中華草龜胚胎發(fā)育過程中鈣含量的變化

梁陽陽 崔凱 李靜

摘要 [目的]研究中華草龜胚胎發(fā)育過程中鈣的來源和代謝規(guī)律。[方法]采集了中華草龜受精卵200枚，恒溫箱中30 ℃孵化，檢測胚胎發(fā)育過程中卵各組分中鈣含量的變化。[結(jié)果]中華草龜孵化期52～65 d，平均57.2 d。孵化的前25 d胚胎鈣含量較低，蛋黃、蛋清和蛋殼內(nèi)鈣含量無明顯變化，第30天開始胚胎鈣含量迅速增加，蛋清中鈣含量迅速減少，直至被吸收殆盡;蛋黃中鈣第30～35天不斷減少，第40天有所增加，此后不斷減少至出殼時吸收殆盡。第40天開始，蛋殼內(nèi)含物總鈣含量顯著增加，蛋殼中鈣含量降低，表明蛋殼開始成為胚胎發(fā)育的主要鈣源。整個孵化期，蛋黃、蛋清和蛋殼為胚胎發(fā)育分別提供了9.6%、24.9%和65.5%的鈣。[結(jié)論]蛋殼是中華草龜胚胎發(fā)育過程中的主要鈣源。該研究是對中華草龜胚胎發(fā)育過程中受精卵各組分鈣含量變化的首次報道。

關(guān)鍵詞 中華草龜;胚胎發(fā)育;孵化;鈣代謝

Abstract [Objective]To study the sources and metabolic pattern of calcium in Chinemys reevesiis during the embryonic development process.[Method]200 fertilized eggs of C.reevesiis were collected and incubated in a thermostat at 30 ℃.The changes of calcium content in each component of egg during the embryonic development process were detected.[Result]The incubation period of C.reevesiis was from 52 days to 65 days，with the average of 57.2 days.The calcium content in the embryo was lower during the first 25 days，while calcium content in the yolk，albumen and eggshell had no significant change during the first 25 days.From the 30th day，calcium content in the embryo began to increase rapidly，while calcium content in the albumen began to decrease rapidly until it was completely absorbed.The calcium content in the yolk decreased continuously from the 30th day to the 35th day of incubation，and increased on the 40th day，and then began to decrease rapidly until it was completely absorbed at the end of incubation.From the 40th day，the calcium in egg contents （yolk and albumen） increased significantly and that in the eggshell decreased，indicating eggshell began to become the main source of calcium during the embryonic development process.During the whole incubation period，yolk，albumen and eggshell provided 9.6%，24.9% and 65.5% calcium respectively for the embryonic development.[Conclusion]Eggshell was the main source of calcium during the embryo development of C.reevesiis.This study provided the variation of calcium content in each component of C.reevesiis eggs during the embryonic development process for the first time.

Key words Chinemys reevesiis;Embryonic development;Incubation;Calcium metabolism

脊椎動物的卵有復(fù)雜的物理結(jié)構(gòu)和化學組成，為胚胎發(fā)育提供穩(wěn)定的環(huán)境和充足的營養(yǎng)物質(zhì)。卵內(nèi)營養(yǎng)元素種類多，部分營養(yǎng)元素并不是胚胎發(fā)育所必需的，而有些元素的含量并不能滿足胚胎發(fā)育的需要，需要外源輸入，胚胎發(fā)育過程中不同營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程是胚胎學研究的重點問題之一[1]。鈣是脊椎動物胚胎發(fā)育過程中需求量最高的礦物元素之一，參與多個生物感受過程，對胚胎的健康發(fā)育至關(guān)重要，是胚胎學研究中最關(guān)注的營養(yǎng)元素之一[2-3]。在卵生脊椎動物中，胚胎發(fā)育過程中需要大量的鈣，卵內(nèi)鈣含量常常不能滿足胚胎發(fā)育的全部需要，卵殼是胚胎發(fā)育重要的鈣等營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源[1]。爬行動物出殼時通常體被鈣化鱗片（蛇類、鱷類等、蜥蜴類）或骨板（龜鱉類），胚胎發(fā)育過程中鈣的需求量大，其鈣代謝非常具有代表性。

