藻源溶解性有機(jī)質(zhì)對(duì)汞甲基化的影響

李雨桐，何鑫龍，彭一帆，胡勰克，王昱杭，趙 婷，吳勝春,2，梁 鵬,2

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省土壤污染生物修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署《2013年全球汞評(píng)估報(bào)告》指出：中國(guó)是全球汞(Hg)的主要排放國(guó)，總排放量為全球的1/3，亞洲的3/4。表明在中國(guó)開展汞的生物地球化學(xué)研究對(duì)人體健康和生態(tài)安全具有重要意義[1]。湖泊水庫(kù)等水體中的汞主要來自河流輸入和大氣沉降，甲基汞(MeHg)則來源于水體汞的甲基化或沉積物中MeHg的釋放[2]，通過生物富集作用和食物鏈傳遞的生物放大作用，最終在人體內(nèi)積累，對(duì)人類安全危害極大。丁之勇等[3]發(fā)現(xiàn)：中國(guó)31個(gè)湖泊沉積物中汞的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.076 mg·kg-1；多個(gè)湖泊沉積物中汞的地累積指數(shù)達(dá)到中度或重度污染，潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)和平均污染程度僅次于鎘(Cd)。張杰等[4]發(fā)現(xiàn)：太湖流域河流表層沉積物中汞的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.109 mg·kg-1，超過背景值的采樣點(diǎn)占47.87%，潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)處于中等或以上。近年來中國(guó)湖泊富營(yíng)養(yǎng)化較為普遍，藻華時(shí)有發(fā)生，對(duì)湖泊水生生態(tài)系統(tǒng)造成極大威脅。溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)是水生生態(tài)系統(tǒng)中水體天然有機(jī)質(zhì)的主要成分(占97.1%)[5]，通常指能通過0.10～0.70 μm濾膜，包含不同結(jié)構(gòu)、分子量的碳基有機(jī)化合物，包括單糖、氨基酸等小分子化合物和蛋白質(zhì)、腐殖質(zhì)等大分子化合物。隨著藻類暴發(fā)性增長(zhǎng)，大量初級(jí)生產(chǎn)力進(jìn)入[6]，水體中DOM成分隨之發(fā)生變化。如河流河口的硅藻Bacillariophyta藻華可顯著增加DOM中碳水化合物的相對(duì)含量[7]，類蛋白質(zhì)熒光組分的峰強(qiáng)變化規(guī)律與各浮游藻類密度呈顯著相關(guān)(r＞0.80)[8]。一般認(rèn)為，藻類正常生長(zhǎng)的分泌物和降解的死亡藻體[9]都會(huì)造成沉積物中有機(jī)質(zhì)的異常積累，從而改變水質(zhì)參數(shù)，影響化合物形態(tài)的轉(zhuǎn)化。DOM的—CH3、—CH2、—OH、—COOH、—C=O、—NH2等多種活性官能團(tuán)可作為天然的載體與配體，與汞離子(Hg2+)發(fā)生氧化還原、絡(luò)合、螯合、沉淀等一系列反應(yīng)，從而影響水環(huán)境中汞元素的賦存形態(tài)、遷移性、溶解性以及最終歸趨[10]。此外，DOM還會(huì)改變沉積物的氧化還原電位(Eh)和pH[11]、微生物種群等[12]環(huán)境因子，間接影響汞的形態(tài)轉(zhuǎn)化。目前關(guān)于DOM影響汞甲基化的觀點(diǎn)仍存在著較大分歧。有學(xué)者認(rèn)為：DOM所含的還原態(tài)硫官能團(tuán)能對(duì)汞產(chǎn)生絡(luò)合作用，抑制其生物甲基化過程；也有研究者發(fā)現(xiàn)：較小的有機(jī)質(zhì)會(huì)促進(jìn)Hg的生物甲基化[13]，DOM可以直接或在金屬離子催化作用下參與非生物甲基化過程[14]。有鑒于水體中DOM來源的復(fù)雜性及其化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的差異性，在總量水平上研究其對(duì)汞的影響難以形成定論。因此，有必要從更微觀的角度闡明DOM對(duì)汞形態(tài)轉(zhuǎn)化影響的作用機(jī)制。根據(jù)極性和電荷特性，DOM可分為6個(gè)成分，即疏水性的堿性、酸性和中性DOM以及親水性的堿性、酸性和中性DOM[15]。水體富營(yíng)養(yǎng)化和藻華使得藻體腐解過程產(chǎn)生的有機(jī)物成為水環(huán)境中DOM的重要來源。本研究通過室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)，對(duì)不同腐解階段的藻類DOM進(jìn)行逐步分離，取得6個(gè)親水和疏水性亞組分，系統(tǒng)研究這些亞組分對(duì)汞甲基化的影響，以期豐富淡水環(huán)境中汞的生物地球化學(xué)理論，為汞污染的控制和降低汞污染健康風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與處理

