冬瓜離體再生體系的建立

李志芳 閆晉強(qiáng) 韓向峰 謝大森 劉文睿 伍倩慧 江 彪*

（1 佛山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東佛山 528145；2 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東廣州 510640）

冬瓜（Benincasa hispidaCogn.，2n=2x=24）是葫蘆科冬瓜屬一年生植物，廣泛分布于亞洲的熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，在我國栽培歷史悠久，是全國性重要蔬菜（謝大森 等，2020）。其營養(yǎng)豐富，富含多種維生素及膳食纖維，兼具藥用和保健功效，是健康的高鉀低鈉食品（張斌 等，2009）。由于耐貯運(yùn)性好、貨架期長，冬瓜已成為現(xiàn)代農(nóng)產(chǎn)品加工的理想原料和調(diào)節(jié)市場(chǎng)均衡供應(yīng)的主要蔬菜品種。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是一種非常重要的生物技術(shù)，在植物脫毒快繁、育種、資源保存以及遺傳轉(zhuǎn)化方面有著非常重要的理論和實(shí)踐意義（閆釗，2015）。近些年來，我國在西瓜、黃瓜和甜瓜等不同瓜類作物中分別利用子葉、子葉節(jié)、下胚軸、真葉等進(jìn)行了相關(guān)研究，獲得了再生植株，構(gòu)建了高效的再生體系（白婧 等，2008）。目前，基于植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因功能研究高度依賴于高效的植物再生體系。雖然冬瓜的基礎(chǔ)研究起步較晚，但也已完成了一些重要農(nóng)藝性狀，如果皮顏色（Jiang et al.，2015）和果實(shí)相關(guān)性狀（Liu et al.，2018）的基因定位工作。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展和冬瓜參考基因組的發(fā)布（Xie et al.，2019），將會(huì)大力推進(jìn)冬瓜基因功能研究。因此，構(gòu)建高效的冬瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系有著重要的實(shí)踐意義。

目前國內(nèi)外關(guān)于冬瓜再生的研究報(bào)道相對(duì)較少，只有趙芹等（2012）利用冬瓜子葉節(jié)為外植體，初步建立了冬瓜離體再生體系。但該體系存在著不定芽分化率低、不定芽不易伸長及分化畸形芽等問題，影響了現(xiàn)代生物技術(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化在冬瓜上的應(yīng)用。本試驗(yàn)以冬瓜子葉節(jié)為試材，通過不同激素配比研究篩選了愈傷誘導(dǎo)分化不定芽的培養(yǎng)基和芽增殖培養(yǎng)基等，建立了完整的組培再生體系，為冬瓜的遺傳轉(zhuǎn)化等研究提供了重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用冬瓜材料P131（粉皮冬瓜，單瓜質(zhì)量約2.5 kg）由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2019 年在佛山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所開展。組培培養(yǎng)條件為溫度（25 ± 2）℃，光照時(shí)間14 h，相對(duì)濕度70%，光照2 000 lx 左右。

1.2.1 無菌苗的培養(yǎng) 選取飽滿光滑的冬瓜種子120 粒，將種子浸入水中6 h 后，分別用75%酒精消毒40 s 和0.1%升汞消毒10 min，用自來水清洗4 次后將種子用紗布包住放入3 瓶已滅菌且裝有濕紗布的瓶中，放入人工氣候箱BIC-250，于32 ℃催芽2～3 d，待種子出芽后轉(zhuǎn)入MS 培養(yǎng)基中。

1.2.2 外植體的處理方法 待子葉長出后，取下胚軸直立、子葉脫離種殼未張開的無菌苗，切去上部2/3 子葉和1 mm 側(cè)邊緣，保留1/3 子葉和2 mm 下胚軸的子葉節(jié)作為轉(zhuǎn)化外植體。下胚軸縱切將子葉節(jié)均勻分成2 片，在靠近子葉節(jié)節(jié)點(diǎn)處用刀輕輕造成密集傷口。

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽的分化 將處理后的外植體平鋪于不同激素配比組合的1～9 號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，試驗(yàn)設(shè)計(jì)按照正交試驗(yàn)表L9（34）要求配制培養(yǎng)基（表1），觀察不同激素配比和暗培養(yǎng)天數(shù)對(duì)子葉節(jié)愈傷誘導(dǎo)及不定芽分化的影響。每個(gè)處理接6 瓶，3 次重復(fù)，每瓶接4 個(gè)子葉節(jié)材料，培養(yǎng)3～4 周后統(tǒng)計(jì)子葉上愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)的效率。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.4 再生芽的繼代擴(kuò)繁 切取誘導(dǎo)長出的再生芽，接入不同增殖培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1）、（MS+6-BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1）和（MS+6-BA 0.4 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1）上進(jìn)行繼代擴(kuò)繁，每處理接5瓶，3 次重復(fù)，每瓶接12 株，培養(yǎng)15 d 后調(diào)查其分化芽的比例及芽生長情況，增殖系數(shù)按照每個(gè)處理子葉節(jié)分化出的全部芽體數(shù)/全部的子葉節(jié)數(shù)計(jì)算。