中華草龜 （Chinemys reevesiis），又名烏龜、金龜、泥龜?shù)?，隸屬于龜鱉目（Testudinate）龜科（Emydidae）烏龜屬（Chinemys），在我國除東北和西部地區(qū)外均有分布，是我國現(xiàn)存龜類中分布最廣、養(yǎng)殖數(shù)量最多的品種之一[4]。龜類在出殼時已經(jīng)形成高度鈣化的胸甲、腹甲外殼和內(nèi)骨骼，胚胎發(fā)育過程中對鈣的需求量很大。最新研究表明，龜類胚胎發(fā)育過程中，性腺體細胞內(nèi)鈣離子水平的高低對性別決定基因Dmrt1表達具有決定性作用，進而影響性別分化[5]。目前，關(guān)于龜類胚胎發(fā)育過程中鈣代謝的研究較少。由文輝等[6]研究了中華草龜胚胎鈣的來源，但關(guān)于中華草龜孵化過程中鈣的轉(zhuǎn)化規(guī)律未見報道。筆者通過對孵化期間中華草龜受精卵蛋黃、蛋白、蛋殼和胚胎中鈣含量的連續(xù)測定，首次探究了各組分中鈣含量的變化規(guī)律，旨在為中華草龜?shù)姆敝成飳W提供新資料，為爬行類動物胚胎發(fā)育機理及其對營養(yǎng)物質(zhì)的利用等方面研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

中華草龜卵于2019年6月采自安徽藍田農(nóng)業(yè)集團有限公司中華草龜產(chǎn)卵場，以卵中部乳白色受精斑作為正常受精判別特征，采集形狀相似、大小均一的受精卵200枚帶回實驗室孵化，單枚卵重6.67～7.92 g，平均卵重7.43 g。

1.2 室內(nèi)孵化

以蛭石為孵化基質(zhì)，蛭石與水的質(zhì)量比為1∶1，鋪在塑料孵化盒中，將受精卵白斑朝上，埋入蛭石中2 cm，置于恒溫培養(yǎng)箱中孵化。孵化溫度設(shè)置為30 ℃，每天定時稱量孵化盒總質(zhì)量，用噴壺灑水補充孵化損失水分。

1.3 測量取樣 自孵化第0天（剛孵化時）開始，每5 d取樣，直至幼體破殼，每次取10枚正常發(fā)育卵，低溫致死，分離蛋黃、蛋清、胚胎、蛋殼（含殼膜），使用分析天平稱重（精確至0.1 mg），拍照，為了方便檢測，每2枚卵混合為一個樣本，塑料瓶冷凍保存。 超純水沖洗卵殼內(nèi)表面，吸水紙吸干，沖洗液放入卵清中，烘箱中80 ℃烘干備用。第0～15天胚胎太小，無法單獨測量鈣含量，將其鈣納入卵清中測量，第20天開始單獨測量胚胎鈣含量;第55天，很多樣本已破殼，挑取破卵樣本檢測。

1.4 鈣含量測定

樣品在干燥箱中80 ℃烘干至恒重，研磨成粉，稱取固體試樣于帶刻度消化管中，加入 10 mL 硝酸和0.5 mL 高氯酸，電熱爐上消解，消化液呈棕褐色，加數(shù)滴硝酸，冷卻后溶液呈無色透明或略帶黃色后，移至50 mL容量瓶中，去離子水洗滌消化管3次，洗液收集于容量瓶中，加去離子水定容至50 mL，采用火焰原子吸收光譜法對溶液中鈣離子濃度進行測定。測定儀器參數(shù)設(shè)置如下：測定波長422.7 nm，狹縫寬1.3 nm，燈電流10 mA，燃燒器高度7 mm，空氣流量9 L/min，燃氣（乙炔）流量2 L/min[7]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用 Execl 2010 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析，使用Origin 8.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華草龜胚胎發(fā)育的鈣來源

