COVID-19恢復(fù)期晚期妊娠與未妊娠患者免疫功能的差異分析

金志珊，吳江華，馮地路，夏 霖，張青苗，汪宏波

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 a.婦產(chǎn)科;b.血液內(nèi)科，武漢 430022)

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染而引起的急性呼吸道傳染病，在我國屬于乙類傳染病，甲類管理，于2020年3月11日由WHO定義為疫情全球大流行。COVID-19為突發(fā)新型冠狀病毒，對(duì)其流行病學(xué)的了解不夠詳細(xì)，現(xiàn)全球疫情肆虐，迫切需要COVID-19年齡及性別流行病學(xué)相關(guān)研究[1]。目前年輕女性及妊娠女性的流行病學(xué)數(shù)據(jù)尚無明確報(bào)道，其免疫狀態(tài)尚不清楚。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道[2-3]及華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院收治的26例COVID-19孕婦的預(yù)后分析，COVID-19孕婦均以輕型、普通型居多，重癥病例少見，危重及死亡未見相關(guān)報(bào)道[4]，且孕產(chǎn)婦預(yù)后良好。但是，同齡COVID-19感染的未妊娠女性有死亡的相關(guān)報(bào)道。女性在妊娠狀態(tài)下，其免疫狀態(tài)不同，感染SARS-CoV-2后的反應(yīng)及預(yù)后亦不同，其免疫功能的變化對(duì)COVID-19的治療可能有重要意義。本研究通過檢測COVID-19感染恢復(fù)期的晚期妊娠患者與未妊娠患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子變化，初步探討了解COVID-19感染合并晚期妊娠患者免疫狀況的變化規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月30日至4月10日華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院收治的晚期妊娠合并COVID-19感染并成功分娩的患者18例，年齡24～40歲，平均(29.67±4.80)歲;選取同年齡段合并COVID-19感染的未妊娠女性17例，年齡24～41歲，平均(31.2±7.08)歲。兩組患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：合并既往血液系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤疾病;3個(gè)月內(nèi)使用過可使血細(xì)胞形態(tài)明顯改變藥物。

1.2 相關(guān)定義 核酸檢測轉(zhuǎn)陰時(shí)間：患者從發(fā)病開始到檢測到第一次核酸轉(zhuǎn)陰天數(shù)(核酸轉(zhuǎn)陰患者至少在本病區(qū)核酸檢測2次均為陰性，回顧第一次核酸檢測呈陰性時(shí)間，如患者入院后核酸已為陰性，無法明確轉(zhuǎn)陰時(shí)間，則去除該病例入組核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的統(tǒng)計(jì))。住院天數(shù)：住院當(dāng)天開始，根據(jù)我國診療指南達(dá)到出院標(biāo)準(zhǔn)出院當(dāng)天為止，且全部晚期妊娠患者均生產(chǎn)后恢復(fù)出院?；謴?fù)期：根據(jù)2020年3月3日國家衛(wèi)生健康委辦公廳發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》試行第7版，患者達(dá)到出院標(biāo)準(zhǔn)：(1)體溫恢復(fù)正常3天以上;(2)呼吸道癥狀明顯好轉(zhuǎn);(3)肺部影像學(xué)顯示急性滲出性病變明顯改善;(4)連續(xù)兩次痰、鼻咽拭子等呼吸道標(biāo)本核酸檢測陰性(采樣時(shí)間至少間隔24h)。實(shí)驗(yàn)組為終止妊娠前達(dá)到出院標(biāo)準(zhǔn)，需在恢復(fù)期終止妊娠，采血時(shí)間為終止妊娠前;對(duì)照組為達(dá)到出院標(biāo)準(zhǔn)的未妊娠女性患者，采血時(shí)間為出院前。

1.3 儀器及主要試劑 流式細(xì)胞儀(BD公司，F(xiàn)ACS Calibur)及CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD45RA、CD62L、TCR γδ檢測試劑(流式細(xì)胞法-FITC/PE/PerCP/APC)。

1.4 方法 臨床數(shù)據(jù)收集，包括鼻咽拭子核酸，細(xì)胞因子六項(xiàng)(IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α，IFN-γ6)，淋巴細(xì)胞亞群分析(比例)。此外，行淋巴細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù)的3組對(duì)象均清晨空腹抽取靜脈血2ml，EDTA抗凝。應(yīng)用熒光直接標(biāo)記法及流式細(xì)胞儀檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群：CD3+(T淋巴細(xì)胞總體比例)，B淋巴細(xì)胞(CD19+)，NK細(xì)胞(CD3-CD56+)，NKT細(xì)胞(CD3+CD56+)，γδ T細(xì)胞(TCRγδ+)，中樞記憶性T細(xì)胞[CM，EMRA(CD62L-/CD45RA+)];幼稚T細(xì)胞(NAIVE，CD62L+/CD45RA+)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件，采用兩組間獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 COVID-19感染未妊娠與晚期妊娠女性恢復(fù)期外周淋巴細(xì)胞亞群比例及細(xì)胞因子 COVID-19感染未妊娠與晚期妊娠女性的病毒轉(zhuǎn)陰天數(shù)和住院天數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。兩組的外周淋巴細(xì)胞亞群比例(CD3+總T淋巴細(xì)胞、CD4+淋巴細(xì)胞、CD8+淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK淋巴細(xì)胞比值、CD4+T/CD8+T)以及細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 COVID-19感染未妊娠與晚期妊娠女性恢復(fù)期外周淋巴細(xì)胞亞群比例及細(xì)胞因子測定