1.2.5 再生苗的生根培養(yǎng) 將生長20 d 左右的不定芽切取約2 cm 高的莖尖，接種于生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1中誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)10～15 d 后調(diào)查生根情況。

1.2.6 再生植株的馴化與移栽 再生苗長到2.5～3.0 cm 高時(shí)移入馴化棚，閉瓶煉苗2～3 d，然后將瓶蓋打開繼續(xù)煉苗1～2 d。隨后將植株從瓶內(nèi)取出，洗凈根部粘著的培養(yǎng)基，在40%多菌靈可濕性粉劑1 000 倍液中消毒浸泡3～5 min，移栽至已滅菌的育苗土中。精細(xì)管理30 d 后，待植株長到8～10 cm 即可移入大田正常生長，30 d 后調(diào)查其馴化成活情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)不定芽分化的影響

子葉節(jié)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4 周后長出不定芽（圖1-A）。由表2 可見，9 個(gè)處理組合中處理8 和處理4 誘導(dǎo)出芽較多，誘導(dǎo)出芽率分別為41.000%和36.000%。由極差比較可知，暗培養(yǎng)天數(shù)和2，4-D 濃度為影響誘導(dǎo)不定芽再生的主要因子，其主次關(guān)系為暗培養(yǎng)天數(shù)＞2，4-D ＞IBA ＞6-BA；均值分析發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)天數(shù)中均值3 ＞均值1 ＞均值2，由此推斷暗培養(yǎng)7 d 為最優(yōu)水平；2，4-D 濃度中均值2 ＞均值3 ＞均值1，由此推斷2，4-D 濃度0.1 mg·L-1為最優(yōu)水平；同理確定IBA濃度0.10 mg·L-1為最優(yōu)水平；6-BA 濃度0.8 mg ·L-1為最優(yōu)水平；因此最佳組合配比為MS+2，4-D 0.1 mg·L-1+IBA 0.10 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1暗培養(yǎng)7 d。雖然處理4 和處理8 誘導(dǎo)出芽率較高，但整體上誘導(dǎo)出芽率偏低，需要適當(dāng)微調(diào)做進(jìn)一步篩選。

在誘導(dǎo)愈傷過程中，隨著2，4-D 和IBA 含量的增加，愈傷組織量也相應(yīng)增加，且從處理5 開始愈傷組織表現(xiàn)出由緊密向疏松轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)，愈傷組織上開始長根（表3）。

表2 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)不定芽分化的影響

2.2 不同增殖培養(yǎng)基對(duì)冬瓜再生芽繼代擴(kuò)繁的影響

由表4 可見，MS+NAA 0.05 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1的培養(yǎng)基中冬瓜再生芽平均增殖系數(shù)為2.487，多數(shù)芽基部有少量根長出，愈傷組織較少，芽簇生，生長健壯（圖1-B），平均高度1.8 cm；而MS+NAA 0.05 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基中的冬瓜再生芽平均增殖系數(shù)為1.610，多數(shù)芽長1～2 條根，材料基部約有直徑1 cm 大小的愈傷塊，植株無簇生芽，平均高度約3 cm；MS+NAA 0.05 mg·L-1+6-BA 0.4 mg·L-1培養(yǎng)基中的冬瓜再生芽平均增殖系數(shù)為2.327，芽多長在基部呈簇狀，長勢(shì)弱，有的芽葉片薄甚至不成形。綜合總體長勢(shì)和芽的健壯情況，認(rèn)為MS+NAA 0.05 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1的培養(yǎng)基為優(yōu)選繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)基。

表3 子葉節(jié)在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的再生表現(xiàn)

表4 不同增殖培養(yǎng)基對(duì)冬瓜再生芽繼代的影響

2.3 再生苗的生根培養(yǎng)

將高度約2 cm、有2 片葉展開的無菌苗，接種到生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1上，培養(yǎng)5 d 左右植株基部開始出現(xiàn)白色突起的根原基，葉片嫩綠長勢(shì)健壯，15 d 后苗高約4 cm 左右，生根率為100%，每株根條數(shù)為4 條左右（圖1-C）。