200枚卵中，孵化過程中死亡受精卵47枚，死亡率23.5%，試驗用卵110枚，共孵化出幼龜43個，試驗孵化期52～65 d，平均孵化期57.2 d。孵化前，整個卵的平均鈣含量330.77 mg/枚，其中卵殼鈣含量324.11 mg/枚，占卵總鈣含量的98.0%;卵內(nèi)含物中蛋黃中鈣含量4.81 mg/枚、蛋清中鈣含量1.85 mg/枚。臨出殼時，蛋殼平均鈣含量253.03 mg/枚，較孵化前減少71.08 mg/枚;蛋黃和蛋清幾乎完全吸收，稚龜鈣含量19.3 mg/枚，較孵化前卵內(nèi)總鈣含量增加12.64 mg/枚，表明中華草龜胚胎發(fā)育過程中卵黃和卵清提供34.5%的鈣，其余65.5%的鈣卵殼提供，占卵殼孵化期鈣損失的17.8%，卵殼是胚胎發(fā)育過程中主要鈣源（圖1）。

2.2 孵化過程中卵內(nèi)各組分鈣含量的變化

在孵化的前25 d，胚胎鈣含量較低，蛋黃、蛋清和蛋殼中鈣的含量無明顯變化（圖1），此時胚胎逐漸發(fā)育出清晰的背甲，通體呈乳白色半透明（圖2）; 30 d時，胚胎顏色加深，腹甲清晰可見，背甲肋骨清晰可數(shù)，鈣含量進一步增加，蛋黃和蛋清中鈣含量分別減少13.2%和19.6%，與25 d時差異顯著（P<0.05），蛋黃和蛋清中鈣含量開始快速減少，蛋殼中鈣含量未發(fā)生顯著變化;40 d時，胚胎由乳白色變成灰色，背甲和腹甲明顯開始鈣化，硬度增強，胚胎體型和鈣含量均進入快速增長階段（圖3），卵內(nèi)總鈣含量顯著增加，蛋殼開始變薄，鈣含量較孵化初期顯著減少（P<0.05），蛋殼開始成為胚胎發(fā)育的主要鈣來源，蛋黃中鈣含量出現(xiàn)增加，表明蛋黃開始富集蛋殼中的鈣，同時卵開始吸收環(huán)境中的水膨大;45 d時，卵吸水達最重，卵殼鈣質(zhì)層產(chǎn)生細絲狀裂紋，胚胎進一步鈣化，蛋清較稀，鈣含量急劇減少，蛋黃中鈣含量也減少;55 d時，大部分卵開始或即將破殼，稚龜形成，背甲、腹甲及身體內(nèi)骨骼高度鈣化，卵殼與卵膜全部或部分分離，尿囊干癟，卵黃囊吸收殆盡縮入腹腔，或少部分存留體外，在孵化后2～3 d內(nèi)縮入腹腔，未吸收的卵黃未單獨測定鈣含量，納入胚胎中。

整體來看，孵化的前25 d，卵各組分中鈣含量變化較小，30 d 開始胚胎進入快速生長階段，鈣含量迅速增加，蛋清和蛋黃中鈣開始顯著減少。此后，蛋清中鈣不斷減少，直至50 d 時吸收殆盡，而蛋黃中鈣含量在40 d時出現(xiàn)上升，此后不斷減少，直至出殼時被吸收殆盡;從40 d開始胚胎鈣化，蛋殼成為胚胎發(fā)育的主要鈣源。

3 結(jié)論與討論

卵生脊椎動物孵化過程中，胚胎對物質(zhì)和能量的利用在不同物種間存在顯著差異[1]。有鱗爬行類中，胚胎發(fā)育所需的鈣通常主要由蛋黃和蛋清提供，蛋殼僅提供了10%～40%[8-9];在龜鱉類和鱷類中，胚胎發(fā)育所需的鈣則主要由卵殼提供，占50%～80%[1，10-11]，在鳥類中，蛋殼提供的鈣可達89%[12]。該研究中中華草龜胚胎發(fā)育所需的鈣65.5%由蛋殼提供，34.5%由蛋黃和蛋清提供，蛋殼是胚胎發(fā)育主要的鈣源。該研究中胚胎發(fā)育中鈣的來源蛋與由文輝等[6]、鄭榮泉等[13]關(guān)于中華草龜?shù)难芯拷Y(jié)果較為一致，蛋殼對胚胎發(fā)育鈣的貢獻與鱷龜（56%）、太平洋麗龜（60%）較為接近[1，14]，低于棱皮龜（75%）[15]。胚胎發(fā)育中鈣吸收還受到孵化溫度等環(huán)境因素的影響，適宜的孵化溫度（27～30 ℃）可以提高中華草龜胚胎能量利用效率，促進鈣等礦物元素的吸收，過高或過低的孵化溫度都不利于胚胎發(fā)育過程中鈣的吸收[13，15]。