供試藻體采自浙江省杭州市臨安區(qū)某小型淡水湖泊。選取富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重的湖水區(qū)域，用撈網(wǎng)收集水中浮藻，做好標(biāo)記后放置在收納箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。去除已腐爛的水藻及其他雜物后用水清洗干凈，并用去離子水淋洗3次，冷凍干燥后備用。

冷凍干燥的第0、5、10、20、30、60天各取浮藻樣品充分研磨，超純水浸提法提取DOM[2]。浸提條件為20 mL超純水與2.0 g浮藻樣品混合，黑暗、恒溫(25 ℃)下振蕩24 h后高速離心；取0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾離心后的上清液作為DOM樣品，結(jié)晶，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 藻體DOM的官能團(tuán)組成及光譜學(xué)特征測(cè)定

取DOM結(jié)晶，與溴化鉀(KBr)固體混合后制成壓片。使用傅里葉變換紅外光譜儀(IR Prstige-21，日本島津)測(cè)定不同腐解時(shí)期DOM的紅外光譜。為減少干擾，在分析每個(gè)樣品前先測(cè)定光譜背景值，通過環(huán)境空氣、二氧化碳(CO2)和水(H2O)矯正光譜。調(diào)節(jié)掃描波數(shù)精度為0.01 cm-1，波數(shù)為400～4 000 cm-1。

1.3 DOM6 種不同亞組分的分離分析方法

1.3.1 樹脂柱的搭建 用蠕動(dòng)泵將DOM樣品的原液通過填滿樹脂的樹脂柱，調(diào)節(jié)四氟丙烯活塞控制液體流動(dòng)速率。為了防止樹脂層中出現(xiàn)氣泡，用可拆卸的玻璃砂芯片固定樹脂。

1.3.2 樹脂的預(yù)處理 用體積分?jǐn)?shù)95%的甲醇過Amberlite XAD 4和Amberlite XAD 8樹脂柱，趕走柱中氣泡，用蒸餾水淋洗至流出液的溶解性有機(jī)碳(DOC)質(zhì)量濃度接近于0。用60 ℃的熱水反復(fù)清洗陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂，直到陰離子交換樹脂的浸洗水不再褐色、陽離子交換樹脂的浸洗水幾乎無泡沫；水洗后的陰、陽離子交換樹脂用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%～5%的氫氧化鈉(NaOH)和鹽酸(HCl)溶液二次清洗，以堿－酸－堿的進(jìn)液次序過陰離子交換樹脂柱，以酸－堿－酸的次序過陽離子交換樹脂柱。上述處理步驟完成后，將樹脂放置于密封罐中備用[2]。

1.3.3 DOM的富集分離 DOM分離參照LEENHEER等[16]和CHEFETZ等[17]方法。根據(jù)DOM在不同類型樹脂上吸附能力的差異，將其分為疏水堿性(HOB)、疏水中性(HON)、疏水酸性(HOA)、親水堿性(HIB)、親水中性(HIN)、親水酸性(HIA)6種有機(jī)組分[18]。其中HOB通過0.10 和0.01 mol·L-1鹽酸溶液反洗XAD-8樹脂后獲得，HOA由0.10 mol·L-1氫氧化鈉溶液反洗XAD-8樹脂后獲得，HON通過空氣干燥XAD-8樹脂并用甲醇索式提取后獲得；HIB由0.10 mol·L-1氨水(NH3·H2O)反洗BIO-RAD AGMP-50離子交換樹脂后獲得，HIA由3.00 mol·L-1氨水反洗DUOLITE A-7離子交換樹脂后獲得，HIN用純水淋洗DUOLITE A-7離子交換樹脂后獲得。得到的洗脫液置于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再經(jīng)過脫鹽、冷凍干燥后獲得固體樣品得固體樣品[18]。