2.4 再生植株的馴化與移栽

將生根苗移入馴化棚，移栽之前不能打開瓶蓋，讓瓶苗逐步適應(yīng)棚內(nèi)環(huán)境，逐步加強(qiáng)光照，光照強(qiáng)度控制在3 000～5 000 lx，3～5 d 后根系長到3 cm 以上，并且有新葉長出時(shí)可以開瓶移栽。

移栽前先將0～5 mm 的泥炭土粉碎，再用40%多菌靈可濕性粉劑500 倍液對(duì)泥炭土進(jìn)行消毒，然后將消毒好的泥炭土裝入32 孔穴盤備用；移栽時(shí)打開瓶蓋，將組培苗輕輕拔出放入40%多菌靈可濕性粉劑1 000 倍液中浸泡3～5 min 消毒，然后撈出栽到穴盤中，澆透水。將穴盤放到床架上進(jìn)行組培苗馴化，30 d 后，苗高基本達(dá)到8～10 cm，葉片濃綠，4～5 片真葉，根莖基部粗度達(dá)到3 mm 左右，移栽成活率達(dá)80%以上（圖1-D），這時(shí)可以移入大田進(jìn)行正常的水肥管理。

3 討論與結(jié)論

前人成功建立了黃瓜（馮嘉玥 等，2008；李富童和程智慧，2020）、甜瓜（付秋實(shí) 等，2014）、南瓜（郭佳 等，2019）和絲瓜（黃麗芳 等，2019）等葫蘆科作物的離體再生體系，尤以黃瓜研究較多。影響黃瓜離體再生的因素主要包括基因型、外植體類型、激素類型和激素配比等（唐莉 等，2017）。然而目前在冬瓜中，只有趙芹等（2012）利用子葉節(jié)初步建立了冬瓜離體再生體系，不同基因型在MS+6-BA 4.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1分化培養(yǎng)基上不定芽誘導(dǎo)率較高，最高達(dá)79.2%；但其不定芽存在不易伸長及分化畸形芽等問題，導(dǎo)致整體再生率較低。

本試驗(yàn)在綜合分析葫蘆科不同作物再生體系的基礎(chǔ)上，分析了再生體系各階段不同處理對(duì)冬瓜再生效率的影響。筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)冬瓜種子在消毒后催芽的過程中，因組培條件下催芽不同于大田狀態(tài)下的常規(guī)催芽處理，導(dǎo)致種子萌發(fā)不整齊，萌芽率不一致等現(xiàn)象，影響了發(fā)芽勢(shì)。通過分析2，4-D、IBA 和6-BA 不同激素處理和暗培養(yǎng)對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)天數(shù)和2，4-D 濃度為影響誘導(dǎo)不定芽再生的主要因子。暗培養(yǎng)處理有利于黃瓜子葉節(jié)的分化再生，可能是因?yàn)榘蹬囵B(yǎng)條件下植物體內(nèi)某些酶的合成發(fā)生了變化（王燁 等，2011；馮琴 等，2019）。在不定芽誘導(dǎo)初期，適宜濃度的2，4-D可以有效促進(jìn)生長狀態(tài)良好的胚狀愈傷組織的形成（馮琴 等，2019）。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，誘導(dǎo)不定芽分化的最優(yōu)配比組合為MS+2，4-D 0.1 mg·L-1+IBA 0.10 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1暗培養(yǎng)7 d，沒有出現(xiàn)在本試驗(yàn)的處理中，后續(xù)將進(jìn)一步開展試驗(yàn)驗(yàn)證。此外，本試驗(yàn)還分析了不同濃度激素組合對(duì)冬瓜再生芽繼代擴(kuò)繁的影響，建立了高效的無菌苗生根體系和馴化、移栽體系。

綜上，本試驗(yàn)建立了完整的冬瓜子葉節(jié)再生體系：以MS 培養(yǎng)基為冬瓜無菌種子的萌發(fā)培養(yǎng)基，1/3 子葉和2 mm 下胚軸的子葉節(jié)為轉(zhuǎn)化外植體，在MS+2，4-D 0.1 mg·L-1+IBA 0.10 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)7 d 誘導(dǎo)再生芽，在MS+NAA 0.05 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1培養(yǎng)基上繼代擴(kuò)繁，在生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1中生根后完成馴化移栽。冬瓜再生體系的建立為冬瓜遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了技術(shù)支持，為進(jìn)行基于遺傳轉(zhuǎn)化的冬瓜基因功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。