2.2 COVID-19未妊娠與晚期妊娠女性恢復(fù)期外周血淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值對(duì)比分析 取3對(duì)COVID-19感染未妊娠與晚期妊娠女性恢復(fù)期外周血淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值對(duì)比分析。結(jié)果顯示，晚期妊娠女性的自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells,NK)數(shù)顯著低于未妊娠女性(P=0.005)，晚期妊娠女性的自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cells,NKT)高于未妊娠女性(P=0.015);兩組的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及γδT細(xì)胞均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1)。

圖1 COVID-19未妊娠與晚期妊娠女性恢復(fù)期外周血淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值對(duì)比分析A：CD3+T細(xì)胞;B：CD4+T細(xì)胞;C：CD8+T細(xì)胞;D：γδ T細(xì)胞;E:NK細(xì)胞;F:NKT細(xì)胞

2.3 COVID-19感染恢復(fù)期未妊娠與晚期妊娠女性外周血淋巴細(xì)胞CD4+T及CD8+T細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù) 兩組的CD4+T及CD8+T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)(CM、EM、EMRA、NAIVE)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。兩組的CD4+及CD8+的亞群比例比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 未妊娠組與晚期妊娠組COVID-19感染恢復(fù)期

3 討 論

妊娠時(shí)女性處于一種特殊的免疫耐受狀態(tài)，為了防止妊娠期間的胎兒排斥反應(yīng)，需對(duì)胎兒免疫耐受;同時(shí)，母體免疫系統(tǒng)保護(hù)胎兒免受有害的內(nèi)源性和外源性抗原的影響，包括與病毒和細(xì)菌感染有關(guān)的抗原。正常妊娠期，通過抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫而促進(jìn)母體環(huán)境對(duì)胎兒的維持[5],大多數(shù)細(xì)胞因子水平降低，特別是在妊娠最初的20周。妊娠早期外周血CD4+細(xì)胞亞群隨著HCG上升而下降，孕10～40+周CD4+細(xì)胞逐漸回升[6]。正常妊娠中晚期孕婦與未孕婦女比較，外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞減少，CD8+T淋巴細(xì)胞基本不變，NK細(xì)胞有一定程度的下降[7]。目前還不清楚這種被抑制的免疫系統(tǒng)是否轉(zhuǎn)化為妊娠期間感染風(fēng)險(xiǎn)的增加。

COVID-19感染者的淋巴細(xì)胞比例和數(shù)量減少，尤以CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)顯著減少為主，部分患者炎性細(xì)胞因子，如IL-6表達(dá)上調(diào)等[8]。本研究顯示，COVID-19感染恢復(fù)期晚期妊娠孕婦與同齡未妊娠女性的T淋巴細(xì)胞數(shù)量、比例，CD4、CD8亞型計(jì)數(shù)及比例，細(xì)胞因子六項(xiàng)比較，均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞均為異質(zhì)性細(xì)胞群，可分為中樞記憶T細(xì)胞(CM)，效應(yīng)記憶T細(xì)胞(EM)，終末效應(yīng)T細(xì)胞(EMRA)，幼稚T細(xì)胞(NAIVE)。本研究顯示，CM、EM、EMRA、NAIVE在COVID-19感染后女性中，其變化與妊娠無相關(guān)性。

本研究結(jié)合武漢同濟(jì)醫(yī)院[2]及武漢市婦幼保健院[9]的研究，均沒有孕產(chǎn)婦死亡報(bào)道，且孕產(chǎn)婦預(yù)后均良好。有專家認(rèn)為，COVID-19患者病情突然加重，快速出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征和多器官功能衰竭可能與“炎癥因子風(fēng)暴”相關(guān)，患者血漿中IL-2、IL-7、IL-10、G-CSF、IP-10、MCP-1、MIP-1A和TNF-α顯著升高[10]。肺部免疫細(xì)胞處于過度活化狀態(tài)，大量免疫細(xì)胞的浸潤和組織液的聚集會(huì)阻塞肺泡與毛細(xì)血管之間的氣體交換，從而導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[11]。妊娠女性呈免疫抑制狀態(tài)，免疫細(xì)胞難以過度活化，故而炎癥因子風(fēng)暴相對(duì)弱，ARDS出現(xiàn)情況少見。妊娠時(shí)期特殊的免疫狀態(tài)，可能讓妊娠女性處于輕型及普通型，避免了向重型及危重型轉(zhuǎn)變。華中科技大學(xué)團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，重癥患者的多種細(xì)胞因子僅在某一段時(shí)間內(nèi)有顯著上升，而在其他時(shí)間段與輕癥組無明顯差異[8]。本研究針對(duì)的是恢復(fù)期病例，可能其細(xì)胞因子的改變發(fā)生于發(fā)病早期，而恢復(fù)期患者的細(xì)胞因子已處于基本正常水平。本研究中單獨(dú)恢復(fù)期的兩組間細(xì)胞因子的比較無明顯差異，與以上研究相符。

