常見(jiàn)金屬離子對(duì)過(guò)氧化氫酶生物合成的影響

馮偉 馮雅琪 徐晶雪

摘 要：過(guò)氧化氫酶是生物體內(nèi)的一種末端氧化酶，可以減輕甚至清除過(guò)氧化氫在體內(nèi)聚積對(duì)機(jī)體造成的損傷，調(diào)控過(guò)氧化氫酶的生物合成對(duì)機(jī)體具有十分重要的意義。通過(guò)在黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中分別加入不同的金屬離子，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行細(xì)胞破壁，提取過(guò)氧化氫酶，檢測(cè)不同金屬離子對(duì)過(guò)氧化氫酶活力的影響。結(jié)果表明：在發(fā)酵培養(yǎng)的24h階段，增加CaCO3添加量，同時(shí)減少M(fèi)g2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Cl-、PO43-+等離子的含量，既可提高菌體的生長(zhǎng)速度，又可提高過(guò)氧化氫酶的產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞：過(guò)氧化氫酶;金屬離子;生物合成;影響

中圖分類號(hào) Q558文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）06-0019-03

Effect of Common Metal Ions on Catalase Biosynthesis

FENG Wei1 et al.

（1 Daqing Normal University，Daqing 163712，China）

Abstract： Catalase is a terminal oxidase in organisms， which can reduce or even remove the damage caused by the accumulation of hydrogen peroxide in the body. It is of great significance to regulate the biosynthesis of catalase. This experiment is through in the training process of aspergillus Niger fermentation joined the different metal ions， respectively， at the end of the training， make the cell wall-breaking， extraction of catalase， detection of different metal ions on the influence of hydrogen peroxide enzyme activity， the results show that in the training for 24 h of fermentation by increasing CaCO3 content at the same time reduce the Mg2+，Zn2+，Mn2+，K+，Na+，Cl-and PO43-，the level of plasma， can increase the speed of the growth of bacteria and increase production of catalase.

Key words： Catalase;Metal ions;Biosynthesis;Effect

過(guò)氧化氫酶（CAT）是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，能催化細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫分解，防止過(guò)氧化物的形成，從而使細(xì)胞免于遭受過(guò)氧化氫的毒害。在人體正常生理?xiàng)l件下，過(guò)氧化氫酶可催化過(guò)氧化氫的快速分解，使H2O2失去活性氧的作用，且效果十分顯著。過(guò)氧化氫酶還被廣泛應(yīng)用于面包和飲料的生產(chǎn)中，因其能分解H2O2產(chǎn)生O2和H2O的性質(zhì)，可將過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化氫共同作為烘烤食品的膨脹劑。過(guò)氧化氫酶在對(duì)牛奶飲料等的消毒上應(yīng)用更為廣泛。研究表明，利用過(guò)氧化氫酶降解工業(yè)廢水中過(guò)氧化氫，不僅可以避免對(duì)環(huán)境造成二次污染，同時(shí)對(duì)芳香和脂肪烴化合物進(jìn)行降解也相當(dāng)有效。過(guò)氧化氫酶價(jià)格低廉且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，已在很多含酚廢水的污水處理中得到廣泛應(yīng)用。在紡織生產(chǎn)過(guò)程中，過(guò)氧化氫酶還可快速安全地清除H2O2，既減少了染色布磨損，又有利于保護(hù)環(huán)境。過(guò)氧化氫酶還被廣泛應(yīng)用于工業(yè)酶催化中，降低工業(yè)酶催化過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物的積累或酶發(fā)生降解等不良影響。Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等是人體必需的生命元素，研究這些離子對(duì)過(guò)氧化氫酶穩(wěn)定性和酶活性的干擾具有生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義。為此，筆者利用黑曲霉在不同離子作用的條件下發(fā)酵產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，測(cè)定酶活力，探討不同離子對(duì)過(guò)氧化氫酶生物合成的影響，以期通過(guò)控制離子含量來(lái)提高過(guò)氧化氫酶活性，進(jìn)而降低過(guò)氧化氫對(duì)機(jī)體造成的損害。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基制備 霉菌分離培養(yǎng)基（馬丁氏培養(yǎng)基）：K2HPO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂15～20g、水1000mL、1%孟加拉紅水溶液3.3mL，無(wú)菌操作時(shí)加1%的鏈霉素使其終濃度為30μg/mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：5% 葡萄糖、0.012% MgSO4、0.2% KCl、0.015% KH2PO4、0.06% NH4H2PO4、0.2%蛋白胨、0.3%牛肉膏。

1.2 菌種篩選 取適量土樣置于裝有無(wú)菌水的錐形瓶中攪拌，使采集的泥土分散成均勻的土壤懸液，將涂布好樣品的平板放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度28℃，倒置培養(yǎng)2～3d。

1.3 菌種發(fā)酵培養(yǎng) 接種篩選出的黑曲霉純培養(yǎng)物的種子液，30℃條件下?lián)u床，轉(zhuǎn)速為160rpm。將得到的種子液接種于含15%葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)液，接種量為10%（w/w），溫度32℃，pH自然，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間48h。