在中華草龜胚胎發(fā)育過程中，蛋清、蛋黃和蛋殼為胚胎提供鈣的數(shù)量和時間不同。孵化中前期，胚胎中鈣含量較低，蛋清、蛋黃及蛋殼中鈣含量的變化較小。Cherille等[16]向發(fā)育初期的火雞蛋中注射45Ca進行放射性分析，證實在胚胎發(fā)育前半階段蛋黃是胚胎發(fā)育的主要鈣源。孵化中后期，胚胎增長迅速，龜背和龜甲等組織開始鈣化，胚胎鈣含量呈指數(shù)增加，蛋清和蛋黃中的鈣快速下降，但蛋清和蛋黃中鈣的減少量遠小于胚胎中鈣的增加量，表明蛋殼成為胚胎發(fā)育的主要鈣源。孵化的中后期，蛋清中的鈣迅速下降，直至消失殆盡，而蛋黃中鈣下降則相對緩慢，還出現(xiàn)過明顯的增加，可能是因為蛋黃具有富集鈣的功能，能夠富集尿囊絨膜從蛋殼中轉(zhuǎn)運來的鈣，供胚胎發(fā)育。蛋黃對鈣的富集作用在鵪鶉[17]、棱皮龜[15]等動物中均有報道。

龜鱉類胚胎發(fā)育過程中對蛋殼中鈣的吸收，除了補充自身所需鈣外，還會降低蛋殼中鈣含量，改變碳酸鈣晶體結(jié)構(gòu)，促使蛋殼變薄、脆性增大、蛋殼殼單位間之間空隙增大，易與殼膜分離，有利于稚龜?shù)某鰵18]。Cox等[19]認為，除了胚胎吸收之外，孵化介質(zhì)中水分與空氣中的CO2相互作用對蛋殼中鈣的浸出和微生物分解等外界因素造成蛋殼中鈣的流失，也對孵化期蛋殼結(jié)構(gòu)的變化也起到重要作用。該研究中中華草龜孵化前、后蛋殼中鈣減少21.9%，其中僅有17.8%為胚胎發(fā)育所吸收，低于由文輝等[6]的研究結(jié)果（42.1%）。蛋殼中未被吸收的鈣，可能是孵化期間與空氣中CO2及水的相互作用或與孵化盤中的酸相互作用而從殼中浸出而流失[12]。Bilinski等[20]對比了棱皮龜正常發(fā)育的受精卵和未受精的卵在經(jīng)歷孵化周期后卵殼鈣含量變化，發(fā)現(xiàn)正常發(fā)育龜卵的卵殼鈣減少42.9%，而未受精的龜卵的蛋殼中鈣也減少了25.7%，孵化溫度、濕度等環(huán)境條件均會影響孵化過程中鈣的損失率。

綜上所述，中華草龜胚胎發(fā)育過程中的鈣由蛋殼、蛋黃和蛋清共同提供。發(fā)育中前期，胚胎中鈣增長較慢，主要由蛋黃和蛋清提供鈣;發(fā)育中后期，胚胎開始鈣化，鈣需求量迅速增加，蛋殼成為胚胎發(fā)育的主要鈣源，這一階段蛋黃有富集蛋殼鈣的功能。孵化期間蛋黃和蛋清中的鈣全部被胚胎吸收，占胚胎總鈣含量的34.5%，其余由蛋殼提供，蛋殼中減少的鈣僅少部分被胚胎發(fā)育吸收，大部分流失。

參考文獻

[1]SAHOO G，SAHOO R K，MOHANTY-HEJMADI P.Calcium metabolism in olive ridley turtle eggs during embryonic development[J].Comp Biochem Physiol Part A，1998，121（1）：91-97.