無論對(duì)于妊娠或非妊娠女性，盡早了解患者急性期的細(xì)胞因子狀態(tài)，及早進(jìn)行相關(guān)的免疫治療，可能避免輕型和普通型發(fā)展成為重型或危重型。此結(jié)論還需更多的妊娠女性COVID-19急性期相關(guān)研究。本研究進(jìn)一步結(jié)果顯示，COVID-19感染后恢復(fù)期晚期妊娠與同齡女性比較，T淋巴細(xì)胞亞群無明顯差異，NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)減少，NKT細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)增加。NK細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)，無需抗原預(yù)先致敏就能殺傷靶細(xì)胞。COVID-19感染患者較未感染者，NK細(xì)胞顯著下降[12]，考慮原因：(1)患者本身存在免疫功能缺陷(孕婦本身NK水平相對(duì)低);(2)NK細(xì)胞對(duì)抗病毒發(fā)生消耗，未能得到及時(shí)補(bǔ)充;(3)病毒感染機(jī)體后，侵犯免疫系統(tǒng)，破壞NK細(xì)胞或抑制NK細(xì)胞的生成[12]。隨著研究深入，NK細(xì)胞在適應(yīng)性免疫中作用不斷展現(xiàn)，在一定情況下具有抑制病毒特異性T細(xì)胞的抗病毒作用。

NKT細(xì)胞是一群不同尋常的T淋巴細(xì)胞，活化的NKT細(xì)胞具有介導(dǎo)天然免疫和特異性免疫應(yīng)答的功能，直接或間接參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，發(fā)揮殺傷活性。一方面，NKT細(xì)胞活化可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，參與抗感染;另一方面，可活化其他淋巴細(xì)胞，參與抗感染。在病毒性肝炎的研究中，如NKT細(xì)胞或CD1d缺失，或者CD1d遞呈脂類抗原缺陷，HBV特異性的T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答都會(huì)消失，病毒清除延遲。且胸腺肽α-1可富集NKT細(xì)胞，幫助清除感染病毒的細(xì)胞。然而，NKT在COVID-19中的角色不明，未見相關(guān)報(bào)道。

以往認(rèn)為,孕婦抵抗力低，即對(duì)病毒的清除能力弱，病程時(shí)間較長。本研究中，COVID-19感染晚期妊娠女性與同齡女性的SARS-CoV-2的轉(zhuǎn)陰時(shí)間、住院時(shí)間無明顯差異，且住院時(shí)間包括晚期妊娠終止妊娠后恢復(fù)的時(shí)間。表明妊娠對(duì)于COVID-19來說并無劣勢(shì)，但孕產(chǎn)婦的心理狀態(tài)是否對(duì)病情的恢復(fù)有影響[13]，有待進(jìn)一步研究。本研究顯示，較COVID-19感染的非妊娠女性，COVID-19感染晚期妊娠NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)減少，NKT增加，但其是否改變了對(duì)病毒的清除能力，以及COVID-19對(duì)子代的影響，尚需進(jìn)一步探討。目前針對(duì)COVID-19無特效藥物，中西醫(yī)均給予免疫調(diào)節(jié)抗病毒藥物[14]。最近研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植改善COVID-2019患者的預(yù)后可能是通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[15]和促進(jìn)組織修復(fù)與再生。故針對(duì)性免疫治療可進(jìn)一步了解是否對(duì)NK及NKT細(xì)胞有調(diào)節(jié)，為后續(xù)治療機(jī)制和臨床用藥提供一定的參考。

妊娠合并COVID-19感染的危重癥人數(shù)相對(duì)少，可能是因早期發(fā)病時(shí)免疫功能抑制而表現(xiàn)為細(xì)胞因子風(fēng)暴弱，故表現(xiàn)為輕癥及普通型較多，危重癥少。妊娠合并COVID-19感染者對(duì)病毒的清除能力與同齡女性無明顯差異，是否得益于NK細(xì)胞減少的基礎(chǔ)上，繼發(fā)NKT細(xì)胞的增加，需后續(xù)進(jìn)一步研究。本研究僅針對(duì)恢復(fù)期患者免疫功能的研究，存在一定的偏差，不能代表急性期免疫應(yīng)答的情況。本研究樣本量少，屬于回顧性研究,且因病例數(shù)限制，未進(jìn)行不同孕周的淋巴細(xì)胞亞群的比較。