1.4 不同Hg2+質(zhì)量濃度下DOM對(duì)汞甲基化的影響

配制6個(gè)質(zhì)量濃度梯度(100.00、200.00、400.00、800.00、1 600.00、3 200.00 ng·L-1)的氯化汞(HgCl2)溶液，測(cè)定未腐解藻體DOM各組分在不同氧氣條件(好氧、厭氧)下對(duì)汞甲基化的影響。

將裝有6種DOM亞組分樣品的離心管分組，整齊地放入?yún)捬醮校尤肱涮椎膮捬醍a(chǎn)氣包，快速擠出原有空氣后密封，室溫下放置24 h。

反應(yīng)皿中加入60 mL經(jīng)氮吹去氧的超純水，分別加入DOM各組分，調(diào)節(jié)總有機(jī)碳(TOC)至10 mg·L-1，pH為7，靜置1 d后，加入不同質(zhì)量濃度HgCl2溶液。采用蔣紅梅等[19]方法(蒸餾-乙基化結(jié)合氣相色譜-冷原子熒光，CVAFS法)在BROOKS RAND測(cè)汞儀上測(cè)定甲基汞質(zhì)量濃度(最低檢出限為0.009 ng·L-1)。

1.5 不同腐解時(shí)期DOM對(duì)汞甲基化的影響

配制1 000.00 ng·L-1的Hg2+溶液，分別加入第0、5、10、20、30、60天DOM各亞組分，參照蔣紅梅等[19]方法測(cè)定甲基汞質(zhì)量濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理和分析

數(shù)據(jù)處理和圖表制作采用Origin 8.5及Omnic 8.2軟件。MeHg測(cè)量按10%的平行操作，測(cè)定標(biāo)樣和空白樣并做標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析重復(fù)組數(shù)據(jù)時(shí)控制相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于12%。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同氧氣條件下未腐解藻體DOM各亞組分對(duì)汞甲基化的影響

堿性疏水性有機(jī)物(HOB)對(duì)汞甲基化貢獻(xiàn)最高，其次為HON和HIA，其他成分的貢獻(xiàn)量都較小，且沒有顯著差異。3種疏水性有機(jī)亞組分的汞甲基化作用由強(qiáng)到弱依次為HOB、HON、HOA。由圖1可知：不同氧氣條件下，MeHg生成量均隨Hg2＋質(zhì)量濃度增加而增加，提示HOB具有明顯促進(jìn)汞甲基化的能力。Hg2+低于1 600 ng·L-1時(shí)，好氧條件下MeHg轉(zhuǎn)化量隨Hg2+質(zhì)量濃度的增加而增加，轉(zhuǎn)化率則降低(由13.0%降至1.7%)；厭氧條件下MeHg的轉(zhuǎn)化量一直呈上升趨勢(shì)，轉(zhuǎn)化率則較為平穩(wěn)；相比之下，厭氧條件更有利于MeHg的生成。HOA與HON一定程度上也能促進(jìn)MeHg生成，但總體效果不如HOB。兩者均在Hg2+質(zhì)量濃度最大時(shí)達(dá)最大轉(zhuǎn)化量，但MeHg轉(zhuǎn)化率均隨Hg2+質(zhì)量濃度增加而下降。Hg2+質(zhì)量濃度為3 200 ng·L-1時(shí)，3種組分的MeHg轉(zhuǎn)化量厭氧條件均高于好氧條件。

圖1 不同Hg2+質(zhì)量濃度下DOM各亞組分對(duì)汞甲基化的影響Figure 1 Effect of DOM subcomponents on the production of MeHg at different initial Hg2+ concentrations

3種親水性有機(jī)亞組分中，HIB能略微促進(jìn)Hg2+的甲基化；厭氧條件下甲基汞生成量較少(最大值0.17 ng·L-1)；不同氧氣條件下轉(zhuǎn)化率均隨Hg2+質(zhì)量濃度增加而降低，好氧時(shí)最高值為29.0%，厭氧時(shí)最高值為13.0%。HIA在好氧條件下的MeHg轉(zhuǎn)化量表現(xiàn)為先上升后下降(最大值為0.40 ng·L-1)，厭氧條件下的轉(zhuǎn)化量很小(最大值0.15 ng·L-1)，轉(zhuǎn)化率隨Hg2+質(zhì)量濃度的升高而降低。HIN對(duì)汞形態(tài)轉(zhuǎn)化亦有一定的促進(jìn)作用。好氧、厭氧條件下MeHg轉(zhuǎn)化量隨濃度變化的規(guī)律性不強(qiáng)，厭氧轉(zhuǎn)化量更低；2種條件下轉(zhuǎn)化率均大致隨Hg2+濃度的升高而降低，但厭氧條件下最高轉(zhuǎn)化率僅為好氧時(shí)的一半。