[2]AL-BAHRY S N，MAHMOUD I Y，AL-AMRI I S，et al.Ultrastructural features and elemental distribution in eggshell during pre and post hatching periods in the green turtle，Chelonia mydas at Ras Al-Hadd，Oman[J].Tissue Cell，2009，41（3）：214-221.

[3]OROWSKI G，HAUPKA L，POKORNY P，et al.The effect of embryonic development on metal and calcium content in eggs and eggshells in a small passerine[J].IBIS，2016，158（1）：144-154.

[4]朱學峰.廣西中華草龜遺傳多樣性的RAPD分析[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2011，42（9）：1148-1150.

[5]WEBER C，ZHOU Y J，LEE J G，et al.Temperature-dependent sex determination is mediated by pSTAT3 repression of Kdm6b[J].Science，2020，368（6488）：303-306.

[6]由文輝，王培潮.烏龜胚胎發(fā)育過程中鈣，鎂代謝的研究[J].動物學雜志，1994，29（4）：20-22.

[7]梁藝馨，劉康書，蔡秋，等.連續(xù)光源火焰原子吸收光譜法同時測定藍莓中Ca、Mg、Fe、Zn含量[J].食品科學，2015，36（20）：135-138.

[8]JENKINS N K，SIMKISS K.The calcium and phosphate metabolism of reproducing reptiles with particular reference to the adder （Vipera berus）[J].Comp Biochem Physiol，1968，26（3）：865-876.

[9]PACKARD M Y，PACKARD G C，MILLER J D，et al.Calcium mobilization，water balance，and growth in embryos of the agamid lizard Amphibolurus barbatus[J].J Exp Zool，1985，235（3）：349-357.

[10]JENKINS N K.Chemical compositions of the eggs of the crocodile （Crocodylus novaeguineae）[J].Comp Biochem Physiol A，1975，51（4）：891-895.

[11]PACKARD M J，PACKARD G C.Sources of calcium，magnesium，and phosphorus for embryonic softshell turtles （Trionyx spiniferus）[J].J Exp Zool，1991，258（2）：151-157.

[12]呂秀芬，高景芝，李春林.雞胚胎發(fā)育過程中鈣，鎂含量的變化[J].首都師范大學學報（自然科學版），1999，20（3）：66-68.

[13]鄭榮泉，杜衛(wèi)國，張永普，等.孵化溫度對烏龜胚胎能量利用及礦物質(zhì)代謝的影響[J].動物學報，2006，52（1）：21-27.

[14]PACKARD M J，SHORT T M，PACKARD G C，et al.Sources of calcium for embryonic development in eggs of the snapping turtle Chelydra serpentina[J].J Exp Zool，1984，230（1）：81-87.

[15]BILINSKI J J，REINA R D，SPOTILA J R，et al.The effects of nest environment on calcium mobilization by leatherback turtle embryos （Dermochelys coriacea） during development[J].Comp Biochem Physiol Part A，2001，130（1）：151-162.

[16]CHERILLE N，王春霞.火雞胚胎發(fā)育后期及出雛后卵黃囊中鈣含量的變化[J].國外畜牧科技，1992，19（4）：6-7.

[17]鄒發(fā)生，陳云霜，王培潮.鵪鶉胚胎發(fā)育過程中蛋內(nèi)鈣、鎂含量的變化[J].動物學報，1996，42（3）：334-336.

[18]由文輝，王培潮，華燕.烏龜卵殼結(jié)構(gòu)的研究[J].華東師范大學學報（自然科學版），1993（2）：99-105.

[19]COX D L，KOOB T J，MECHAM R P，et al.External incubation alters the composition of squamate eggshells[J].Comp Biochem Physiol Part B，1984，79（3）：481-487.

[20]BILINSKI J J，REINA R D，SPOTILA J R，et al.The effects of nest environment on calcium mobilization by leatherback turtle embryos （Dermochelys coriacea） during development[J].Comp Biochem Physiol Part A，2001，130（1）：151-162.