種子萌發(fā)的影響如圖1所示。從圖中計算出黃花蒿葉醇提物對蘿卜葉萌發(fā)抑制率的ED50＝0.75 mg/mL，ED90＝1.4 mg/mL，參考此濃度來設(shè)定對雜草影響的劑量。黃花蒿葉醇提物對蘿卜種子萌發(fā)抑制率的R2為0.9827，說明黃花蒿葉醇提物對蘿卜種子萌發(fā)的抑制作用比較明顯，因此，蘿卜可作為下一步除草活性物質(zhì)分離的活性示蹤指示植物。

圖1 黃花蒿葉醇提物對蘿卜種子萌發(fā)的影響Fig.1 The effect of the ethanol extract of A.annua L.on radish seed germination

2.2 黃花蒿葉醇提物對不同供試雜草萌發(fā)的影響

黃花蒿葉醇提物對不同雜草萌發(fā)的影響如表 1所示。從表中可以看出，5.0 mg/mL濃度下，黃花蒿葉醇提物對雜草的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均有一定的抑制作用，抑制作用從大到小的順序為反枝莧，苘麻，狗尾草，稗，其中對反枝莧發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的抑制作用最強，對稗發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的抑制作用最弱，但對稗發(fā)芽勢的抑制作用較強。黃花蒿葉醇提物對反枝莧、苘麻、狗尾草和稗發(fā)芽率的抑制率分別為90.09%、85.79%、85.46%和14.23%；對反枝莧、苘麻、狗尾草和稗發(fā)芽勢的抑制率分別為96.71%、89.47%、84.63%和73.36%；對反枝莧、苘麻、狗尾草和稗發(fā)芽指數(shù)的抑制率分別為95.00%、88.62%、86.69%和17.10%。

表1 黃花蒿葉醇提物對不同雜草萌發(fā)的影響Table 1 Effect of leaves of the ethanol extract of A.annua L.on different weed seed germination

2.3 黃花蒿葉醇提物的系統(tǒng)溶劑分離

2 mg/mL的石油醚相對蘿卜種子的萌發(fā)抑制率為 90.91%，高于乙酸乙酯相和正丁醇相的萌發(fā)抑制率50.22%和19.18%（表2）。三種萃取液對根長和芽長的抑制率均為石油醚相高于乙酸乙酯相和正丁醇相。石油醚相對蘿卜種子萌發(fā)的抑制效果最好，由此說明黃花蒿中的除草活性物質(zhì)在石油醚層中溶解較多?？赏ㄟ^對黃花蒿葉部乙醇提取液石油醚萃取層的成分分離，確定其除草活性物質(zhì)的主要活性成分，進一步驗證主要活性成分的除草活性，并進行盆栽和田間藥效試驗，確定其除草活性物質(zhì)是否可能開發(fā)成新型除草劑。

表2 黃花蒿不同萃取液對蘿卜萌發(fā)和生長的影響Table 2 Effect of different extract of A.annua L.on Raphanus sativus germination and seedling growth

2.4 黃花蒿除草活性物質(zhì)的分離

以蘿卜種子作為指示植物，對黃花蒿葉醇提物的石油醚相的 33個流份進行除草活性的生物測定，結(jié)果見表3，從表中可以看出，6號流份對蘿卜種子的活性明顯高于其他的流份，0.01 mg/mL的6號流份對蘿卜種子萌發(fā)、芽長和根長的抑制率分別為60.23%、65.78%和71.67%，綜合抑制率為65.90%。因而可以確定主要有效除草活性成分在6號流份樣品中，因此鑒定檢測該流份。

表3 黃花蒿中分離出的除草活性物質(zhì)對蘿卜種子萌發(fā)和生長的抑制率Table 3 Inhibition ratio of the herbicidal activity substances separated from A.annua to germination and growth of R.sativus seeds

2.5 6號樣品GC-MS鑒定檢測結(jié)果

采用GC-MS對6號樣品進行成分分析，對其總離子流量圖中出現(xiàn)的峰進行質(zhì)譜掃描，將其基峰、質(zhì)荷比和相對豐度等與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進行對照比較確定出樣品中化合物的名稱。

6號樣品的總離子流量圖如圖2所示。6號流份的GC-MS峰信息表如表4所示，從表4可以看出，6號流份共檢測出17種有機化合物（僅列出匹配度在80以上的物質(zhì)），其中主要成分為青蒿酸和亞油酸等，對應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為C15H22O2和C18H32O2，相對含量分別為11.45%和6.49%。

圖2 6號樣品的總離子流量圖Fig.2 GC-MS result of sample 6

表4 6號流份的GC-MS峰信息表Table 4 GC-MS peaks information of 6

3 討論

本研究結(jié)果表明，黃花蒿葉醇提物5.0 mg/mL對供試雜草反枝莧、苘麻、狗尾草和稗的發(fā)芽勢均有很強的抑制作用，對反枝莧發(fā)芽勢的抑制作用最強，達到 96.71%，對苘麻、狗尾草和稗發(fā)芽勢的抑制率也超過了73%，這說明黃花蒿葉醇提物可以延緩雜草的發(fā)芽時間，從而減輕對作物的競爭。黃花蒿葉醇提物5.0 mg/mL對供試雜草反枝莧、苘麻、狗尾草發(fā)芽率的抑制作用也較強，均超過了85%，這說明黃花蒿葉醇提物對雜草萌發(fā)產(chǎn)生了明顯的抑制作用。黃花蒿葉醇提物可以通過延緩雜草的發(fā)芽時間和減少發(fā)芽率來減輕對作物的競爭，具備開發(fā)為新型植物源除草劑的潛力。

本研究將黃花蒿葉醇提物分離得到的流份進行GC-MS檢測，共鑒定出17種主要化合物，主要成分為青蒿酸（11.45%）、亞油酸（6.49%）、鄰苯二甲酸二乙酯（4.62%）、二氫獼猴桃內(nèi)酯（4.12%）、十八烷酸（2.84%）和香草酸（0.43%）等萜類、酚類、醇類、酯類、烷烴類和有機酸類等化合物。分離出來的化合物中，亞油酸、鄰苯二甲酸二乙酯和香草酸均已有文獻報道其具有化感除草作用[21-24]。而青蒿素、二氫獼猴桃內(nèi)酯和十八烷酸均屬于化感物質(zhì)，但關(guān)于其除草活性的報道較少[25-28]，是否具有化感除草活性需進一步試驗驗證。黃翔杰等[24]研究表明野菊根系分泌物中的鄰苯二甲酸二乙酯對生菜鮮重、萵苣和油菜胚根生長具有化感作用。陳芝蘭[31]研究表明鳳眼蓮根可顯著抑制赤潮藻的生長，亞油酸是鳳眼蓮根抑藻的主要因子之一；其抑藻機理可能是通過自由基反應(yīng)，破壞藻細胞的結(jié)構(gòu)，從而達到抑藻效果。在接下來的研究中計劃購買亞油酸、鄰苯二甲酸二乙酯、香草酸、青蒿素、二氫獼猴桃內(nèi)酯和十八烷酸的標(biāo)準(zhǔn)品進行室內(nèi)生測試驗，鑒定這些化合物是否具有除草活性，并確定活性最強的成分。然后將除草活性最強的成分進行人工模擬合成，用于溫室盆栽試驗和田間試驗，為研發(fā)新的植物源除草劑鑒定基礎(chǔ)。