以上結(jié)果表明：藻體DOM總體上可促進(jìn)水體中Hg2+的甲基化反應(yīng)。分離出的6個(gè)亞組分中，3個(gè)疏水性有機(jī)物對(duì)甲基汞產(chǎn)生的影響要強(qiáng)于3個(gè)親水性有機(jī)物，以HOB的促進(jìn)作用最為明顯。DOM影響重金屬在水體中形態(tài)變化過程的根本原因是其可以與重金屬離子形成絡(luò)合物，從而影響后者形態(tài)、生物有效性和毒性。有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)組成可以影響DOM對(duì)金屬的親合力。GUGGENBERGER等[20]發(fā)現(xiàn)：親水性酸性物質(zhì)對(duì)金屬離子有較強(qiáng)的絡(luò)合能力，是疏水性酸性物質(zhì)的2～8倍，與本研究中親水性DOM更易與溶液中的Hg2+結(jié)合、降低水體汞甲基化的結(jié)論一致。生物配體模型[21]認(rèn)為：親水性DOM與自由金屬離子絡(luò)合后使得自由離子平衡濃度下降，進(jìn)而降低金屬離子在有DOM存在時(shí)的有效性，與本研究結(jié)論也較為一致。研究發(fā)現(xiàn)：隨著Hg2+質(zhì)量濃度升高，甲基汞轉(zhuǎn)化率逐漸降低，表明在較高的Hg2+質(zhì)量濃度條件下，參與甲基化反應(yīng)DOM的甲基供體數(shù)量不足，與LIANG等[22]結(jié)論一致。

自然環(huán)境下，汞的甲基化特別是生物甲基化主要發(fā)生在厭氧條件下。本研究發(fā)現(xiàn)，不同亞組分在好氧/厭氧條件下對(duì)甲基汞產(chǎn)生的影響不同。對(duì)于HOB來說，厭氧條件更利于汞的甲基化反應(yīng)，厭氧條件下甲基汞產(chǎn)生量高于好氧條件，而其他成分在好氧、厭氧條件下的甲基汞產(chǎn)生量則無太大變化。

2.2 不同腐解時(shí)期藻體DOM的官能團(tuán)組成及光譜學(xué)特征

對(duì)不同腐解時(shí)長(zhǎng)下的藻體DOM作紅外光譜(圖2)分析可知：未腐解的DOM各官能團(tuán)種類最為豐富，隨腐解時(shí)間的延長(zhǎng)，基團(tuán)簇度呈逐漸減少趨勢(shì)；腐解第60天時(shí)，1 364 cm-1處的叔丁基[—C(CH3)]、2 900 cm-1處的飽和C—H鍵(—CH3)的伸縮和亞甲基(—CH2—)的反對(duì)稱伸縮、3 400 cm-1處游離態(tài)和締合態(tài)的羥基(O—H伸縮振動(dòng))的峰已很不明顯?？傮w來看，腐解0～10 d的DOM官能團(tuán)變化較小，較穩(wěn)定。對(duì)比1 060 cm-1處的波動(dòng)，可以看出不同腐解時(shí)長(zhǎng)下C—O鍵的簇?cái)?shù)明顯下降。綜上所述，不同腐解時(shí)長(zhǎng)下，DOM官能團(tuán)的數(shù)量和種類均發(fā)生變化，并影響各亞組分對(duì)汞的甲基化作用。

圖2 不同腐解時(shí)期DOM紅外光譜圖Figure 2 IR spectra of DOM at different decomposition intervals