1.4 過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定 對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾，離心后用緩沖液清洗沉淀，得到菌體細(xì)胞;將所得細(xì)胞用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破壁，細(xì)胞破碎儀功率為80W，超聲3s，共操作180～200次，每次間隔3s;細(xì)胞破壁工作結(jié)束后進(jìn)行離心操作，4000rpm/min，持續(xù)10min，取上層液體作為酶液，用紫外分光光度法測(cè)定其酶活力。酶活力的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取6只小試管并分別編號(hào)，按表1所示依次加入對(duì)應(yīng)試劑，然后振蕩試管搖勻，在350nm處以0號(hào)管調(diào)零，繼而分別測(cè)定另外5只試管的吸光度。樣品檢測(cè)：依次加入1.5mL緩沖溶液、0.1mL酶提取液、1.2mL蒸餾水，然后加入0.2mL過(guò)氧化氫溶液，立刻計(jì)時(shí)4min后加入1mL硫酸終止反應(yīng)，測(cè)定350nm吸收值。分別測(cè)定幾種金屬離子存在的條件下，黑曲霉培養(yǎng)24h及48h產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的活力，計(jì)算方法如下：

[E=aAK-AS+bwt×250.1] （1）

式中：AK為對(duì)照樣吸光度;AS為樣品吸光度;wt為反應(yīng)時(shí)間;a、b為標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)。

1.5 菌體干重測(cè)定 取10mL發(fā)酵液，放在烘干且達(dá)到衡重的濾紙上進(jìn)行過(guò)濾，為使不溶的碳酸鹽溶解，加入2mol/L HCL使其轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇艿穆然}，然后用蒸餾水沖洗。將收集的濾液用細(xì)菌濾器再過(guò)濾，最后將吸附有菌體的過(guò)濾器在烘箱（100℃）內(nèi)干燥4h稱重。分別測(cè)定幾種金屬離子存在的條件下，培養(yǎng)24h及48h的黑曲霉菌體重量。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧化氫酶標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=1.215x+0.0311，截距（a）為0.0311，斜率（b）為1.215，相關(guān)系數(shù)R2=0.9916。

2.2 不同金屬離子對(duì)菌體生長(zhǎng)和條件以及過(guò)氧化氫酶的影響

2.2.1 pH 由圖2可知，培養(yǎng)液中添加了CaCO3能夠明顯抑制培養(yǎng)基pH下降，添加其他離子的培養(yǎng)液pH也較對(duì)照略高，但抑制pH下降的功能不明顯。

2.2.2 菌體干重 由圖3可知，除CaCO3以外，其他金屬離子在培養(yǎng)24h后對(duì)菌體生長(zhǎng)都具有一定的抑制作用，培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到48h后，Cl-、PO43-菌體生長(zhǎng)具有小幅促進(jìn)作用，雖然加入了Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+的培養(yǎng)基中菌體干重依然低于對(duì)照，但高于同條件下培養(yǎng)24h的菌體干重，說(shuō)明Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+對(duì)菌體生長(zhǎng)依然有抑制作用;而CaCO3在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)菌體生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用，加入了CaCO3培養(yǎng)48h后的菌體干重達(dá)到22.8mg/mL，這與CaCO3能夠抑制pH下降相關(guān)。

2.2.3 過(guò)氧化氫酶活力 由圖4可知，培養(yǎng)24h后，對(duì)照過(guò)氧化氫酶活力為32.4IU，而加入了CaCO3培養(yǎng)24h后的過(guò)氧化氫酶活力為112.9IU，明顯高于對(duì)照。由此可見(jiàn)，CaCO3對(duì)菌體生長(zhǎng)及過(guò)氧化氫酶的酶活力提高均具有明顯的促進(jìn)作用。除了加入ZnCO3的培養(yǎng)基外，其余金屬離子培養(yǎng)液中過(guò)氧化氫酶活力都高于對(duì)照，說(shuō)明Zn2+對(duì)過(guò)氧化氫酶活力具有最明顯的抑制作用。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明：CaCO3對(duì)黑曲霉菌體生長(zhǎng)及過(guò)氧化氫酶的合成具有促進(jìn)作用。培養(yǎng)24h時(shí)，Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Cl-、PO43-對(duì)黑曲霉菌菌體生長(zhǎng)及過(guò)氧化氫酶的生物合成具有抑制作用;培養(yǎng)48h時(shí)，只有Zn2+對(duì)黑曲霉菌菌體生長(zhǎng)及過(guò)氧化氫酶的合成均具有抑制作用。因此，發(fā)酵工業(yè)上，在發(fā)酵培養(yǎng)的24h階段，可以通過(guò)控制CaCO3加入來(lái)提高菌體的生長(zhǎng)速度及過(guò)氧化氫酶的活力，同時(shí)要避免Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Cl-、PO43-等離子的產(chǎn)生;在發(fā)酵培養(yǎng)的48h期間，要避免Zn2+的產(chǎn)生，可以有效減輕過(guò)氧化氫對(duì)發(fā)酵的危害，使菌體保持較快的生長(zhǎng)速度，也可使過(guò)氧化氫酶的活力達(dá)到較高水平。

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（責(zé)編：徐世紅）