2.3 不同腐解時(shí)期DOM各亞組分對(duì)汞甲基化的影響

HOB、HOA和HON為DOM的3個(gè)疏水性有機(jī)組分。由圖3可知：不同腐解時(shí)間產(chǎn)生的HOB，汞甲基化能力不盡相同。腐解初期(0～10 d)甲基化能力呈下降趨勢(shì)，第10天MeHg轉(zhuǎn)化量?jī)H為0.20 ng·L-1，10～20 d轉(zhuǎn)化量大幅增加，增幅達(dá)61.9%，之后小幅波動(dòng)，第60天時(shí)達(dá)最高值(0.71 ng·L-1)。腐解初期(0～10 d)HOA對(duì)汞的甲基化基本沒有影響，但隨腐解時(shí)間增長(zhǎng)，HOA的汞甲基化能力逐漸加強(qiáng)。相比之下，HON促進(jìn)汞甲基化能力總體較大；腐解初期略低，但最小值(第10天)也達(dá)到了1.20 ng·L-1，此后轉(zhuǎn)化量大幅增加，第60天達(dá)到最大轉(zhuǎn)化量(1.55 ng·L-1)。

圖3 不同腐解時(shí)間DOM亞組分對(duì)MeHg生成量的影響Figure 3 Variation of MeHg concentrations of DOM subcomponents at different decomposition intervals

相比而言，3個(gè)親水性組分的汞甲基化能力略低。其中，HIB的甲基汞轉(zhuǎn)化量最小，HIA和HIN隨著腐解時(shí)間的增加，汞甲基化能力先增加后降低，在第60天時(shí)達(dá)到了最低，與疏水性有機(jī)組分的結(jié)果正好相反。

以上研究結(jié)果表明，隨著腐解的進(jìn)行，親水性組分的促進(jìn)汞甲基化能力表現(xiàn)為先升高再降低乃至消失；疏水性組分則表現(xiàn)為先降低再逐漸升高。3種疏水性亞組分對(duì)汞甲基化的影響效應(yīng)均在60 d時(shí)達(dá)到極值。隨著藻類腐解進(jìn)程，藻體逐漸釋放出大量DOM。馮勝等[23]發(fā)現(xiàn)：狐尾藻Myriophyllum verticillatum腐爛過程中釋放出大量類蛋白物質(zhì)，DOM熒光組分和熒光峰呈先逐漸增強(qiáng)后逐漸降低趨勢(shì)；表明在腐解過程中，DOM先增加后減少。藻類DOM以類色氨酸成分為主，可以很快被微生物利用并降解轉(zhuǎn)變?yōu)轭惛迟|(zhì)物質(zhì)[24]。本研究中，疏水性亞組分的汞甲基化能力高于親水性亞組分，由此推測(cè)：水體DOM的疏水性亞組分是汞甲基化的主導(dǎo)原因，即DOM對(duì)汞甲基化的影響主要為疏水性亞組分對(duì)汞甲基化的影響。SWIETLIK等[18]研究：HON富含碳?xì)浠衔?、多?＞5)脂肪族醇、酯、酮和芳香結(jié)構(gòu)，具有比其他亞組分更加豐富的官能團(tuán)(如羥基、羰基和羧基等)，因此作為甲基化電子供體更為有效，促進(jìn)汞甲基化能力也更強(qiáng)。

3 結(jié)論

DOM的6種亞組分中，疏水性亞組分的汞甲基化能力高于親水性亞組分，其中以HOB為最，原因在于親水性亞組分易與游離態(tài)的Hg2+發(fā)生絡(luò)合，降低后者生物有效性；疏水性亞組分因表面官能團(tuán)更為豐富，不易與Hg2+絡(luò)合，更有利于Hg2+甲基化。隨著游離Hg2+的增加，甲基供體數(shù)量逐漸減少，甲基汞轉(zhuǎn)化率逐漸降低。

富營(yíng)養(yǎng)化藻類的DOM主要包含羥基、甲基、亞甲基、芳環(huán)C=C等官能團(tuán)，隨腐解時(shí)間延長(zhǎng)，這些基團(tuán)的簇度逐漸減少，使得不同腐解時(shí)期DOM各組分對(duì)汞的形態(tài)轉(zhuǎn)化呈現(xiàn)較大差異。

藻體腐解過程中，DOM的疏水性有機(jī)組分汞甲基化能力高于親水性有機(jī)組分；不同腐解時(shí)長(zhǎng)下釋放的相同亞組分，其汞甲基化效應(yīng)亦有所差異。